发酵培养基灭菌.ppt

1,第三章 发酵工业原料及其处理,第一节 培养基的成分及来源 第二节 培养基的类型及选择 第三节 淀粉水解糖的制备 第四节 发酵培养基灭菌,2,1、培养基如何分类？ 在发酵生产中常用的固体还是液体培养基？ 2、说说培养基的六大营养要素？,复习,根据培养基的用途(特殊用途)不同，可将培养基分成：孢子种子发酵 增殖、选择和鉴别培养基,根据培养基状态不同，可将培养基分成： 固体、液体和半固体培养基,根据营养物质的来源不同，培养基可分为： 天然培养基、合成培养基和半合成培养基,3,1、由于杂菌的污染，使生物反应中的基质或产物因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降； 2、由于杂菌所产生的一些代谢产物，或在染菌后改变了培养液的某些理化性质，使产物 的提取和分离变得困难，造成收率降低或使产品的质量下降； 3、杂菌会大量繁殖，会改变反应介质的PH值，从而使生物反应发生异常变化； 4、杂菌可能会分解产物，从而使生产过程失败； 5、发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产失败，等等,在发酵生产中，为什么要进行灭菌操作？,问题1,4,为防止杂菌的污染，整个生化生产过程哪些 需要注意灭菌？,培养基、发酵设备、空气、菌种制作,问题2,灭菌的定义 灭菌利用物理和化学的方法杀灭或除去物料及设备中一切生命物质的过程。 消毒是指用物理或化学的方法杀死物料、容器、器具内外的病源微生物，一般只能杀死营养细胞而不能杀死芽孢。,5,发酵培养基灭菌,一、灭菌的原理和方法 二、湿热灭菌原理 三、培养基的湿热灭菌方式 四、灭菌时间计算与影响因素,6,消毒与灭菌在发酵工业中均有广泛应用。 消毒是指用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病源微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。例如，用于消牛奶、啤酒和酿酒原汁等的巴氏消毒法，是将物料加热至60维持30min，以杀死不耐高温的物料中的微生物营养细胞。 灭菌是用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。 消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到消毒的目的,消毒与灭菌的区别,7,一、灭菌的原理和方法,（一）化学试剂灭菌法,（二）射线灭菌法,（三）干热灭菌法,化学试剂：甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等 适用范围：环境空气、皮肤及器械的表面消毒,电磁波、紫外线或放射性物质 适用范围：无菌室、接种箱,常用烘箱，灭菌条件为在160下保温1h 适用范围：金属或玻璃器皿,8,常用化学消毒剂及其使用方法,9,. 电磁波、射线灭菌法.,原理：利用高能电磁波、紫外线或放射性物质产生的高能粒子可以起到灭菌的作用。 波长在(2.1-3.1) 10-7 m的紫外线 表面或空气灭菌。 波长在(0.06-1.4) 10-7 m的 X 射线/射线(Co60) 在 工业上还少采用。,穿透力差,设备投资高,10,（四）湿热灭菌法,（五）过滤除菌法,（六）火焰灭菌法,利用饱和蒸汽进行灭菌、条件为：121，30min 。由于蒸汽有很强的穿透力，冷凝时放出大量的潜热，来源方便，价格低廉，灭菌效果好，是目前最基本的适合培养基和设备的灭菌方法。 适用范围：广泛应用于生产设备及培养基的灭菌 。例：高压灭菌锅,利用过滤方法阻留微生物 适用范围：制备无菌空气,酒精灯火焰 。方法简单、灭菌彻底，但适用范围有限 适用范围：接种针、玻璃棒、 三角瓶口,11,接种针、试管口 皮肤表面 无菌室、接种箱 培养基的灭菌 空气,过滤除菌法 火焰灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学试剂灭菌法,营养细胞、芽孢、病毒或孢子？