现代生物分析仪器原理与实验课件二.pptx

第四章：光学分析技术,方法分类 主要分析方法 被测物理性质 光谱分析 发射光谱分析、火焰光度分析 光的发射 分子发光分析法、放射分析法 紫外-可见分光光度法 光的吸收 原子吸收分光光度法 红外光谱法、核磁共振波谱法 比浊法、拉曼光谱法 光的散射 折射法、干涉法 光的折射 X-射线衍射法、电子衍射法 光的衍射 圆二色谱法 光偏振方向的旋转 电化学分析 电位法 电极电位 电导法 电导 极谱法、溶出伏安法 电流-电压 色谱分析 气相色谱法、液相色谱法 薄层色谱法 两相间的分配 热分析 热导法、差热分析法 热性质 质量分析 质谱法 质荷比,光学分析,光学分析法： 根据物质发射的电磁辐射或电磁辐射与物质相互作用建立起来 的一类分析方法（Optical Methods of Analysis）。,基本特点： （1）所有光分析法均包含三个基本过程； （2）选择性测量，不涉及混合物分离（不同于色谱分析） （3）涉及大量光学元器件。,三个基本过程： （1）能源提供能量； （2）能量与被测物之间的相互作用； （3）产生信号。,相互作用方式： 发射、吸收、反射、折射、散射、干涉、衍射主要应用在物质组 成和结构的研究，基团的识别，几何构型的确定，表面分析，定量分 析等方面。,吸收：物质选择性吸收特定频率的辐射能，从低能级跃迁到高能级 发射：将吸收的能量以光的形式释放出 散射：光子与其它粒子碰撞时改变其传播方向；光子与分子产生弹性碰撞无能量交换时为瑞利散射；有能量交换为拉曼散射。通常散射光强I与散射光频率的四次方成正比。 折射：光在不同折射率的介质中传播速率不同引起的 反射：光在传播时在不同折射率的介质界面产生传播方向的改变 干涉：相干波互相叠加产生的现象，可得到明暗相间的条纹 衍射：光波绕过障碍物而弯曲地向它后面传播的现象,光谱仪 (Spectrometers) 光谱仪利用光谱学的基本原理，以获得反应光辐射与样品组分相互作用的结果，即各种谱图，并借助于这些谱图的特征与化合物分子结构信息间关系来解析、推导出复杂化合物结构，进行定性或定量分析。 A spectrometer (spectrophotometer, spectrograph or spectroscope) is an instrument used to measure properties of light over a specific portion of the electromagnetic spectrum, typically used in spectroscopic analysis to identify materials.,光学分析,1,2,3,光谱学基本理论,一、电磁辐射,电磁辐射：以巨大速度通过空间，不需要以任何物质作为 传播媒介的一种能量。 这些电磁辐射包括从射线到无线电波的所有电磁波谱范围(不只局限于光学光谱区)。可划分为三个区域：电子区域、光学区域和(gamma)射线区域。 电磁辐射具有波粒二象性。,二、电磁波谱 电磁辐射按波长顺序排列，称为电磁波谱。,光谱学基本理论,光谱学基本理论,三、粒子的几种状态,基态 (ground states)：原子、离子或分子的常规状态，其能量最低，此时这些粒子所处的状态称为基态。 激发态 (excited states)：粒子获得能量，由低能态或基态过渡到较高能态，称为激发。 跃迁 (transition)：粒子在不同能态之间的运动称跃迁。,光谱学基本理论,四、光与物质的作用,吸收光谱：因物质的原子、离子或分子对辐射的选择性吸收而得到的光谱，称为吸收光谱。 发射光谱：因物质的原子、离子或分子由较高能态向较低能态或基态的跃迁而产生的光谱，称为发射光谱。 荧光光谱：物质吸收辐射能后处于较高能态的粒子，以辐射跃迁的形式过渡到基态所产生的光谱，即称为荧光光谱。（磷光光谱、延迟荧光）,光学分析,1,2,3,根据物质同辐射能作用的性质不同，光学分析法基本上可以分为光谱法和非光谱法。,非光谱法：不涉及能级跃迁，物质与辐射作用时，仅改变传播方向等物理性质，如偏振、干涉、旋光法等。,光谱法：基于物质与辐射能作用时，粒子发生能级跃迁而产生的发射或吸收光谱的波长或强度进行分析的方法。,光学分析法分类,根据电磁辐射的本质，可以将光谱法分为原子光谱和分子光谱。,光学分析法分类,根据电磁辐射能量传递方式，可以将光谱法分为发射、吸收和散射光谱法。