沉淀法.ppt

16 沉 淀 法 (precipitation),生物分离过程的一般流程,什么是沉淀法？ 沉淀法纯化蛋白质的优点有哪些？ 常用的沉淀方法包括哪些？ 何谓盐析？其原理是什么？ 常用的盐是什么，影响盐析的主要因素有哪些？ 有机溶剂沉淀法的原理是什么？ 影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？ 等电点沉析的工作原理是什么？,通过本章学习应掌握以下内容,沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。 沉淀法的目的： 通过沉淀达到浓缩的目的； 沉淀方法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分，初步 纯化 ； 将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。 沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。,16.1 概述,沉淀法的原理： 生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些就是溶液的各种理化参数。任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。 沉淀法基本原理就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的， 溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。,16.1 概述,沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。 操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤通常按三步进行：,概述,沉淀法操作步骤 ： 首先加入沉淀剂， 沉淀剂的陈化，促进粒子生长； 离心或过滤，收集沉淀物。 加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。,概述,沉淀生成动力学,溶解度值的降低是一个动力学过程。当体系变得不稳定以后，分子互相碰撞并产生聚并作用。通常认为相互碰撞由下面几种运动引起： 热运动，Bromnian运动； 对流运动，由机械搅拌产生； 差示沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。,为了简化沉淀过程动力学， 可把沉淀过程分成下述个步骤： (1) 初始混合 (2) 新相生成 (3) 布朗运动凝集 (4) 机械碰撞凝集 (5) 聚集体陈化 (6) 聚集体沉淀,沉淀生成动力学,沉淀法不仅用于实验室中，因其不需专门设备，且易于放大，也广泛用于生产的制备过程， 是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。 优点：操作简单、经济、浓缩倍数高 缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强,概 述,沉淀法的分类,根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为： （1）盐析法； （2）等电点沉淀法； （3）有机溶剂沉淀法； （4）非离子型聚合物沉淀法； （5）聚电解质沉淀法； （6）复合盐沉淀法等 （7）亲和沉淀法 （8） 选择性沉淀法。,16.1 蛋白质的溶解特性,蛋白质是两性高分子电解质（amphoteric polymer），主要由疏水性各不相同的 20 种氨基酸组成。 在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势，即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。 亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。 因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区构成。,蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域,蛋白质的溶解特性,蛋白质的溶解行为由其组成、构象以及分子周围溶液性质所决定。 蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。 一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶解。,防止蛋白质凝聚沉淀的屏障,蛋白质周围的水化层（hydration shell)，保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞，使蛋白质形成稳定的胶体溶液。 蛋白质两性电解质，分子间静电排斥作用。（存在双电层）蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。,16.盐析 Salt induced precipitation,盐析,概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。 盐析是可逆的，而变性是不可逆的 早在1859年，中性盐盐析法就被用于从血液中分离蛋白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分级中使用，得到了比较满意的结果。