《NK活性测定》PPT课件.ppt

淋巴细胞功能测定,淋巴细胞功能测定的体外试验,淋巴细胞增殖试验 3H-TdR、MTT、形态学计数 细胞毒试验NK 51Cr、LDH释放法、细胞凋亡检测法 分泌功能检测 细胞因子分泌细胞的检测（ELISPOT） 抗体形成细胞的检测（溶血空斑试验）,T细胞功能检测 T细胞亚群的检测 IL-2活性的测定 淋巴细胞转化实验 B细胞功能检测 抗体形成细胞检测（溶血空斑试验） EA花环试验（测定Fc受体） SmIg的测定（直接免疫荧光法） NK细胞活性检测（细胞毒试验） 吞噬细胞功能检测,NK活性测定,何谓NK？NK概述 NK活性测定 实验原理 实验材料及试剂 实验步骤及结果判读,属淋巴细胞；无特异性TCR；无须致敏即直接杀伤靶细胞。 表面标记 CD3-、CD56+、CD16+ 表面受体 （1）杀伤细胞活化受体（KAR） 结合靶细胞表面糖类配体，促使NK发挥杀伤作用。 （2）杀伤细胞抑制受体（KIR） 识别自身细胞表面MHC-I类分子，产生抑制信号。 主要生物学功能 抗感染与抗肿瘤；免疫调节,自然杀伤细胞,NK细胞不杀伤正常细胞,NK细胞杀伤靶细胞,NK细胞通过ADCC作用杀伤病毒感染的靶细胞,NK细胞杀伤靶细胞电镜图,胞 核 125I释放法 荧光染料释放法,NK细胞+靶细胞,靶细胞溶解、破裂释放,胞浆内酶类 LDH释放法,胞浆内蛋白 51Cr释放法,实验原理,效应细胞 靶细胞 释放LDH,丙酮酸,乳酸,乳酸脱氢酶(LDH),NAD+,NADH+H+,PMS,NBT,Formazan（OD570nm）,实验材料,1、LDH底物溶液（临用前配制） 2、1% NP-40 3、1mol/L柠檬酸终止液,NBT（硝基氯化四氮唑蓝） 4mg NAD+（氧化型辅酶I ） 10mg PMS（吩嗪二甲酯硫酸盐） 1mg,混匀后取1.6ml，加1mol/L乳酸钠0.4ml,加入2mlddH2O溶解,加入0.1mol/L pH7.4的PBS至10ml,实验步骤,效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞）,靶细胞的制备,效-靶细胞相互作用,酶促反应,结果判读,取培养2448hr的靶细胞(K562), 洗涤3次（1000rpm10min）, 最后用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1105/ml, 备用。,靶细胞的制备：,效应细胞的制备 （外周血单个核细胞分离）,采集静脉血2ml，加0.2ml肝素溶液（125-250U/ml）抗凝,吸取2ml淋巴细胞分层液置10ml离心管中， 将管倾斜45，沿管壁缓缓注入抗凝血,离心2000rpm20min,密度梯度离心分离外周血单核细胞,用完全RPMI-1640定容细胞，计数后调整细胞浓度 （加入0.2ml完全RPMI-1640 ，混匀）,将所得PBMC用5倍体积的1640洗涤一次 2000rpm5min,效-靶细胞作用,将效应细胞和靶细胞各0.1ml(E/T=100:1)加入96孔细胞培养板的孔中, 每份标本设2个复孔, 同时设靶细胞自然释放对照组 (0.1ml靶细胞+0.1ml RPMI-1640液) 最大释放对照组 (0.1ml靶细胞+0.1ml1NP-40液), 1000r/min, 2min后, 置37、5CO2温箱中孵育2-4h。,酶促反应,置37预温10min, 加入新鲜配制的底物溶液0.1ml, 37避光反应1015min。 终止酶促反应 （用毛细吸管滴一滴1mol/L柠檬酸30l）,结果计算,用酶标检测仪在570nm波长下读取各孔OD值, 并计算NK细胞活性。,实验组OD值-自然释放对照组OD值,NK细胞活性（%）,最大释放对照组OD值-自然释放对照组OD值,=,100%,1、无论采用何种试验方法, 靶细胞的质量是影响细 胞标记率、自然释放率及实验稳定性的重要因 素。一般要求靶细胞的自然释放率10。 2、分离PBMC时，