,光分析法,一、发射光谱法,光学分析法分类,物质的原子、离子或分子受到热能、电能、化学能激发由低能态或基态跃迁到高能态, 退激时以光辐射释放能量形成的光谱。,线光谱：气体状态下原子或离子受激发生，具有不连续的明亮线条。-原子光谱,光学分析法分类,发射光谱的形状,带光谱：气体分子受激产生，由数个光带和暗区相间组成。,连续光谱：液态或固态物质受高温后激发产生。连续不断，无明晰线条。如 电极头、灯泡发光等。,3.拉曼光谱,光学分析法分类,荧光光谱法,物质吸收辐射跃迁到激发态后， 又以辐射跃迁的形式发射出相应的能量，而本身又回到基态。,二、吸收光谱法,光学分析法分类,辐射通过气态、液态或透明的固态物质时，物质的原子、离子或分子将吸收与其内能变化相对应的频率而由低能态或基态过渡到较高能态。这种由于物质对于辐射的选择性吸收而得到的光谱称为吸收光谱。,3.拉曼光谱,以单色光照射在物质上，物质分子发生散射，出现与入射光频率不同、方向不同的散射光形成的光谱。,丁达尔散射,分子散射,瑞利散射-,拉曼散射-,-光通过含有大质点的介质时发生的散射。,散=入，,用于高聚物分子和胶体粒子大小形状的测定。,散入，用于研究分子结构，作为红外光谱的补充。,光学分析法分类,三、散射光谱法,3.拉曼光谱,光学分析法分类,三、散射光谱法,瑞利散射：当光子与气体分子“碰撞”的时候，主要表现出弹性散射，也就是光子能量不发生变化（表现为光子频率不变），而只是方向发生改变“瑞利散射”（Rayleigh scattering）。 拉曼散射：光子在与分子“碰撞”过程中损失或得到能量，能够观测到散射光子的频率发生移动（向高频移动光子得到能量，向低频移动光子损失能量），这就是“拉曼散射”（Raman scattering）。,光学分析,1,2,3,光谱分析仪,Robert Wilhelm Bunsen (1811-1899),第一台光谱分析仪 (1859),本生灯(1853年): 钾盐紫色，钠盐黄色，钡盐黄绿色 1860年 在狄克海姆矿泉水中发现了新元素铯 1861年 在云母矿中发现了新元素铷 ,一、光分析法仪器的基本流程 general process of spectrometry,光谱仪器通常包括五个基本单元： 光源；单色器；样品；检测器；显示与数据处理；,光谱分析仪,二、光分析法仪器的基本单元 main parts of spectrometry,1. 光源 依据方法不同，采用不同的光源：火焰、灯、激光、电火花、电弧等。依据光源性质不同，分为：,连续光源：在较大范围提供连续波长的光源，氢灯、氘灯、钨丝灯等。 线光源：提供特定波长的光源，金属蒸气灯(汞灯、钠蒸气灯)、空心阴极灯、激光等。,2.单色器：获得高光谱纯度辐射束的装置，而辐射束的波长可在很宽范围内任意改变,主要部件： （1）进口狭缝； （2）准直装置(透镜或反射镜)：使辐射束成为平行光线 （3）色散装置(棱镜、光栅)：使不同波长的辐射以不同的角度进行传播 （4）聚焦透镜或凹面反射镜：使每个单色光束在单色器的出口曲面上成像 （5）出射狭缝：典型的单色器是棱镜单色器和光栅单色器,3.试样装置,光源与试样相互作用的场所 （1）吸收池 紫外-可见分光光度法：石英比色皿 荧光分析法： 红外分光光度法：将试样与溴化钾压制成透明片 （2）特殊装置 原子吸收分光光度法：雾化器中雾化，在火焰中，元素由离子态原子； 原子发射光谱分析：试样喷入火焰； 详细内容在相关章节中介绍。,4. 检测器,（1）光检测器 主要有以下几种： 硒光电池、光电二极管、光电倍增管、硅二极管阵列检测器、半导体检测器； （2）热检测器 主要有： 真空热电偶检测器：红外光谱仪中常用的一种； 热释电检测器： 5. 信号与数据处理系统 现代分析仪器多配有计算机完成数据采集、信号处理、数据分析、结果打印，工作站软件系统；,基本结构：光源、色散系统、吸收池、检测器、信号读出显示系统,三、紫外可见光谱仪,光谱分析仪,紫外可见光谱,可见光区：400nm700nm 紫外区：200nm400nm 红外区：700nm1000nm UV-visible spectrometer：190nm800nm,紫外可见光谱,紫外可见光谱是利用物质在200800nm 光谱区的分子吸收光谱的特征来进行测量。,紫外可见光谱仪,光源 光源的要求是应具有在整个紫外可见光区域的连续辐射，辐射强度高并且稳定。 氘灯：紫外区 185400nm 碘钨灯：可见光区 350800nm,Deuterium Lamp,Tungsten Lamp,紫外可见光谱仪,色散系统 主要有单色器(monochromator)、过滤片(filter)； 从光源连续辐射中选择或分离出某一特定波长辐射（单色光）的光线。