瘢痕疙瘩成纤维细胞的基因组学研究.doc

瘢痕疙瘩成纤维细胞的基因组学研究中华整形外科杂志2005年7月第2鲞箜塑型垡!:!:!瘢痕疙瘩成纤维细胞的基因组学研究王春梅百束比古张启旭严笠中泽南堂【摘要】目的寻找瘢痕疙瘩致病相关基因,探讨瘢痕疙瘩的发生机理.方法利用含1100个人类肿瘤相关基因的cDNA芯片(cDNAmicroarray)对耳垂和胸部瘢痕疙瘩及正常皮肤成纤维细胞进行检测,初步分析瘢痕疙瘩成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞基因总体表达的差异,并筛选出差异基因.结果在耳垂及胸部瘢痕疙瘩成纤维细胞中,分别有8种和l7种特异性表达基因被检出.在正常皮肤中特异性表达的细胞增殖抑制基因Mda一7,在耳垂及胸部瘢痕疙瘩成纤维细胞中均未被表达.结论多种基因参与了瘢痕疙瘩的形成过程,瘢痕疙瘩成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞之间存在基因表达的差异,增殖因子受体PAR一1和增殖抑制基因Mda一7可能参与瘢痕疙瘩的形成.【关键词】瘢痕疙瘩成纤维细胞基因组学基因芯片基因PathologicalgenomicsofkeloidfibroblasticceHsWANGChun-mei,HikoHyakusok,ZHANGQi-xu,YANLi,NandoNakazawa.PlasticSurgeryHospiml,ChineseAcademyofMedicalSciences,Bei.jing100041,China【Abstract】ObjectiveKeloidsresultfromtheabnormalrepairofthetissuesafterskininjurieswherethepathologicalovergrowthoflargeandactivefibroblasticcellsexpandsbeyondtheboundariesoftheinitiatingwound.Imbalancedexpressionofgeneswithanasyetunknownregulatorymechanismseemstoresultinthehypertrophicdevelopmentoffibroblasticcellsandoverproductionsofcollagen.Togetinformationastogeneswhichfunctionintheactivelygrowingkeloidfibroblasts,wehaveappliedageneexpressionDNAmicroarraytechniquebyanalyzingbroadrangeofgenesatonceinasystematicfashion.MethodsDifferentialgeneexpressionsofkeloidfibroblasticcelllinesagainstanormalskinfibroblasticcellline,allofthecelllineshadbeenpropagatedinourlab,wereanalyzedusingacDNAmicroarraytechnique.mRNAwasextractedfromthecontrolnormalskincellsandthetwolinesofkeloidfibroblasticcells,onefromear-lobekeloidtissueandtheotherfromchestkeloidtissue,wassubjectedtoaDNAmicroarrayanalysiswhichincludes1100humangenes(TaKaRaIntelliGeneHumanCHIPlKSetI).Results8geneswerefoundtobeexpressedexclusivelyinearlobekeloidfibroblasticceillines.Ceilsfromchestkeloidweredetectedtoexpress17genes,specifically.CoagulationfactorII(thrombin)receptorgene,KIAA0367proteingene,andmatrilin一2genewerefoundtobethemostcommonlyexpressedgenesinthekeloidcells.Suppressorgenes,likemelanomadifferentiationassociatedgene一7,Mda一7(U16261),wereexpressedinnormalskinfibroblastsbutwerenotexpressedinkeloidfibroblastsmaybeimplicatedinthepathogenesisofthekeloidlesions.ConclusionsGenesexpressedspecificallyinkeloidcellsmaybeanadequatepathologicaldiagnosticmarkerforkeloids.Further,IdentificationofgenesthatcausecellstodevelopkeloidlesionsleadsUStogenetherapyandpreventionofkeloids.【Keywords】Keloid;Fibroblasticcells;Genomics;DNAmicmaITav:Genes瘢痕疙瘩是由于皮肤创伤治愈过程中成纤维细胞过度增殖和胶原过度合成所致,但是成纤维细胞本身是否异常尚不清楚.