,盐析法机理,（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集， 将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。 （2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。 （3）中和电荷，减少静电斥力， 中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。,盐析过程,当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况： （1）“盐溶”现象(salt-in)低盐浓度下，增加蛋白质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增大 。 （2）“盐析”现象(salt-out)高盐浓度下，中和电荷、破坏水化膜，蛋白质溶解度随之下降 。,盐析作用要强 盐析用盐需有较大的溶解度 盐析用盐必须是惰性的 来源丰富、经济,1）盐析用盐的选择,盐析用盐的选择,在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱 阴离子盐析效果 ： 柠檬酸PO43- SO42- CH3COO- Cl- NO3-SCN- 阳离子盐析效果： NH4+ K+Na+ 高价阳离子 阴离子的影响大于阳离子,盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠 硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂 （1） 价廉 ； （2） 溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来； （3）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好， （4）不易引起蛋白质变性。,盐析用盐的选择,缺点： （1）水解变酸； （2）高pH 释氨，腐蚀； （3）残留产品有影响。,盐析操作(加盐方式）,硫酸铵的加入有以下几种方法： 1）加入固体盐法 用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高； 2）加入饱和溶液法 用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。 3）透析平衡法 先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但程序烦琐，故多用于结晶。,一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。 在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。 每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。 组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需盐的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越易沉淀。,2）盐浓度对盐析效果的影响, S=-s S蛋白质的溶解度，g/L; I离子强度， I=1/2mizi2 mi离子 i的摩尔浓度； Zi所带电荷 常数，图中截距 Ks盐析常数，图中直线斜率,Cohn经验式 蛋白质溶解度与盐浓度的关系,和Ks的物理意义 代表截距，即当离子强度为零，也就是纯水中的假想溶解度的对数。与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关； Ks盐析常数，代表图中直线的斜率； 从一些实验结果表明，Ks与温度和pH无关，但和蛋白质与盐的种类有关。但这种变化不是很大，例如以硫酸铵作为沉淀剂时，Ks值对不同的蛋白质来说，其变化不会超过1倍。,用盐析法分离蛋白质的二种方法,盐析法分为两类， 第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，（固定pH, 温度，改变盐浓度），由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，用于早期的粗提液； 第二种叫分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，（固定离子强度，改变pH及温度），由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，用于后期进一步分离纯化和结晶。,虽然Cohn公式能够描述盐析状态下蛋白质的溶解度，但它不能体现低盐浓度（盐溶状态）下蛋白质的溶解度。 Melander和Horvath根据 Sinanoglu有关蛋白质盐析时溶剂和溶质相互作用理论（空腔理论）， 提出了不同盐浓度下的蛋白质溶解度的计算方程式：,盐析用盐量的确定-饱和度：,饱和度（Saturation）的概念： 以硫酸铵为例：250C时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L定义为100%饱和度 目标蛋白质的盐析沉淀操作之前，所需的硫酸铵浓度或饱和浓度可通过实验确定。 对多数蛋白质，当达到85%饱和度时，溶解度都小于 0.l mgL，通常为兼顾收率与纯度，饱和度的操作范围在40%-60%之间。,硫酸铵盐析过程 最适饱和度是30%，55%,上清液蛋白浓度,由于不同的蛋白质溶解度不同，沉淀时所需的离子强度也不相同， 如果需要先除去些杂蛋白，然后在较高的饱和度下，沉淀目标蛋白质，则可采用分段盐析 改变盐的浓度，可将混合液中的蛋白质分批盐析分开。 