课件：血液分子生物学基因治疗.ppt

基因治疗 Gene Therapy,p498,本章内容提示,基因治疗 (gene therapy) 体细胞基因治疗、生殖细胞基因治疗 基因转移方法 靶细胞特点、靶细胞种类 反义寡核苷酸技术 自杀基因与旁观者效应,基因治疗（Gene therapy ）,基因治疗（Gene therapy ） ：指应用DNA重组技术，将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗的目的。,为达到这一目的，实施相应的策略。,一、基因治疗策略 策略：直接基因治疗和间接基因治疗 1、直接基因治疗：纠正突变基因 在原位修复缺陷的基因，以达到治疗目的。为较理想的基因治疗策略，由于存在某些问题，目前正在努力之中。（未实现）,2、间接疗法： 以正常的基因替代致病基因。 导入外源正常基因，代替有缺陷的基因,使细胞恢复正常功能而达到治疗疾病（尤其是遗传病）的目的。 而对靶细胞而言，没有去除或修复有缺陷的基因。,途 径,就基因转移的受体细胞不同， 基因治疗有两种途径： 1、生殖细胞基因治疗 2、体细胞基因治疗,1、生殖细胞基因治疗,将正常基因转移到患者生殖细胞（精细胞，卵细胞，早期胚胎）使其发育成正常个体。为理想的治疗方法，从根本上治疗遗传病，使其有害基因不能在人群中散播。,但还存在某些问题：,（1）靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展； （2）基因转移效率不高，只能用显微注射方法； （3）只适用于排卵周期短而次数多的动物，很难适用于人类。 （但目前辅助生殖技术的发展较为有效的解决了获取卵细胞的办法。一次可获取少者3-5个，多者十几个。）,2体细胞基因治疗 somatic cell gene therapy,将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗的目的。但有害基因能遗传给后代。,措 施：,（1）正常基因转移至体外培养的体细胞，有效 表达后，再回输到体内。 （2）正常基因导入靶细胞，定位整合到染色体 上，准确的替换异常基因，是理想的措施。 （3）随机整合，非特定座位，只要有效的表达 即可达到治疗的目的。 （4）体细胞基因治疗理论上不必矫正所有的体 细胞。,存在的问题,对特定座位基因转移，目前还存在较大困难； 随机插入可能引起后代的基因突变。,二 、基因治疗的方法,基因治疗的关键性步骤- 目的基因的获得与转移,基因治疗首先获得目的基因，通常从基因组中分离 基因克隆 定 位 表 达 评价表达情况,（一）目的基因的获得 正常基因的分离与克隆,（二）外源基因的转移,通过不同方法，将目的基因转移至受体细胞。,（1）物理方法,1）电穿孔法（electroporotion）将细胞置于高压脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿孔。周围基质中的DNA可渗进细胞，进而表达。 瞬间 细胞 细胞膜核膜通透性增加 高压脉冲 DNA渗入细胞,2）显微注射法（microinjection ）,利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞,常用的细胞 （1）受精卵：受精卵基因操作注射假孕动物子宫胚胎个体。 （2） 胚胎干细胞：从着床前的动物胚胎中分离多功能胚胎干细胞 基因操作注射入动物囊胚形成嵌合体胚胎嵌合个体。,用显微注射仪将外源基因直接注射入实验动物受精卵中，利用外源基因整合到DNA中，从而得到转基因动物。 特点：导入速度快，操作步骤不复杂，对DNA大小无限制，不需要载体，整合效率较高，它可以直接获得纯系。 缺点：需要贵重精密仪器，技术操作较难，并且外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致死。,例：转基因动物的制备,重组基因 DNA 微注射 （体外） 小鼠受精卵 回植 假妊娠 仔 鼠 动物模型：转基因鼠 (每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传),clone sheep Dolly 体细胞 提取 核 重组细胞 回植 Dolly 卵细胞 去核 细胞,转基因动物研究大事记 1974年，美国学者Jaenisch应用显微镜注射法把基因导 入真核细胞。 1981年，美国科学家将外源基因导入动物胚胎，创立了转基因动物技术。 1982年获得转基因小鼠。 1987年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英国著名的罗斯林研究所诞生。