,紫外可见光谱仪,色散系统 主要有单色器(monochromator)、过滤片(filter)； 从光源连续辐射中选择或分离出某一特定波长辐射（单色光）的光线。,a Czerny-Turner monochromator,紫外可见光谱仪,吸收池 用于盛放液态样品的石英池，也叫比色杯。,紫外可见光谱仪,检测器 是实现光电信号转换的元件，用于测量经吸收池后的光信号强度变化，目前应用较广的是光电倍增管(photomultiplier, PMT)。,Lambert-Beers Law： 该定律描述了物质吸收辐射的定量关系，也称光吸收定律，其数学表达式为： A 为吸光度(absorbance); I0、I分别式入射光和投射光的强度;为摩尔吸光系数(absorptivity); 为样品的厚度(cm); c为溶液浓度(mol/L)。,紫外可见光谱仪的应用,紫外可见光谱仪的应用,Lambert-Beers Law： 对于遵守Lambert-Beer定律的物质，在一定浓度内A 与c呈线性关系；值在一定条件下是常数，可用于鉴定化合物或定量分析。,紫外可见光谱仪的应用,Bicinchoninic Acid Assay 二喹啉甲酸法测定蛋白浓度 The bicinchoninic acid assay (BCA assay) is a biochemical assay for determining the total concentration of protein in a solution (0.5 g/mL to 1.5 mg/mL). The total protein concentration is exhibited by a color change of the sample solution from green to purple in proportion to protein concentration, which can then be measured using spectrometer techniques.,紫外可见光谱仪的应用,Bicinchoninic Acid Assay (BCA) the peptide bonds in protein reduce Cu2+ ions from the cupric sulfate (硫酸铜) to Cu+ (a temperature dependent reaction). The amount of Cu2+ reduced is proportional to the amount of protein present in the solution. two molecules of bicinchoninic acid chelate with each Cu+ ion, forming a purple-colored product that strongly absorbs light at a wavelength of 562 nm.,紫外可见光谱仪的应用,Bicinchoninic Acid Assay (BCA),紫外可见光谱仪的应用,Bicinchoninic Acid Assay (BCA),紫外可见光谱仪的应用,Bicinchoninic Acid Assay (BCA),The amount of protein present in a solution can be quantified by measuring the absorption spectra and comparing with protein solutions of known concentration.,流式细胞仪,-45-,流式细胞仪和流式细胞术概述 流式细胞仪的基本结构和工作原理 流式细胞仪的测量参数和检测指标 流式细胞仪获取的数据和分析方法 流式细胞仪在临床检测和科研中的应用,流式细胞仪,流式细胞术（flow cytometery, FCM）是20世纪70年代发展起来的一种可以快速、准确、客观，可同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，并且可以对特定群体加以分选。 