,比较各种微生物对热的抵抗能力大小,灭菌方法连线题,12,二、湿热灭菌原理,湿热灭菌原理,灭菌条件,灭菌不利方面,同时也会破坏培养基中的营养成分，甚至会产生不利于菌体生长的物质。因此，在工业培养过程中，除了尽可能杀死培养基中的杂菌外，还要尽可能减少培养基中营养成分的损失 。,由于蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝时会放出大量的冷凝热(潜热) ，很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。,121，30min。,13,1、衡量热灭菌指标,致死温度：杀死微生物的极限温度。 致死时间：在此温度下，杀死全部微生物所需要的时间。 热阻：对热的抵抗力，指微生物在某一特定条件 （主要是温度和加热方式）下的致死时间。 相对热阻：几种微生物对热的相对抵抗能力。指微生物在 某一特定条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的 致死时间的比值。,14,微生物对热的抵抗力称为热阻（heat resistance）,15,某些微生物的相对热阻。,说说芽孢或孢子的热阻要比营养细胞的热阻大的原因？,从表中可看出,16,芽孢或孢子的热阻要比生长 期营养细胞的热阻大得多， 这是由于芽孢或孢子内吡啶 二羧酸含量对热阻的增加有关。 另外，芽孢子中蛋白质含水 量较营养细胞低（特别是游 离水分少），也是芽孢耐热 强的一个原因。图FS7954芽 孢杆菌的芽孢在不同温度下 的死亡情况。,嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同温度下的死亡曲线,17,微生物的热死规律和影响灭菌的因素,在发酵工业中，对培养基和发酵设备的灭菌，广泛使用湿热灭菌法。工厂里，蒸汽比较容易获得，控制操作条件方便，是一种简单而又价廉、有效的灭菌方法。用湿热灭菌的方法处理培养基，其加热受热时间与灭菌程度和营养成分的破坏都有关系。营养成分的减少将影响菌种的培养和产物的生成，所以灭菌程度和营养成分的破坏成为灭菌工作中的主要矛盾，恰当掌握加热受热时间是灭菌工作的关键。,受热时间如何确定？,18,1、 微生物的死亡速率：对数残留定律,微生物受热死亡的原因，主要是因高温使微生物体内的一些重要蛋白质，如酶等，发生凝固、变性，从而导致微生物无法生存而死亡。微生物受热而丧失活力，但其物理性质不变。,19,在一定温度下，微生物的受热死亡遵照分子反应速度理论。在灭菌过程中，微生物的死亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比,对数残留定律。,数学表达式：,- dN/d = N,N ：培养基中活的微生物个数； ：时间（s）; ：比死亡速率（s-1） (死亡速率常数) dN/d ： 微生物的瞬间变化率，即死亡速率,20,若开始灭菌（ = 0）时，培养基中活的微生物数为N0, =( 2.303 logN0/N )/,- dN/d = N,lnN/N0 = - ,积分,2.303logN0/N = ,or,21,各种微生物在同样的温度下K值是不同的，K值愈小，则此微生物愈耐热。 在121度，枯草杆菌FS5230的K为0.047s-1，梭状芽孢杆菌PA3679的K值为0.03 s-1 ，请问哪一种微生物更耐热?,上式是计算灭菌的基本公式，灭菌速度常数K是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据。, = (2.303 logN0/N) /,22,可见灭菌时间取决于污染程度(N0)、灭菌程度（残留菌数N）和值,在培养基中有各种各样的微生物，不可能逐一加以考虑。