如半饱和硫酸铵可沉淀血浆球蛋白，饱和硫酸铵则可沉淀包括血浆清蛋白。,分段盐析(fractional salting out),盐析的影响因素：3）pH值,一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶解度最小。 为提高盐析效率，多将溶液PH值调到目的蛋白的等电点处。 注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐浓度下所测的结果是不同的，需根据实际情况调整溶液PH值，以达到最好的盐析效果。,pH值,PH,两种蛋白质的相对溶解度会随pH而变化很大； 随pH 变化 （1）对数关系 （2） 等电点附近有极小值,lgS,在进行盐折时，必须控制pH 图中直线都相互平行 Ks ,pH值,盐析影响因素：4）温度的影响,在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。 但在高浓度下，蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降。 在一般情况下，蛋白质对盐析温度无特殊要求，可在室温下进行，只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-4进行。 随温度升高减小，热促失水膜 Ks不随温度而变,盐析的影响因素：5）蛋白质浓度,沉淀蛋白质盐的浓度范围并不是固定的，而是和起始浓度有关。 高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓度过高，会发生严重共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。 在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀作用比较少，但回收率会降低。 因此需要在两者之间进行适当选择。 分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。 一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。相当于25 mg/mL30mg/mL。,对起始浓度为 30g/L的COMb溶液，大部分蛋白质在硫酸铵饱和度为 58-65之间沉淀出来； 但对稀释10倍的 COMb溶液，饱和度达到66%时才开始沉淀，而相应的沉淀范围为66-73%饱和度。,盐析注意事项,选择适宜饱和度 采用分步盐析 盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，稳定pH 用磷酸缓冲液 在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。 盐析后最好缓慢搅拌一个小时而且再在冰浴中放置一段时间。 为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。 盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析较慢，一般可用超滤,盐析注意事项,硫酸铵的使用 硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用，使用前用H2S处理 高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0左右），使用前也需要用氨水调节至所需PH。 硫酸铵容易吸潮，计算饱和度需注意 固体硫酸铵加入后体积变大加入固体盐后体积的变化已考虑在表中； 盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种情况下，硫酸铵密度较大，若用离心法需要较高离心速度和长时间的离心操作，耗时耗能。离心多用于较低浓度硫酸铵溶液。,盐析法特点：,成本低，不需要特别昂贵的设备。 操作简单、安全。 不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得到保持生物活性的纯化蛋白质。 分离效果不理想，通常只是作为初步的分离纯化，还需要结合其它的纯化方法。,16.等电点沉淀法 isoelectric point precipitation,等电点沉淀法,在低的离子强度下，调pH至等电点，使蛋白质所带净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，形成沉淀的操作称为等电点沉淀 不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。 生产胰岛素时，在粗提液中先调PH8.0去除碱性蛋白质，再调PH3.0去除酸性蛋白质。,pH=pI,图16-10表示大豆蛋白的溶解度随pH的变化情况。,等电点沉淀法,利用脂肪酶和淀粉酶的热敏感性不同， 在40(2温度下处理2.5h(pH=3.4)， 可将黑曲霉发酵液中90 以上的淀粉酶去处， 从而可以制备较纯的脂肪酶。 超氧化物歧化酶热稳定性很好， 对提取 液在60oC进行短时间热处理可沉淀20 杂蛋白。,等电点沉淀法,细胞色素C洗脱液（离交）+ 硫酸胺（饱和度86%） 调pH5.0-5.5，低温离心 上清液调pH4.8- 5.1产物 沉淀（杂蛋白）,等电点沉淀法注意事项,本法适用于憎水性较强的蛋白质，例如酪蛋白在等电点时能形成粗大的凝聚物。 但对一些亲水性强的蛋白质。如明胶，则在低离子强度的溶液中，调 pH在等电点并不产生沉淀。 