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量,一、流式细胞仪和流式细胞术,-47-,二、流式细胞仪的基本结构和工作原理,光路系统： 激光光源，光路系统（透镜、滤光片） 电子系统：光电倍增管（PMT），补偿电路 液流系统： 鞘液系统，样品流动系统 数据系统：计算机，数据测量和分析软件。 细胞分选系统,（一） 流式细胞仪的结构,-48-,流式细胞仪光路系统,激光 (Laser)是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照 激光波长: 488nm, 635nm 光收集系统是由若干组透镜, 滤波片, 小孔组成，将产生的光信号引导至检测器,-49-,光路系统,-50-,Injector Tip,-51-,Injector Tip,Fluorescence,signals,Focused laser,beam,Sheath fluid,-52-,流式细胞仪光学系统,激发光源与荧光标记物,-53-,流式细胞仪的光学系统 FACSCalibur,-54-,流式细胞仪液流系统,液流系统：鞘液系统样品流动系统,-56-,流式细胞仪的电子系统,信号检测和分析 当细胞携带荧光素, 通过激光照射区, 受到激发产生不同波长的、代表细胞内不同物质的荧光信号 荧光信号由光电接收器接收，转变为电脉冲信号， 电脉冲信号经A/D转换成数字信号 数字信号传送到计算机，进行储存、作图和统计分析,-57-,数据系统,三、流式细胞仪的测量参数和检测指标,流式细胞仪可检测的参数 1：光学参数 (1) 散射光信号。 前向角散射光（FSC, Forward Scatter） 入射光的前向散射光信号, 可反映：细胞相对大小及其表面积 侧向角散射光（SSC, Side Scatter） 入射光90角的散射光信号， 可反映：细胞颗粒性程度 （胞内成分和构造和表面结构的复杂性）,-59-,散射光信号,前向角散射光FSC: 可以反映细胞相对大小的参数,-60-,散射光信号,侧向角散射光SSC： 可以反映细胞颗粒性程度的参数 （与胞内部结构复杂性及膜表面有关）,（二）流式细胞仪检测的参数 1: 光学参数 (2). 特征信息荧光（Fluorescence）信号,荧光素吸收激光（激发光波长）能量 荧光素将吸收能量释放，转换为 释放较入射光波长更长的光量子（发射光波长） 荧光素与特异抗体结合（荧光抗体） 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生荧光信号越强 荧光素与细胞核酸结合，荧光强度反映核酸含量 荧光素与细胞蛋白结合，荧光强度反映细胞蛋白含量,-62-,（二）流式细胞仪检测的参数 1: 光学参数 (2). 特征信息荧光（Fluorescence）信号,Forward scatter (FSC) Side scatter (SSC) FL1（第一荧光）-FITC(异硫氰酸荧光素） FL2 （第二荧光） -PE（藻红蛋白） FL3 （第三荧光） -PerCP, PeCy5等 PL4 （第四荧光） -APC（别藻蓝蛋白）,-63-,荧光信号,主要光学原件是滤光片，主要分成3类：长通滤片(long-pass filter，LP)、短通滤片(short-pass filtr，SP)及带通滤片(band-pass filter，BP)。,-64-,Optical Filters光学滤光器,Reflected light,Transmitted Light,Light Source,Standard Band Pass Filters,Transmitted Light,White Light Source,630 nm BandPass Filter,620 -640 nm Light,带通滤片,Standard Long Pass Filters,Transmitted Light,Light Source,520 nm Long Pass Filter,520 nm Light,Transmitted Light,Light Source,575 nm Short Pass Filter,575 nm Light,Standard Short Pass Filters,长通滤片,短通滤片,PMT,PMT,PMT,PMT,Dichroic,Filters,Bandpass,Filters,Flow Cytometry Optics,Laser,1,2,3,4,Flow cell,荧光信号,双色直接染色,（二） 流式细胞仪可检测的参数 2: 