这只转基因母羊的乳汁中可以分泌抗胰蛋白酶。,3）微粒子轰击法,利用亚微粒的钨和金能吸附DNA，并将其包裹起来形成微粒，通过物理途径使微粒瞬间既可进入靶细胞，达到转移目的基因的目的，而不损伤靶细胞。 该方法可使目的基因在皮肤、肝、胰、胃及乳腺等细胞中表达。,（2）化学法,磷酸钙沉淀法： 目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA 微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受 体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。,磷酸钙+DNA 混合微细颗粒 沉淀反应2030min 细胞在沉淀物中暴露 524h 方法简单，但转化效率低。,（3）脂质体法（liposome）,应用人工制备的类似细胞膜的膜性结构脂质体，包装外源基因，再与靶细胞融合，外源DNA导入靶细胞，使其表达。 DNA 细胞融合 转化细胞 PEG 仙苔病毒,DNA,脂膜,（4）同源重组法,同源重组（homologus recombination）:外源基因和染色体上的基因在同源序列间发生重组而插入染色体。 是将外源基因定位导入细胞的染色体上。 单交换 双交换,通过同源重组定点插入珠蛋白基因,Xba I,BstXI,Xba I,neo,XbaI,BstXI,neo,正常基因座位,带有珠蛋白基因的质粒,C,重组后，插入外源基因片段带有neo基因（新霉素抗性基因），重组后的细胞在含有neo 的培养基中生长，没有插入新基因的细胞死亡，将有重组的细胞筛选出来。,（5）病毒介导基因内转移（Viral mediated transfer）,是通过病毒为载体（vector），将外源基因通过重组技术与病毒重组，然后去感染受体细胞,感染细胞,重组病毒,病毒载体,病毒具有一些独特的性质如多数病毒可感染特异的细胞，在细胞内不易降解； RNA病毒能整合到染色体以及基因表达水平较高等。因此病毒载体是良好的基因转运载体； 目前已被用作载体的病毒有逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和肝炎病毒等。,病毒的分类（1995年） * DNA病毒 * RNA病毒 * 逆转录病毒 病毒的增殖（复制） * 吸附与穿入：细胞膜表面的特异性受体。 * 脱壳：溶菌酶作用下，病毒体释放出基因组核酸。 * 生物合成：病毒核酸的复制及蛋白质的合成。 * 转配与释放：复制出子代病毒的核酸与蛋白质， 在细 胞内装配为成熟的病毒体；并从宿主细胞释放。,逆转录病毒(RNA) 常用的病毒载体 DNA病毒 1) 逆转录病毒（retrovirus） 目前应用最多、最成功. 病毒感染细胞后，其基因组RNA 经逆转录产生双链DNA拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（provirus），前病毒转录产生的正链既是病毒RNA，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。,例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因组结构：,LTR LTR gag pol env U3 R U5 U3 R U5 U3=增强子，R=启动子，U5=转录起始位点。 =病毒包装信号， gag =核心抗原， pol=逆转录酶， env=外壳蛋白。,逆转录病毒载体构建的技术路线 * gag, pol, env 序列去除，保留LTR 和， 使 逆转录病毒成为无复制能力的缺陷病毒。 * 在gag,pol,env 序列去除的区域，插入目的基因 序列和报告基因序列（如GFP)。 * 将目的基因、其两端的LTR 以及这一序列插入 经改造的质粒内。 * 将gag-pol 序列插入经改造的质粒 * 将env序列插入经改造的质粒,质粒 * 是位于细菌内的双链、闭环的DNA 分 子，独立于细菌染色体之外进行复制和 遗传的辅助性遗传单位。 * 他们又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来 进行复制和转录。 * 质粒产生的表型包括对抗生素的抗性、 产抗生素、降解复杂有机化合物等。,ori 5LTR 目的基因 标记基因 3LTR 抗生素基因,逆转录病毒载体优点：,高效感染宿主细胞，转染率可达100% 病毒基因和所载的外源基因都可能表达 宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留,缺 点,病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段； 病毒随机插入靶细胞基因组中，因病毒具有强大的启动子和增强子，能使插入点附近的基因过度表达或失活，插入的 外源基因可能不适当的表达；,逆转录病毒有致癌作用，可能使受体细胞癌变。 