一般只考虑芽孢细菌和细菌的芽孢数之和作为计算依据。 灭菌程度，即残留菌数，如果要求完全彻底灭菌，即N = 0，则 为，上式无意义，事实上也不可能。 一般取N = 0.001，即1000次灭菌中有1 次失败。, = (2.303 logN0/N) /,23,例：有一发酵罐内装40m3培养基，在121温度下进行实罐灭菌。 原污染程度为每1mL有2*105个耐热细菌芽孢，121度时灭菌速 度常数为1.8min-1。求灭菌失败机率为0.001时所需要的灭菌 时间。,解： N0=40 106 2 105=8 1012（个） Ns=0.001（个） K= 1.8min-1,24,连续灭菌（连消）,连续灭菌的灭菌时间，仍可用灭菌公式计算，但培养基中的含菌数，应改为每单位体积(1mL)培养基的含菌数，则灭菌公式变换为下式,式中 c0单位体积培养基灭菌前的含菌数，个mL ; cs单位体积培养基灭菌后的含菌数，个mL。,25,【例】若将上例中的培养基采用连续灭菌，灭菌温度为131，此温度下灭菌速率常数为15min-1，求灭菌所需的维持时间。 解,26,2、灭菌的温度和时间,上面说过，当培养基被加热灭菌时，常会出现这样的矛盾，这就是，加热时，微生物固然会被杀死，但培养基中的有用成分也会随之遭到破坏，那么有何良策可以既达到灭菌要求，同时又不破坏或尽可能少破坏培养基中的有用成分呢？ 实践证明，在高压加热的情况下，培养基中的氨基酸和维生素极易被破坏，如在121，仅20min，就有59%的赖氨酸和精氨酸及其他碱性氨基酸被破坏，蛋氨酸和色氨酸也有相当数量被破坏。因此，必须选择一个既能满足灭菌需要，又可使培养基的破坏尽可能养活的灭菌工艺条件。,27,微生物的受热死亡属于单分子反应，其灭菌速率 常数K与温度之间的关系可用阿累尼乌斯公式表示：,K灭菌速度常数（s-1），也称反应速度常数或比死亡速度常数.,A 比例常数 E 杀死细菌所需的活化能，(E) （4.18 J/mol） T 绝对温度，(K) R 气体常数，1.9784.18 J/(molK) e 2.71 (exp),28,A 比例常数； E 分解活化能，(E) （4.18 J/mol）; T 绝对温度，(K) R 气体常数，1.9784.18 J/(molK) e 2.71 (exp),灭菌时，培养基成分分解速率常数K与温度之间的关系 也可用阿累尼乌斯公式表示：,29,1= A e,R T1,E,2= A e,E,R T2,相除取对数,ln,2,1,=,E 1 1,R T1 T2, ,在灭菌时，当温度变化，菌死亡速率常数和培养基成分破坏速率常数都变化。温度由T1升高到T2，值分别为：,同样，灭菌时培养基成分的破坏也可得类似关系：,ln,2 ,1 ,=, ,R T1 T2,E 1 1,30,上面两式相除，得,31,32,通过实验测定可知： 灭菌时杀死微生物的活化能大于培养基成分的破坏 活化能值，因此：,结论1：当灭菌温度上升时，微生物死亡速率的提高 要超过培养基成分的破坏速率的增加。,33,从上述的分析可知，在热灭菌过程中，同时会发生微生 物死亡和培养基破坏这两种过程，且这两种过程的进行 速度都随温度的升高而加速，但微生物的死亡速率随温 度的升高更为显著。因此，可选择合适的灭菌温度和 时间来调和二者之间的矛盾。,再看表灭菌温度、时间与营养成分破坏 量的关系（N/No=0.001）,34,由此可见，若要减少营养成分的破坏，可升高温度灭菌。 结论2：在灭菌时选择较高的温度、较短的时间，这样便 既可达到需要的灭菌程度，同时又可减少营养物质的损失。,问题,灭菌要达到杀死99.99%的细菌芽孢，有两种方法可以采用， 一种是118灭菌15min，另一种是128灭菌5min。哪一种方 法好，为什么？,答：从理论研究和生产实践都可证明，在灭菌过程中，同时会发生微生物死亡和培养基破坏这两种过程，且这两种过程的进行速度都随温度的升高而加速，但微生物的死亡速率随温度的升高更为显著。 