近年来许多研究表明,基金项目:日本学术振兴会科学研究费资助(课题编号:12671753)作者单位:100041北京,中国医学科学院中国协和医科大学整形外科医院瘢痕综合治疗中心(王春梅,张启旭,严笠);日本医科大学整形外科(百束比古);日本医科大学病理学教室(中泽南堂)-299?实验研究?瘢痕疙瘩成纤维细胞过度增殖和胶原过度合成的原因可能与基因的结构异常及功能异常有关,但这些研究均是对单一或少许基因表达方面的研究,未能从根本上阐明瘢痕疙瘩的发生机理.我们认为多个基因表达及其相互之间信息传递及调控上的某种异常可能是引起成纤维细胞过度增殖和胶原过度合成的原因,本研究将利用含1100个人类肿瘤相关基中华整形外科杂志2005年7月第2l卷第4ChinJPlastSur$,July2005Vo1.21No.4因的cDNA芯片(cDNAmicroarray)对耳垂和胸部瘢痕疙瘩及正常皮肤成纤维细胞进行检测,从总体上对瘢痕疙瘩成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞之间的差异表达基因进行分析.1材料和方法1.1细胞培养手术切除耳部瘢痕疙瘩1例(患者女,20岁,病因为扎耳孑L,瘢痕疙瘩形成3年,呈浸润扩大至耳垂全层),胸部瘢痕疙瘩1例(患者男,26岁,病因为痤疮,瘢痕疙瘩形成3年,多发,周边发红呈浸润扩大)及非瘢痕体质正常皮肤1例(患者女,26岁,腹部皮瓣移植时取皮),切去表皮及皮下组织,剪成碎块,贴敷于培养瓶内,用含10%胎牛血清的RPMI一1640培养液经初代培养获得成纤维细胞,胰蛋白酶消化传代培养,采用培养5代以内的细胞用于实验检测.1.2mRNA提取从处于对数增殖期的成纤维细胞(510110个/rn1)中提取总RNA(WaKolSOGENkit),再利用OligotexdT30一mRNApurificationspincolumn(TaKaRa,KyotoJapan)提取出浓度为0.2tg/tA的mRNA.1.3cDNA一芯片含1100个人类肿瘤相关基因的TaKaRaIntelliGeneHumanCHIP1KSetI由日本TaKaRa公司提供.1.4检测以Cy3一dTUP,Cy5一dTUP分别标记来源于瘢痕疙瘩及正常皮肤成纤维细胞的mRNA,并制成探针加入cDNA芯片上,置入由6SSC,0.25%SDS,5DenhardtS溶液,carrierDNA组成的溶液中,在65下杂交14h,分别以2SSC/0.2%SDS55oC30min,2SSC/0.2%SDS55oC30min.2SSC/0.2%SDS655min,0.05SSC/0.2%SDS室温5min,进行冲洗.1.5扫描及结果分析利用Affymetrix428ArrayScanner,扫描出Cy3,Cy5各波长的3种信号强度,用ImaGenever.4.0专用软件将信号强度数值化后进行分析,差异表达的标准为Cy3/Cy5信号比值在2倍以上为阳性,在112以下为阴性.2结果在耳垂瘢痕疙瘩中有8种特异性基因被检出,其中5种与细胞增殖相关(表1);胸部瘢痕疙瘩中有17种特异性基因被检出(表2).其中有3种共同基因CoagulationfactorII(thrombin)receptorgene,KIAA0367proteingene.Matrilin一2gene在耳垂及胸部瘢痕疙瘩中均被特异性表达.而在正常皮肤中特异性表达的基因Mda一7,在耳垂瘢痕疙瘩及胸部瘢痕疙瘩中未被表达.表1耳垂瘢痕疙瘩细胞中检测出8种特异性表达基因Tab18geneswerefoundtobeexpressedexclusivelyinear-lobek1n;dl11jBes基因名称基因序列号WinglesstypeMMTVintegrationsitefamilymember2X07876NeuronalShcX07876cAMPresponseelement-?bindingproteinCRE-?BpaL05515V-kitHardy.zk瑚4feliarc.n1airal.nex06l28homologyKIAA0367protein,expressedinosteoblastAB002365Coagulationfactorll(thrombin)receptorNM001992Caspase1,apoptosis-relatedcysteineproteaseMB7507Hypotheticalprotein,expressedinosteoblastAB000115表2胸部瘢痕疙瘩细胞中检测出l7种特异性表达基因Tab2Cellsfromchestkeloidweredetectedtoexpress17genes基因名称基因序列号bonemorphogeneticprotein6fibfinogen-like2KIAA0367proteinproteaseinhibitor12(neoroserpin)coagulationfactorII(thrombin)receptoractivatingtranscriptionfactor3sarcoglycan,alpha(50kDdystrophinassociatedglycoprotein)Rhesusbloodgroup,Dantigenaminomethyltransferase(glycinecleavagesystemproteinTkeratinl3matrilin2Humanclone23612mRNAsequencesarcomaamplifiedsequencenervegrowthfactorreceptor(TNFRsuperfamily,memberl6)KIAA0443geneproducthostcellfactorC1(VPI6-accessoryprotein)opioid-bindingprotein/celladhesionmolecule-like3讨论自1986年Tomas提出了基因组学(Genomics)的概念后,人们对人类基因的认识逐渐深入,并将Genomics进而分为结构基因组(StructuralGenomics)和功能基因组(FunctionalGenomicS).FunctionalGenomics代表了基因研究观念上的更新和技术上的飞跃.