细胞参数,细胞结构 细胞大小 细胞颗粒性程度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量,细胞功能 细胞表面蛋白抗原 细胞胞浆内蛋白性抗原 细胞内细胞因子 细胞增殖 细胞内钙离子浓度,四、流式细胞仪获取的数据和分析方法,数据存储: LIST MODE 数据显示: 二维点图(Dot Plot) 直方图 ( Histogram plot ) 等高线图(Contour Plot) 密度图 (Density plot)等,流式细胞仪分析数据常见图形： 1. （二维）点陈图/散点图 (Dot Plot),适用于：双参数分析,-73-,流式细胞仪分析数据常见图形：,点图分析(dot plot),流式细胞仪分析数据常见图形： 2. 直方图(Histogram Plot),适用于： 单参数分析,横轴和纵轴代表的含义？,流式细胞仪分析数据常见图形：,等高图和密度图分析(density plot),散点图,密度图,二维等高图,直方图,报告中常见的几种流式细胞图,流式细胞术检测细胞的荧光 标记方法,单标： 一种单抗 : FL1, FSC, SSC（三参数） 双标： 两种单抗：FL1, FL2, FSC, SSC（四参数） 三标： 三种单抗：FL1, FL2, FL3, FSC,SSC（五参数） 四标四种荧光标记抗体： 四种单抗：FL1,FL2,FL3,FL4,FSC,SSC（六参数）,流式细胞仪应用,细胞在癌变过程中DNA 的含量会随之发生改变，DNA 的改变是恶性肿瘤的特异性标志。 流式细胞术能通过检测DNA 含量对癌变过程作出判断，这有助于癌前病变的早期判断。 临床医师选择不同的肿瘤药物对肿瘤进行杀伤作用，然后通过DNA 直方图中观察肿瘤细胞的变化，从而在这些杀伤肿瘤药物中选择出最为有效的药物用于肿瘤治疗，从而达到对肿瘤细胞的最大杀伤效果。,流式细胞术在肿瘤学中的应用,流式细胞仪应用,细胞凋亡( apoptosis) 又被称为细胞程序化死亡，是一种细胞去除机制，这种机制参与了生物体许多过程; 是细胞由于特定信号诱导而激活了其死亡途径，并在基因编程调控下的细胞自杀过程。 它不是病理条件下自身损伤的一种现象，而是细胞生理性死亡的普遍形式，是为了更好地适应生存环境而采取的一种措施。 参加凋亡调控的基因很多，这些基因产物有的可以促进细胞凋亡的发生，有的能抑制细胞凋亡的发生。流式细胞术能够检测参与细胞凋亡的基因蛋白，主要是通过蛋白单体染色，然后通过不同的荧光信号来反映细胞内的变化。,流式细胞术在细胞凋亡研究中的应用,常用荧光染料,细胞凋亡、胞内定位？,流式细胞仪应用,流式细胞仪应用,利用流式细胞仪鉴定GPI型锚定蛋白,流式细胞仪应用,GPI型锚定蛋白鉴定,显微技术,第四章：光学分析技术,光学显微技术,光学显微分析的发展,15世纪中叶，用放大镜（单式显微镜）观察蜜蜂； 1590年，荷兰詹森父子创造出最早的复式显微镜； 17世纪中叶，虎克设计出第一台性能较好的显微镜；惠更斯目镜诞生，并成为现代光学显微镜目镜的原形； 19世纪，德国的阿贝阐明光学显微镜成像原理，并制造出油浸系物镜，使光学显微镜分辨本领达到了0.2微米理论极限，制成了真正意义的现代光学显微镜。,显微技术,光学显微镜成像原理,光学显微镜成像原理,光学显微镜基本概念,孔径角 数值孔径 分辨率 放大率 焦点深度 视场数 工作距离,光学显微镜基本概念,1、孔径角： 由标本上一点发出的进入物镜最边缘光线L和进入物 镜光线OA之间的夹角称为孔径角。 孔径角越大，通过的光就越多。,2、数值孔径： NA = nsin , 叫物镜的数值孔径。 数值孔径是衡量物镜和聚光镜性能高低的重要指标。,光学显微镜基本概念,物镜数值孔径,光学显微镜基本概念,3、分辨率(鉴别距离)： 显微镜能分辨的最小距离，用R表示。显微镜的鉴 别距离越小，分辨率越高。,光学显微镜基本概念,如何提高显微镜的分辨能力？,NA = n sin,R = 0.6/ NA= 0.6/n sin,光学显微镜基本概念,4、放大率： 在显微镜下所看到的物像和实际物体之间的大小比例叫显微镜的放大率或放大倍数。 显微镜下物像的放大主要由物镜、镜筒长度、目镜所决定。 适合的放大倍数决定于物镜的数值孔径，一船应为数值孔径的5001000倍。,光学显微镜基本概念,分辨率和放大率的关系,光学显微镜基本概念,5、焦点深度 ： 在显微镜的光轴上有一段距离范围内物体被看得清晰。超出这段距离的物体就模糊不清。