因此，对于同一灭菌效果，选择较高的温度、较短的时间，这样便既可达到需要的灭菌程度，同时又可减少营养物质的损失。,35,3、影响灭菌的因素,培养基中氢离子浓度对灭菌的影响 培养基中氢离子浓度直接影响灭菌的效果。培养基的 酸碱度越大，所需杀灭微生物的温度越低。,pH 6.0 8.0 ，微生物最耐热；pH 6.0 ，氢离子易渗入微生物细胞内，从而改变细胞的生理反应，促使其死亡。所以，培养基pH值愈低，灭菌所需的时间愈短。,36,微生物细胞中水分对灭菌的影响 细胞含水越多，蛋白质变性的温度越低 微生物细胞菌龄对灭菌的影响 老细胞水分含量低、低龄细胞水分含量高 培养基的物理状态对灭菌的影响 培养基中微生物数量对灭菌的影响,37,为什么说培养基中脂肪、糖分和蛋白质的含量越 高，灭菌温度就得相应高些 ？,问题,问题,灭菌的彻底与否应以杀死营养细胞为准还是杀死细菌孢为标准，为什么？,答：培养液中油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会增加微生物的耐热性，高浓度有机物会包于细胞周围形成一层薄膜，影响热的传递；因此，在固形物含量高的情况下，灭菌温度可高些。高浓度盐类、色素能削减其耐热性 。,38,答：泡沫中的空气形成隔热层,使传热困难，热难穿透过去杀灭微生物。 因而有时需要在培养基中加入消泡沫剂以减少泡沫的产生，或适当提高灭菌温度，延长灭菌时间。,问题,在灭菌过程中，为什么说培养基发生泡沫对灭菌很不利？,39,问题,答：蒸汽灭菌过程中，温度的控制是通过控制罐内的蒸汽压力来实现。压力表显示的压力应与罐内蒸汽压力相对应，即压力表的压力所对应的温度应是罐内的实际温度。但是如果罐内空气排除不完全，压力表所显示的压力就不单是罐内蒸汽压力，还包括了空气分压，因此，此时罐内的实际温度就低于压力表显示压力所对应的温度，以致造成灭菌温度不够而灭菌不彻底,在灭菌过程中，为什么要排除罐内空气？,40,培养基的PH值越低，灭菌所需的时间就愈短。（ ）,问题 判断,在实际生产中，不宜采用严重霉腐的腐败的水质，是因为其微生物数量多，影响灭菌效果。（ ）,微生物含水量越多，灭菌时间就得越长。（ ）,年轻细胞比年老细胞更易杀死。（ ）,在灭菌过程中，充分搅拌更有利于灭菌。（ ）,41,三、生产上培养基的灭菌方法,（一）分批灭菌 概念：先将输料管内的污水放净并冲洗干净将配制好的培养基输入发酵罐、种子罐或补料罐，用蒸汽直接加热，达到灭菌要求的温度和压力后维持一定时间，再冷却至发酵要求的温度，这一工艺过程称分批灭菌（实罐灭菌） 优点：设备要求低，操作简便 缺点：营养成份有损失 罐利用率低 不能采用高温快速灭菌工艺,42,43,操作,1、在进行培养基灭菌之前，通常应先把发酵罐的分空气过滤器灭菌并用无菌空气吹干。 若已先行空罐灭菌，此步可不进行,2、预热 向夹套或蛇管中通入蒸汽，间接将培养基加热至70左右。 作 用： 利于糊化；减少冷凝水的生成；减轻噪音,44,3、开启蒸汽管，向培养基中通入蒸汽，升温。 4、罐压达1kg/cm2 ( 0.1 MPa)时，按装在发酵罐封头的接种管、补料管、消泡剂管等应排汽。 5、保温 调节好各进汽和排汽阀门，使罐压和温度保持在一稳定水平，维持一定时间。,在保温阶段，凡进口在培养基液面下的各管道都应通入蒸汽；在液面上的其余管道则应排放蒸汽，这样才能保证灭菌彻底，不留死角。,45,6、保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀；待罐内压力降至0.5kg/cm2左右时，向罐内通入无菌空气，向夹套或蛇管中通入冷水，使培养基降至所需温度。,通入无菌空气的作用：加速降温；保持罐内正压,46,事故,2019年9月5日衡阳市某啤酒厂酿造车间一台容积100m3的不锈钢发酵糖在清洗过程中发生收缩变形而吸瘪，造成直接经济损失22万元的重大设备事故。