在观念上使研究者开始将基因组的活动和功能作为一个整体来看待,生命现象和病理现象是众中华整形外科杂志2005年7月第2l卷第4期ChinJPlast,!:!.多单个基因的活动和由此所产生的功能之间网络作用的结果,因此研究基因组的活动就要研究多种基因在各个特定时刻的总体表达及其相互作用,才能更接近生命现象的本质.在技术上人们将硅技术与生物学技术融合而发展出基因芯片(又称DNA阵列),作为20世纪90年代中期新兴的一门分子生物学技术,正在生物医学各个领域得到深入广泛的应用.它的最大优势在于只需要少量的生物样品就能并行分析成千上万个基因的表达情况,是在同一时刻能够观测到大量细胞或组织基因表达的有效方法,因此能够比较正常细胞和病变细胞在整体表达上的差异,检测出特异性表达的病态基因.皮肤创伤治愈涉及到各种细胞,细胞外基质,可溶性介质,生长因子,以及细胞分子之间的相互作用,这是一个网络式的,由各种分子信号高度调控的,受到基因控制的复杂系统工程,任何环节的异常都可能导致连锁性反应,因此要捕捉到这种网络式的多种基因变化,就必须依赖先进的生物学技术,基因芯片的开发和应用不仅更新了瘢痕疙瘩研究的理念,而且为基因水平上探索瘢痕疙瘩的发生机理及防治方法提供了简单,高效,精确的研究手段.本研究利用含人类1100个肿瘤相关基因的DNA芯片,对来源于耳垂及胸部瘢痕疙瘩的成纤维细胞系与正常皮肤成纤维细胞系之间基因的差异性表达进行了检测.结果显示:在胸部和耳垂瘢痕疙瘩成纤维细胞中,有l7种和8种特异性表达基因被检出,其中有3种共同基因在胸部及耳垂瘢痕疙瘩中均被特异性表达;在正常皮肤中,特异性表达的细胞增殖抑制基因Mda一7,在胸部和耳垂瘢糠疙瘩中未被表达.由此结果可推测:多种基因参与了瘢痕疙瘩的形成过程;瘢痕疙瘩成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞之间存在着基因表达的差异性;耳垂瘢痕疙瘩与胸部瘢痕疙瘩既存在表达相同的基因又存在着差异性基因的检测结果,与两者临床表现既有相同之处又存在差异及其对治疗反应的不同等临床特征相吻合,提示不同部位瘢痕疙瘩在分子水平上可能存在着差异.在瘢痕疙瘩中被检测出的特异性基因主要有:细胞分裂促进因子,蛋白激酶,启动子,增殖因子,增殖因子受体,细胞凋亡相关因子及未知基因,其中耳垂与胸部瘢痕疙瘩中均被特异性表达的已知基因thrombinreceptorgene(PAR一1),可通过与凝血酶蛋白thrombin的结合促进VEGF,PDGF等增殖因子的分泌,而这些因子可促进成纤维细胞的增殖和迁移,因此PAR.1可能是瘢痕疙瘩的致病基因之一,或是由瘢痕疙瘩病态细胞周围炎症反应等刺激所致的过表达基因;而仅在正常皮肤中特异性表达的黑色素瘤分化相关基因一7(基因Mda-7),据有关研究报道在体外可对多种人类肿瘤细胞产生抑制作用,并诱导其凋亡,在原发性黑色素瘤的进展期,Mda一7的表达下调,瘢痕疙瘩成纤维细胞的异常增殖是否因缺少增殖抑制基因Mda.7而不能有效诱导成纤维细胞凋亡,或因PAR一1和Mda一7之间的调控失衡所致,还需要进一步探讨.本研究所采用DNA芯片主要针对1100个人类肿瘤相关基因,这多少带有一定的局限性.在本文完成之际,我们又利用含2万个人类基因的DNA芯片(包含目前所知从肿瘤到免疫代谢等等所有生物活动相关基因)对增生性瘢痕,瘢痕疙瘩,以及非瘢痕体质患者正常皮肤的基因差异性表达谱进行了分析,并筛选出与增生瘢痕,瘢痕疙瘩发生相关联的特异性基因;同时借助于生物信息学的手段分析DNA芯片数据,对增生性瘢痕及身体不同部位的瘢痕疙瘩在分子水平上进行分类,以期为临床上对增生性瘢痕及瘢痕疙瘩的精确诊断提供理论基础,有关研究结果将另文叙述.参考文献lPeacockEE3r,MaddenJW.TreierWC.Biologicalbasisforthetreatmentofkeloidsandhypertroghicscars.SouthMedJ,1970,63:76557676.2WangCM,HyakusokuH,AsanoG.Geneticpredispositionstokeloidandhypertrophicseal.JJpnPlastReconstrSurg,2001,21:241246.3BettingerDA,YagerDR,DiegelmannRF.eta1.TheeffectofTGbetaonkeloidfibroblastproliferationandcollagensynthesis.P1astReconstrSurg,l996.98:827833.4TanEM,RoudaS,GreenbaumSS,ea/Acidicandbasicfibroblastgrowthfactorsdownregulatecollagengeneexpressioninkeloidfibroblasts.A