这段距离位于显微镜焦点的上下很小的范围之内。这段距离的上下限叫焦点深度。,光学显微镜基本概念,焦深指保持于焦点区的最大深度,焦深随物镜倍率增加而减小,深（Depth of focus)即物镜成象的焦点深度。 对于显微摄影，如果需要焦深较大的效果，则可以选择同倍率下N.A.较小的物镜或使用带光阑的物镜，减小NA值。,光学显微镜基本概念,6、视场数： 目镜中观察到的物像的一定范围叫视野。 显微镜的总放大率小的时候所能看到的标本的范围大，而总放大率愈大所能看到的标本的局部愈小。所以说视野与显微镜的总放大率成反比。,光学显微镜基本概念,7、工作距离： 工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。 在物镜数值孔径一定的情况下，工作距离短孔径角则大。 数值孔径大的高倍物镜，其工作距离小。,普通光学显微镜,荧光显微镜,荧光显微镜（Fluorescence microscope） 是光学显微镜的一种，也是免疫荧光细胞化学的基本工具。是以紫外线为光源， 用以照射被检物体， 使之发出荧光， 然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。,荧光显微镜,一、荧光显微镜的原理,某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，能在极短的时间内发射出比照射波长更长的光，这种光就称为荧光。 荧光显微镜利用特殊的照明装置发出较短波长的激发光，诱发荧光物质发出荧光，通过物镜作用在样品上，在目镜观察到肉眼可见的荧光。,荧光显微镜,一、荧光显微镜的原理,荧光显微镜,二、荧光显微镜的特点,优点： 检出能力高 对细胞刺激小 能进行多重染色 用途： 物体构造的观察 荧光的有无、色调比较进行物质判别 荧光量的测定对物质进行定性、定量分析,荧光显微镜,三、荧光显微镜的结构,主要结构有机械系统和 光学系统两部分 1、机械系统： 底座、镜身、观察筒 2、光学系统： 物镜、聚光镜、光源等。,荧光显微镜,四、荧光显微镜的分类,落射式,透射式,荧光显微镜,四、荧光显微镜的分类,1、透射式荧光显微镜 激发光源通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光。常用暗视野集光器，也可用普通集光器，调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上。 这是比较旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是放大镜倍数增加其应该减弱。因此适合观察较大的标本材料。,荧光显微镜,四、荧光显微镜的分类,荧光显微镜,四、荧光显微镜的分类,抛物面聚光镜、心形聚光镜、同心球面聚光镜,荧光显微镜,四、荧光显微镜的分类,荧光显微镜,四、荧光显微镜的分类,荧光显微镜,四、荧光显微镜的分类,荧光显微镜,四、荧光显微镜的分类,2、落射式荧光显微镜 这是近代发展起来的新式应该显微镜。激发光从物镜向下落射到标本表面，即同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。 光路中需要加上一个双色束分离器，它与光轴成45度。激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上；样品产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面发生的激发光同时进入物镜，返回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，参与激发光再被阻断滤片吸收。,荧光显微镜,四、荧光显微镜的分类,荧光显微镜,四、荧光显微镜的分类,荧光显微镜,四、荧光显微镜的分类,荧光显微镜,四、荧光显微镜的分类,荧光显微镜,四、荧光显微镜的分类,荧光显微镜,四、荧光显微镜的分类,荧光显微镜,五、荧光显微镜的使用,1、打开灯源，超高压汞灯要预热15min才能达到最亮点。 2、透射式荧光显微镜需在光源与暗视野聚光器之间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的压制滤片。落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片、双色束分离器、压制滤片的插块。 