,47,50m3发酵罐失稳事故分析,1事故情况 2019年安阳市某化工厂车间一台50m3发酵罐在空罐消毒后水冷却过程中突然失稳。无伤亡事故，直接经济损失20余万元。 2事故原因分析 现场勘察发现，该罐进汽口和出汽门阀门关闭。冷却水阀门敞开。这说明，失稳是在冷却过程中发生的。 许用压力计算 100以下罐体就会承受外压。外压值等于大气压与水的饱和蒸汽压之差。70以下水的饱和蒸汽压与罐内负压值见附表。 实测筒体许用外压力0.0832MPa。 比较上表不难看出，当罐内温度降到60 以下后，罐体失稳随时都有可能发生。,48,3、分批灭菌的注意事项 1）各路蒸汽进口要畅通，防止短路逆流；罐内液体翻动要剧烈，以使罐内物料达到均一的灭菌温度。 2）排气量不宜过大，以节约蒸汽 3）灭菌将要结束时，应立即引入无菌空气以保持罐压，然后开夹套或蛇管冷却，以避免罐压迅速下降产生负压而吸入外界空气，或引起发酵罐破坏。 4）在引入无菌空气前，罐内压力必须低于过滤器压力，否则培养基将倒流入过滤器。,49,过程包括：升温、保温和冷却等三个阶段。 各阶段对灭菌的贡献：20%、75%、5%,0,图为培养基间歇灭菌过程中的温度变化情况,50,V = V加热 + V维持 + V冷却,RT2 (E 2RT) V 加热 = t 加热 (T-T0)E2,RT2 (E 2RT) V 冷却 = t 冷却 (T-T0)E2,51,R ：气体常数；= 1. 986 卡/克分子K E ：耐热孢子致死的活化能；= 65000 卡/克分子 T：灭菌维持温度； 121 （393 K） T0：开始计算灭菌效果的温度；100 （373 K）,52,例 1） 小型发酵罐在120灭菌维持15分钟，由100 （100以下灭菌效果不计）加热至120的时间为5分钟，由120冷却到100的时间为3分钟，计算总的灭菌时间。,1.9863932(65000 21.986 393) V加热 = 5 = 1.15 (393-373) 650002,RT2 (E 2RT) V 加热 = t 加热 (T-T0)E2,53,1.9863932(65000 21.986 393) V冷却 = 3 = 0. 69 (393-373) 650002,V = V加热 + V维持 + V冷却 = 1.15 + 15 + 0.69 = 16.6 (min),RT2 (E 2RT) V 冷却 = t 冷却 (T-T0)E2,54,例 ） 如果灭菌条件不变，大罐由100加热到120需24分钟；冷却至100的时间为16分钟；求大罐的维持时间。,1.9863932(65000 1.986 393) V加热 V冷却 = （ ） (393-373) 650002 .min,则大罐维持时间 V维持 = V （V加热V冷却） 16.6 9.2 = 7.4 min,55,在不同规模的发酵罐中达到同样灭菌效果所需时间,发酵罐规模（升） 维持时间（分） 200 17. 5 500 12. 6 5000 11. 3 50000 8. 8,56,在实际生产中，也可能遇到所供蒸汽不足、温度不够高的情况，这时可以适当延长灭菌时间。 生产上甚至有100蒸煮而达到彻底灭菌的实例。如要做固体曲而没有高温蒸汽时，可将原料用100蒸汽蒸30min，杀死其中的营养细胞，但孢子与细菌的芽孢没有被杀死。将蒸过的原料置于室温下过夜，未被杀死的孢子便发芽生长，芽孢发育成营养细胞，再30min便可杀死。如此连续反复进行2-3次，亦可达到彻底灭菌的目的。,从以上分析可知，灭菌过程中加热和保温阶段的灭菌作用是主要的，而冷却阶段的灭菌作用是次要的，一般很小。此外，还应指出的是，应当避免长时间的加热阶段，因为加热时间过长，不仅破坏营养物质，而且也有可能引起培养液中某些有害物质的生成，从而影响培养过程的顺利进行。,57,58,问题,在实际生产中，如果遇到所供蒸汽不足，如何有用100蒸煮而达到彻底灭菌？,家用土蒸锅对食用菌三级种进行灭菌？