实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtim.ppt

,实时荧光定量PCR技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR) 分子生物学技术平台 江燕琼,提纲：,实时荧光定量PCR原理 数学原理 化学原理 实时荧光定量PCR的方法应用 绝对定量 相对定量 定量PCR的实验要素 平台定量PCR仪器介绍,实时荧光定量PCR定义：,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。,与普通PCR的区别,普通PCR技术： 在PCR结束后对终点产物进行定量分析。 实时定量PCR技术： 实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起 始模板进行定量。,荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是 基线（背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）。,定量PCR的数学原理,斜率与扩增效率,荧光定量PCR化学原理,非特异性荧光标记： 1、SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan,1、SYBR Green 法,SYBR Green 熔解曲线分析,SYBR Green法优缺点,优点: 对DNA模板没有选择性 适用于任何DNA 使用方便-不必设计复杂探针 非常灵敏 便宜,2、TaqMan探针法,TaqMan作用机理,TaqMan法优缺点,Real-time PCR 方法应用,绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究,绝对定量与相对定量的定义,绝对定量通过标准品定量,绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。 标准样品的种类： 含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 含有和待测样品相同扩增片段的cDNA PCR的产物,绝对定量：从荧光到拷贝数,相对定量通过内标定量,内标（Endogenous Control）通常是-actin、GAPDH基因等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量,相对定量：参照因子Calibrator,相对定量分析方法1 -Ct,前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100且偏 差在 5以内 1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值： CT（test)= CT （target,test) - CT （ref,test) CT（calibrator)= CT （target, calibrator) - CT （ref, calibrator) 2、用校准样本的CT值归一试验样本的CT值： CT= CT（test) - CT（calibrator) 3、计算表达水平比率： 2 CT=表达量的比值,相对定量分析方法2：双标准曲线法 目标基因与内参基因扩增效率不同,待测样品目的基因浓度 待测样品内参基因浓度 F= 对照样品目的基因浓度 对照样品内参基因浓度,定量PCR的实验要素,样品,DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6 2.0之间 DNA用量：0.05 ng 100 ng RNA纯度：OD260/OD280=2.0 cDNA用量：1-100 ng 总RNA反转录的cDNA取1 uL,标准品,标准品梯度稀释方法,复管测试 样品和标准品都要重复 重复次数须遵循统计学要求,平台PCR仪介绍,ABI 7500 fast,特征： 使用96孔板，样品量大，仪器稳定，结果分析直观 ABI试剂ROX校正物理方面的误差：枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性（如孔间、批间温度的波动） Rn= Normalization = Reporter / Referenc,Rotor gene 6500HRM,特征： 3