3、用低倍镜观察，根据不同型号荧光显微镜的调节装置，调整光源中心，使其位于整个照明光斑的中央。,荧光显微镜,五、荧光显微镜的使用,4、放置标本片，调焦后即可观察。使用中应注意：未装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤；用油镜观察标本时，必须用无荧光的特殊镜油；高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需待汞灯完全冷却后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。 5、观察。例如：在荧光显微镜下用蓝紫光滤光片，观察到经0.01%吖啶橙荧光染料染色的细胞，细胞核和细胞质被激发产生两种不同颜色的荧光(暗绿色和橙红色)。,荧光显微镜,五、荧光显微镜的使用,荧光显微镜,五、荧光显微镜的使用,（1）必须按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不能随意改变程序。 （2）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯515min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。 （3）防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。 （4）检查时间每次以12h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射35min后，荧光也明显减弱；所以，最多不得超过23h。,荧光显微镜,五、荧光显微镜的使用,（5）荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。 （6）标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。长时间的激发光照射标本，会使得荧光衰减和消失现象，故应尽可能缩短照射时间。暂时不观察时可用挡光板遮盖激发光。 （7）标本观察时候应采用无荧光油，应避免眼睛直视紫外光源。 （8）电源应安装稳压器，电压不稳会降低荧光灯的寿命。,落射式荧光显微镜的结构和工作原理？ 其基本操作流程和使用注意事项有哪些？,激光共聚焦显微镜,近年来, 激光共聚焦显微镜在医学和生物学研究方面的应用越来越广泛，它成像清晰、精确、客观，大有淘汰普通光学显微镜和荧光显微镜的趋势。,在显微镜基础上配置激光光源，扫描装置，共扼聚焦装置和检测系统而形成的新型显微镜。 利用共聚焦光路和激光扫描获得生物样品的显微断层图象，动态扫描记录、图像处理及三维立体构建、成份分析等软件。,原理简介,激光共聚焦显微镜,硬件： 激光源、共聚焦显微镜、步近器、检测器、光电倍增管、计算机、图象输出设备。 软件： 显微镜自动控制和扫描系统、图像处理和分析系统,共聚焦扫描显微镜的系统组成,激光共聚焦显微镜构成,激光器 光电倍增管 检测器,显微镜 步近器,计算机 电子图像 软件,共聚焦显微镜的特点,光源 共聚焦技术 点扫描技术 信号放大 电子图像 软件,1、光源 用激光做光源，从理论上消除了色差。因为激光的单色性强、光源波束集中、波长相同。 2、采用了共扼聚焦技术 在物镜的焦平面上放置了一个小孔，将焦平面以外的杂散光挡住，消除了球差。,共扼聚焦原理图,激光器,扩光器,样品,滤光片,针孔,检测器,入射光,发射光,长通滤光片,入射光,发射光,长通滤光片,激光器,扩光器,样品,滤光片,针孔,检测器,入射光,发射光,长通滤光片,激光器,扩光器,样品,滤光片,针孔,检测器,普通光学显微镜与激光共聚焦显微镜的区别,3、点与面扫描技术 共聚焦显微镜：将样品分解成二维或三维空间上的无数点，用十分细小的激光束（点光源）逐点逐行扫瞄、成像，通过计算机软件组合，最后得到一个整体平面的或立体的像。 普通光镜：是在可见光源下一次性成像。,Z,通过精细平面光切，形成生物样品不同平面的精细图象，将一个连续的光切图象Z轴重叠就可形成一个完整的三维图象,4、图像信号及处理： 光电倍增管放大信号，计算机采集和处理光信号。 计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像，得到的图象是数字化的，可以在电脑中进行处理，再一次提高图象的清晰度。,共聚焦显微镜的应用,高清晰成像 半定量荧光强度分析 荧光探针表达