等电点沉淀法往往不能获得高的回收率，通常与其他沉淀方法结合使用； 在调节等电点时，如果采用盐 酸、氢氧化钠等强酸强碱，要注意防止酶的失活或蛋白变性。为了使pH缓慢变动，也可用乙酸、碳酸等弱酸和碳酸钠等弱碱。 中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大。,16. 有机溶剂沉淀法 organic sovent precipitation,概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。 有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。 优点在于：1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易； 缺点是1）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，2）操作要求在低温下进行。3）成本高 总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。,有机溶剂沉淀法,有机溶剂沉淀法机理,A 降低溶剂介电常数（介电常数D有机 D水） ，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了酶、蛋白质、核酸等带电粒子之间的作用力，因相互吸引而聚合沉淀。 B 破坏水化膜：由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏水化层，降低蛋白质分子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白质沉淀。 C 相反力：疏水基团暴露并有机溶剂疏水基团结合形成疏水层,有机溶剂沉淀法机理,降低介电常数 破坏水化膜,常用的有机溶剂沉析剂,选择依据： 水溶性要好 介电常数要小 致变性作用要小（甲醇） 毒性要小、挥发性适中 容易获取 沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙醇是最常用的沉淀剂 乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析； 丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广；,1、温度 使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行， 有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使溶液的温度显著升高，从而增加有机溶剂对蛋白质的变性作用，有机溶剂要缓缓加入，防止溶液局部升温。 温度还会影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全。 因此，所用的有机溶剂须预先冷却到-10-20；在使用有机溶剂沉淀生物高分子时，整个操作过程应在低温下进行 。,有机溶剂沉淀法的影响因素,2、pH值： pH多控制在待沉蛋白质的等电点附近。 3、样品浓度：样品较稀时，将增加有机溶剂投入量和损耗；样品太浓会增加共沉作用 。一般认为蛋白质的初浓度以0.52为好，粘多糖则以12较合适。 4、中性盐浓度：较低浓度的中性盐存在有利于沉淀作用，减少蛋白质变性。一般中性盐浓度以0.010.05mol/L为好，常用的中性盐为醋酸钠、醋酸铵、氯化钠等。 5、某些金属离子：一些金属离子如Ca2+、Zn2+等可与某些成阴离子状态的蛋白质形成复合物，这种复合物溶解度大大降低而不影响生物活性，有利于沉淀形成，并降低溶剂用量。,有机溶剂沉淀法的影响因素,举例：固体发酵生产-淀粉酶的提取工艺研究 -淀粉酶（米曲霉）菌体 + 水 过滤 水抽提清液 加乙醇（70%）搅拌 -淀粉酶,* pH影响 收率% 酶活 收率 酶活 6.5 pH * 适宜的pH 5.6 6.0,* 温度影响 收率% 酶活 酶活 收率 10 20 T * 适宜的温度10 20 ,16.非离子型聚合物,用聚乙二醇等非离子性聚合物亦能降低蛋白质的溶解度，有选择性的沉淀蛋白质。 机理：与有机溶剂相似，能降低水活度，破坏蛋白质的水化膜。 常用非离子性聚合物为Polyethylene glycol (PEG)： 是一种水溶性的高分子聚合物，分子量 4,000 以上的 PEG 可以用来沉淀蛋白质。 优点： 1. 室温 2. 颗粒大，易于收集 3. 提高蛋白质的稳定性 4. PEG 难去除，幸而 PEG 通常一般不影响下一步的分离。,16.聚电解质沉淀,机理：架桥与静电 离子型多糖聚合物，酸性多糖羧甲基纤维素、海藻酸钠，食品蛋白的沉淀。 合成的离子聚合物： 聚丙烯酸（pH 2.8 90%蛋白沉淀） 聚苯乙烯季胺盐（pH 10.4, 95% 蛋白沉淀） 聚甲基丙烯酸 聚乙烯亚胺,16.7 成盐类复合物沉淀,此类沉析剂有以下三种： （1）高价金属盐：Cu2+，Ag2+，Zn2+，Ca2+ 与酸性基团结合； （2）苦味酸盐、单宁酸盐、鞣质等，与碱性基 团结合 （3）无机复合盐：磷钨酸盐、磷钼酸盐等 缺点：容易导致活性蛋白的不可逆变性，需采用较温和的条件，有时还需加入一定的稳定剂。,） 金属离子沉淀,金属离子的沉淀作用是由于它们能与蛋白质分子中的特殊部位起反应造成的。例如锌易与組胺酸残基中咪唑基结合，从而降低蛋白质的溶解度。 金属离子在蛋白质分级沉淀上的应用可以追溯到1905年，真正的认识是后来从金属离子与纯血浆蛋白的特异相互作用的研究中得到的。 Zn2+用于沉淀杆菌肽、尿激酶和胰岛素。 Ca2+（CaCO3）用于分离乳酸，血清蛋白和柠檬酸。 