,59,(二)培养基的连续灭菌（连消）,将配置好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温、和冷却而进行灭菌。,60,连续灭菌时，培养基可在短时间内加热到保温温度，并且能很快地被冷却 因此可在比间歇灭菌更高的温度下进行灭菌。 而由于灭菌温度很高，保温时间就相应地可以很短,极有利于减少培养基中的营养物质的破坏。,培养基连续灭菌过程中的温度的变化,61,连续灭菌的基本设备有哪些 ？,问题,62,配料预热罐：配料罐将培养基预热60-70，防止培养基在杀菌时料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声。 连消塔（加热塔）：使高温蒸汽与培养基迅速接触混和，使培养基迅速升高到灭菌温度（126-132 ）。 维持罐：使培养基在灭菌温度下保持5-7min，以达到灭菌的目的； 冷却管：将培养基迅速冷却到40-50 ，输送到灭菌后的发酵罐内。,1、连消塔式灭菌流程,63,发酵罐,蒸汽,蒸汽,冷却水,无菌培养基,配料罐,泵,加热塔,维持罐,冷却管,可在专门的预热罐，也可用配料罐兼作 温 度：一般预热至70左右 预热的物料用泵泵入连消装置 输料泵： 常用 旋涡泵、往复泵、螺杆泵,预热,64,旋涡泵,往复泵,螺杆泵,65,加热,物料泵入加热器，培养基与蒸汽混合，温度迅速上升至130140 常用连消装置有三类： 套管式连消器 汽液混合式连消器 喷射式加热器,66,套管式连消塔,上疏下密，45小孔，孔径6毫米左右 培养液流动线速度小于0.1m/s ; 在管内逗留时间为1520秒,67,汽液混合式连消器,68,保温,保温设备 （维持设备） 保温材料包裹 两种形式：罐式；管式,69,维持罐,70,培养基的平均停留时间, = V / FM,-平均停留时间 （s） V- 维持罐的体积 （ m3） FM - 培养基的流量 （m3/s）,71,Note: 培养基在维持罐的流动不可能非常均匀，可能产生沟流，造成一部分培养基在罐内的停留时间少于平均值。为保证灭菌彻底，在设计罐式维持器时，通常取平均停留时间的35倍。,经验： 在灭菌温度为130时，实际平均时间可取10分钟；在140时则可取34分钟。,72,管式维持器,在设计管式维持设备时，须采用停留时间分布的概念，而不能采用单纯的停留时间。,73,圆管内不同流动形式流体的速度分布情况,湍流 Vaverage = 0.82 Vmax,活塞流 Vaverage = Vmax,粘滞流 Vaverage = 0.5 Vmax,74,在管式维持器中，若培养基流动为活塞流，可根据维持管的内径、培养基的流量求出管长。,但实际上培养基不可能呈活塞流，当培养基处于粘滞留状态时，管内速度呈抛物线，管中心部位的最大流速为平均流速的2倍；若以平均流速确定管长，则会造成边缘部分的培养基过热（加热过长）。,确定维持管的长度，应采用扩散模型 ( Dispersion model) . （复杂，略）,75,冷却,喷淋冷却器 板式冷却器 真空冷却器,76,喷淋冷却器,结构简单；广泛使用,77,喷射加热-真空冷却连续灭菌流程,78,喷射加热连续灭菌流程,灭菌介质,原料介质,蒸汽,T=140度,保温段,真空,流程中采用了蒸汽喷射器，它使培养液与高温蒸汽直接接触，从而在短时间内可将培养液急速升温至预定的灭菌温度然后在该温度下维持一段时间灭菌，灭菌后的培养基通过一膨胀阀进入真空冷却器急速冷却，从图中可以看出，由于该流程中培养基受热时间短，营养物质的损失也就不很严重，同时该流程保证了培养基物料先进先出，避免了过热或灭菌不彻底等现象。,2、喷射加热连续灭菌流程,79,1 喷嘴 2 吸入口 3 吸入室 4混合喷嘴 5 混合段 6扩大管,喷射加热器,80,81,薄板换热器连续灭菌流程,进料 35,100 ,120 ,维持罐120 ,蒸汽147 ,120 ,55 ,出料35 ,水20 ,31 ,流程中采用了薄板换热器作为培养液的加热和冷却器，蒸汽