抗体酶核酶极端酶.ppt

第八章 抗体酶 核酶 极端酶,第一节 抗体酶（Abzyme),一、抗体酶的理论基础 抗体蛋白的特性： 抗体（antibody）： 抗原（antigen）： 半抗原（hapten）：,IgG的三级结构,IgG与抗原形成 的交联晶格,抗体与酶的异同： 相同点：都是蛋白质，都有特异性。 不同点： 1）抗体无催化活力，酶有催化活力。 2）本质差别：酶是能与反应过渡态选择结合的催化物质，抗体是和基态紧密结合的物质。 3）酶的活性和合成受到代谢调节，种类有限。 抗体只有在抗原存在时才产生，种类无限。,2.酶与底物形成过渡态理论 酶的催化在于能结合底物产生过渡态，降低能障（反应的活化能）。 以过渡态类似物作为半抗原，诱导与其互补构象的抗体，使其具有催化活性，可观察到抗体催化相应底物发生化学反应。,二、抗体酶的定义 抗体酶又称催化抗体（catalytic antibody），是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性。,三、抗体酶的制备 1. 诱导法 用设计好的半抗原，通过与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原。然后对动物进行免疫，取免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞杂交，杂交细胞则分泌单克隆抗体，经筛选和纯化，得抗体酶。,2. 拷贝法 用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，获得具有原来酶活性的抗体酶。,四、抗体酶的应用 1.戒毒: 用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸单酯为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，水解后的可卡因片断失去可卡因刺激功能。,2. 肿瘤治疗 抗体介导前药治疗技术:将能水解前药释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，则酶通过和肿瘤结合的抗体存在于细胞的表面。静脉给药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附近，抗体酶将前药迅速水解释放出抗肿瘤药物。,第二节 核 酶（Ribozyme),一、核酶的概念 二、核酶的种类 三、核酶的应用 四、核酶面临的问题 五、影响核酶活性的因素,具有生物催化功能的RNA。,一、核酶的概念,克隆酶 遗传修饰酶 蛋白质工程新酶 、,Ribozyme,Deoxyribozyme,I型内含子 剪接型核酶 II型内含子 锤头核酶 剪切型核酶 发夹核酶 自体催化 丁型肝炎病毒（HDV)核酶 RNaseP 异体催化,二、核酶的分类,1.剪接型核酶,剪接型核酶的作用机制是通过既剪又接的方式除去内含子（Intron)。,1）I类内含子的自我剪接(Self-splicing),I型IVS是与四膜虫26srRNA前体的IVS结构相似的间隔序列，具有环状结构。通过转磷酸酯反应，生成成熟的26srRNA及G-IVS，G-IVS经两次环化生成L-19IVS。催化过程需要鸟苷酸或鸟苷以及镁离子参与。 剪接机制 L-19IVS在体外的多种酶活性,p,3 HO-G,p,3,p,P-G,OH,p,P-G,3 HO,类内含子的剪接机制,Mg 2+或Mn 2+,GMP,GDP,GTP,外显子,内含子或居间序列（Intervening sequence,IVS),5,UCUAAA,IVS,GUAA,Pre-rRNA,UCU,A A A,GUAA,UCUoH3,5GAAA,GUAA,UCUUAA,5GAAA,GOH 3 G-IVS,L-19IVS,19nt,5,3,rRNA,5,3,5,pGOH,3,5,3,四膜虫rRNA前体自我剪接反应,1、转核苷酸作用 2CpCpCpCpC CpCpCpCpCpC +CpCpCpC 2、水解作用 CpCpCpCpC CpCpCpC + pC 3、转磷酸作用 CpCpCpCpCpCp+UpCpU CpCpCpCpCpC + UpCpUp 4、去磷酸作用 CpCpCpCpCp CpCpCpCpC +Pi 5、限制性内切酶作用 CpUpCpUpN +G CpUpCpU +GpN,2）类内含子的自我剪接,型IVS是与细胞核mRNA前体的IVS结构相似的间隔序列。通过转磷酸酯反应，生成成熟的RNA及套环状的IVS。催化的剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参加，但仍需要镁离子(Mg2+)。 剪接机制,p,2 HO-A,p,p-A,p,3 OH,p,P-A,HO 3,类内含子的剪接机制,Mg 2+,套环的形成,5,3,外显子连接,2.剪切型核酶 这类RNA进行自身催化的反应是只切不接。 1）自体催化剪切型 剪切机制,转酯化过程： 由靠近切割位点3端的2OH或氧原子对切割位点的磷原子实施亲核攻击，产生5-OH 和2，3-环磷酸二酯。,剪 切 机 制,核酶自身剪切反应,锤头型核酶的二级结构 和空间立体结构示意图,三个双螺旋区。 13个核苷酸残基保守序列。 剪切反应在右上方GUX序列的3端自动发生。,发夹（hairpin ）结构,1989年汉普（Hample）研究烟草环斑病毒（sTRSV）的负链RNA的自我剪切反应，提出发夹结构（hairpin structure）模型。 发夹核酶结构模型,四个螺旋区、三个连接区和两个环。 剪切反应发生在底物识别序列GUC的5端。,5,3,发夹二级结构模型,剪切位点,2) 异体催化剪切型 核糖核酸酶P(RNaseP)是内切核酸酶，是核糖核蛋白体复合物，能剪切所有tRNA前体的5端，除去多余的序列，形成3-OH 和 5-磷酸末端。 RNaseP由M1RNA和蛋白质亚基组成。,三、核酶的应用,1. 基础理论：生命起源的探索 2. 医药： 1）通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高，专一性强。如抗肝炎病毒、抗人类免疫缺陷病毒型（HIV- )、抗肿瘤。 2）免疫原性低，很少引起免疫反应。 3. 植物抗病毒,四、核酶面临的问题,1、核酶催化效率低。 2、核酶本身是RNA，很容易被核酸水解酶 RNase破坏。,五、影响核酶活性的因素,1、pH值对活性的影响： pH7.0- 7.5时核酶活性最高。 2、二价金属阳离子对活性的影响: Mg2+ Mn2+ 3、抗生素对活性的影响：大多数为抑制效应 4、变性剂对活性的影响: 5、温度对活性的影响:,第三节 极端酶（extremozyme） 一、极端微生物和极端酶 1.极端微生物： 又称嗜极菌（extremophiles），是在超常生态环境条件下生存的微生物。,根据所耐受的环境条件不同，分为： 嗜热菌（thermophiles） 超嗜热菌（hyperthermophiles） 嗜冷菌（psychrophiles） 嗜盐菌（halophiles） 嗜酸菌（acidophiles） 嗜碱菌（alk