硫酸钡在柠檬酸生产中用以去除重金属高于， MgSO4用以去除DNA和其他核酸；,成盐类复合物沉淀,金属离子沉淀蛋白质,一般可分三类： 能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的一些金属离子，如：Mn2+、 Fe2+ 、 o2+、 Ni2+ 、 u2+、 Zn2+ 、 Cd2+ ; 能与羧酸结合而不与含氮化合物结合的一些金属离子，如：Ca2+ 、 Ba2+、 Mg2+ 、 Pb2+ ; 能巯基化合物强烈结合的一些金属离子，如：g2+ 、 Ag2+ 、 Pb2+ 。 实际应用时，金属离子的浓度常为0.02mol/L。复合物中金属离子的去除，可用离子交换法或EDTA金属螯合剂。,例： 调pH4.2 上清液 胰岛素粗品溶液 30 % 丙酮 沉淀（杂蛋白） 调pH6.0 上清液 Zn2+ 胰岛素锌盐,2有机盐法 含氮有机酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉淀析出。 但此法常发生不可逆的沉淀反应，故用于制备蛋白质时， 3无机复合盐法：如磷钨酸盐、磷钼酸盐等。 以上盐类复合物都具有很低的溶解度，极易沉淀析出。 若沉淀为金属复合盐，可通以H2S使金属变成硫化物而除去； 若为有机酸盐或磷钨酸盐，则加入无机酸并用乙醚萃取，把有机酸和磷钨酸等移入乙醚中除去，或用离子交换法除去。,成盐类复合物沉淀,16. 亲和沉淀 affinity precipitation,亲和沉淀是分离过程的一部分，但是其沉淀原理与通常的沉淀方法有很大的不同。 它是利用蛋白质与特定的生物合成分子（免疫配位体、基质、辅酶等）之间高度专一的相互作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术。 所以其沉淀原理不是依据蛋白质溶解度的差异，而是依据“吸附”有特殊蛋白质的聚合物的溶解度的大小。,亲 和 沉 淀,亲和过程提供了一个从复杂混合物中分离提取单一产品的有效方法。 初始阶段，将一个目标蛋白质与键合在可溶性载体上的亲合配位体络和形成沉淀； 所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，洗去可能存在的杂质； 用一种适当的试剂将目标蛋白质从配位体中离解出来。,16.9 选择性变性沉淀法,选择性变性沉淀法：选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀下来，而与目的物分开。 原理：利用蛋白质、酶和核酸等生物大分子对某些物理或化学因素敏感性不同，有选择地使之变性沉淀，以达到分离提纯的目的。 方法可分为：1）利用表面活性剂(三氯乙酸)或有机溶剂引起变性；2）利用对热的不稳定性,加热破坏某些组分，而保存另一些组分；3）酸碱变性。,选择性变性沉淀法是使杂质变性沉淀，又对目的物没有明显影响，所以在操作之前要对欲分离的物质中的杂蛋白等杂质的种类、含量及其物理化学性质等有比较全面的了解。 例如对于-淀粉酶等热稳定性好的酶，可以通过加热进行热处理，使大多数杂蛋白受热变性沉淀而被除去。,选择性变性沉淀法,选择性分离核酸,酚、氯仿、十二烷基磺酸钠等 目的是使核酸和蛋白质分离，蛋白质变性沉淀，核酸则存在于水溶液中。 在核酸提取液中加入氯仿-戊醇或氯仿-辛醇，振荡一段时间、使蛋白质在氯仿-水的界面上形成沉淀而被除去，核酸仍然留在水溶液中。 在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，用苯酚-水溶液提取核酸，在DNA、RNA在水溶液中，而蛋白质在苯酚层中形成沉淀而被除去； 在DNA、RNA混合溶液中，用异丙醇选择性地沉淀DNA，而RNA留在溶液中。,选择性变性沉淀法,粘多糖沉淀剂,CTAB(十六烷基三甲基季铵盐溴化物) 与多糖上的阴离子形成形成季铵络合物，降低离子强度，络合物析出。,选择性变性沉淀法,各种沉淀方法应用范围,盐析法：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。 等电点沉淀法：用于氨基酸、蛋白质等两性物质的沉淀。但单独应用较少，多与其它方法结合使用。 非离子多聚体沉淀法：用于分离生物大分子。 生成盐复合物沉淀：用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。 选择性沉淀（热变性或酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。,思考题：,1 .理解概念：硫酸铵饱和度，盐溶， 盐析 2 .沉淀与结晶有何不同？ 3 .有机溶剂沉淀蛋白质的机理什么？用乙醇 沉淀蛋白质时应注意哪些事项？,16 沉 淀 法 (precipitation),第二讲,沉淀法的分类,（1）盐析法； （2）等电点沉淀法； （3）有机溶剂沉淀法； （4）非离子型聚合物沉淀法； （5）聚电解质沉淀法； （6）复合盐沉淀法等。,16.等电点沉淀法 isoelectric point precipitation,等电点沉淀法,在低的离子强度下，调pH至等电点，使蛋白质净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，形成沉淀。 不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。 生产胰岛素（pI5.4）时，在粗提液中先调PH8.0去除碱性蛋白质，再调PH3.0去除酸性蛋白质。,pH=pI,图16-10表示大豆蛋白的溶解度随pH的变化情况。,等电点沉淀法,等电点沉淀法注意事项,本法适用于憎水性较强的蛋白质，例如酪蛋白在等电点时能形成粗大的凝聚物。 但对一些亲水性强的蛋白质。则在低离子强度的溶液中，调pH在等电点并不产生沉淀。 