根据逆转录病毒的缺点，人们有目的地将其改造，保留其优点，除去癌基因和病毒基因，保留LTR和包装信号。,（6）受体载体转移法,将含有目的基因的重组质粒和某些细胞表面受体能识别的特异性多肽（配体）形成复合物，通过细胞内吞途径达到转移基因的目的。,重组质粒,配体,细胞膜,复合物,（三）靶细胞的选择,靶细胞是指接受外源Gene的体细胞 选择靶细胞的原则是： 1）便于体外培养和进行遗传技术操作； 2）易于由人体分离又便于输回体内； 3）具有增殖优势，生命周期长（能存活几月至 几年，或整个生命周期）； 4）易于受外源遗传物质转化。,常见的靶细胞,外周血T淋巴细胞 上皮细胞 内皮 皮肤成纤维细胞 造血干细胞地中海贫血、严重 复合免疫缺陷病等基因治疗 肝细胞家族性高胆固醇血症、低密度 脂蛋白病的基因治疗 肌细胞,三、基因治疗的现状与前景,体细胞基因治疗临床实验已经开始，生殖细胞基因治疗正在完善。进行基因治疗必须具备下列条件：,具备下列条件,选择适当的疾病，清楚疾病的发病机理，基因的结构和功能。 目的基因已克隆，并清楚基因表达与调控机制与条件。 选择适当的受体细胞并在体外有效表达。 安全有效的基因转移方法，以及供利用的动物模型。,基因治疗实例,1、复合免疫缺陷综合征的基因治疗 （人类Gene治疗成功例子） ADA缺乏症-致死性疾病，患者由于腺苷酸脱氨酶（ADA）缺乏。,ADA-Gene + vector （逆转录病毒） 重组分子 患者T Ly C IL-2刺激C分裂 导入 细胞生长分裂 10天 Gene表达 回输患儿体内 12月治疗一次, 10个月 患儿体内ADA水平达正常人的25%,2、乙型血友病,XR ，患者凝血因子缺乏，因子基因定位在Xq26.3q27.2。临床表现，易出血，凝血时间长，轻伤、小手术后常出血不止。发病率为1/30000。 例如：我国学者薛京伦实施的F的基因治疗。,逆转录病毒载体 +FcDNA 重组体 5 LTR F neo SV PSO LTR 3 导入仓鼠细胞（CHO ）F表达； 导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）F表达； 91年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）回植病人皮下F基因表达，F基表达水平达正常人的5%。 是我国基因治疗成功的例子。,3、黑色素瘤的基因治疗,肿瘤基因治疗是人们十分关注的问题，进行了广泛的探索。研究发现，肿瘤浸润淋巴细胞TIL，它积聚肿瘤部位，并在该处持续存在而无副作用，利用此特点协助治疗肿瘤。,例：细胞因子基因治疗和肿瘤坏死因子基因治疗,IL-2 Gene TNF-Gene （白介2） （肿瘤坏死因子） 逆转录病毒载体 导入 TIL（体外培养的自体细胞） 回植患者体内 TIL进入自体肿瘤部位，提高细胞因子杀伤肿瘤细胞 的作用。,4、自杀基因的基因治疗 X,原理：即用（逆转录）病毒载体将编码某种酶的基因（自杀基因）转染到肿瘤细胞中，此酶可将一种无害的药物前体转变为细胞毒复合物，进而杀伤肿瘤细胞（肿瘤细胞不能复制而死亡）。这种基因载体只能在特定的组织或肿瘤中表达，而正常细胞中不表达。,自杀基因(suicide gene)是一类前体药物转换酶基因，其编码的特异性酶类将原先对细胞无毒或毒性极低的前体药物在肿瘤细胞内代谢成毒性产物，从而达到杀死肿瘤细胞的目的。 目前研究过的自杀基因有十余种，最常用的是HSV-TK/GCV和CD/5-FC两种自杀基因系统。,4、自杀基因的基因治疗,如： 自杀基因 + 病毒载体 转染 重组载体,药物前体 无毒 Gene酶 药物复合物 有毒,细胞死亡,例如： 单纯疱疹病毒 哺乳动物细胞 HSV Gene-TK （在肿瘤细胞中表达，正常细胞中不表达） GeneTK GCV（胸苷类似物） TdR P p GCV-p 抑制DNA合成 脱氧胸苷酸 肿瘤细胞死亡 邻近细胞死亡/凋亡（旁观者效应）,5、反义核酸基因治疗,反义技术：是指利用人工合成的反义RNA或DNA导入靶细胞，阻断Gene的转录或复制，控制细胞的中间阶段使编码蛋白的Gene不能转录为mRNA 或阻断翻译相应蛋白.,反义基因治疗,DNA DNA RNA RNA 反义RNA 阻断表达,四、 基因治疗存在的问题与论理学,基因 治疗的研究与实践中存在若干重要问题，所以更多的是处于研究阶段，临床应用还有待深入。,一）导入基因的持续性和高效表