等电点沉淀法往往不能获得高的回收率，通常与其他沉淀方法结合使用； 在调节等电点时，如果采用强酸强碱，要注意防止酶的失活或蛋白变性。为了使pH缓慢变动，也可用乙酸等弱酸和碳酸钠等弱碱。 中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大。,16. 有机溶剂沉淀法 organic sovent precipitation,概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。 有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。,有机溶剂沉淀法,有机溶剂沉淀法机理,A 降低溶剂介电常数（介电常数D有机 D水） 减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间作用力，增加了蛋白质等带电粒子相互吸引力，聚合沉淀。 B 破坏水化膜： 由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏水化层，降低蛋白质分子的溶剂化能力，使蛋白质沉淀。 C 相反力：疏水基团暴露并与有机溶剂疏水基团结合形成疏水层,有机溶剂沉淀法机理,降低介电常数 破坏水化膜,常用的有机溶剂沉析剂,选择依据： 水溶性要好 介电常数要小 致变性作用要小 毒性要小 容易获取，成本低 沉淀蛋白质常用的是乙醇、甲醇和丙酮。 沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸常用的是乙醇。 乙醇：沉析作用强,挥发性适中,无毒,是最常用的有机沉淀剂； 丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广；,1、温度 使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行， 有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使溶液的温度显著升高，增加有机溶剂对蛋白质的变性作用，有机溶剂要缓缓加入，防止溶液局部升温。 温度还会影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全。 因此，有机溶剂须预先冷却到-10-20；在使用有机溶剂沉淀生物高分子时，整个操作过程应在低温下进行 。,有机溶剂沉淀法的影响因素,2、pH值： pH多控制在待沉蛋白质的等电点附近。 3、样品浓度：样品较稀将增加有机溶剂投入量和损耗；样品太浓会增加共沉作用。蛋白质的初浓度以0.52为好，粘多糖则以12较合适。 4、中性盐浓度：较低浓度中性盐有利于沉淀作用，减少蛋白质变性,以0.010.05M为好，常用为醋酸钠/铵、氯化钠等。 5、某些金属离子：一些金属离子如Ca2+、Zn2+等可与蛋白质形成复合物，溶解度降低而不影响生物活性，有利于沉淀形成。,有机溶剂沉淀法的影响因素,优点在于： 分辨能力比盐析法高，即某一种蛋白质等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀； 沉淀不用脱盐，过滤较为容易； 缺点在于： 对具有生物活性的大分子容易引起变性失活， 操作要求在低温下进行。 成本高 总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。,有机溶剂沉淀法的特点,举例：固体发酵生产-淀粉酶的提取 -淀粉酶（米曲霉）菌体 + 水 过滤 水抽提清液 加乙醇（70%）搅拌 -淀粉酶,* pH影响 收率% 酶活 收率 酶活 6. pH * 适宜的pH 5.6 6.0,* 温度影响 收率% 酶活 酶活 收率 10 20 T * 适宜的温度10 20 ,16.非离子型聚合物,用聚乙二醇等非离子性聚合物亦能降低蛋白质的溶解度，有选择性的沉淀蛋白质。 机理：与有机溶剂相似，能降低溶液介电常数，破坏蛋白质的水化膜。 常用非离子性聚合物为 (PEG)：是一种水溶性的高分子聚合物，分子量4,000 以上。 优点： 1. 室温 2. 颗粒大，易于收集 3. 提高蛋白质的稳定性 4. PEG 难去除，幸而 PEG 通常一般不影响下一步的分离。,16.聚电解质沉淀,机理：架桥与静电 离子型多糖聚合物，酸性多糖羧甲基纤维素、 海藻酸钠，食品蛋白的沉淀。 合成的离子聚合物： 聚丙烯酸（pH 2.8 90%蛋白沉淀） 聚苯乙烯季胺盐（pH 10.4, 95% 蛋白沉淀） 聚甲基丙烯酸 聚乙烯亚胺,16.7 成盐类复合物沉淀,某些盐类与蛋白质等结合成复合盐类，从而溶解度降低，生成沉淀。 此类沉析剂有以下三种： （1）与酸性基团结合：高价金属盐Cu2+ Ag2+ Zn2+ Ca2+； （2）与碱性基团结合：含氮有机物如苦味酸、尿素、鞣酸， （3）无机复合盐：磷钨酸盐、磷钼酸盐等 缺点：容易导致活性蛋白的不可逆变性，需采用较温和的条件，有时还需加入一定的稳定剂。,）金属离子沉淀,金属离子在蛋白质分级沉淀上的应用可以追溯到1905年，真正的认识是后来从金属离子与纯血浆蛋白的特异相互作用的研究中得到的。 常用金属离子： Zn2+用于沉淀杆菌肽、尿激酶和胰岛素。 Ca2+（CaCO3）用于分离乳酸，血清蛋白和柠檬酸。 硫酸钡在柠檬酸生产中用以去除重金属， MgSO4用以去除DNA和其他核酸；,成盐类复合物沉淀,金属离子沉淀蛋白质,一般可分三类： 能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的一些金属离子，如：Mn2+、 Fe2+ 、 o2+、 Ni2+ 、 u2+、 Zn2+ 、 Cd2+ ; 能与羧酸结合而不与含氮化合物结合的一些金属离子，如：Ca2+ 、 Ba2+、 Mg2+ 、 Pb2+ ; 能与巯基化合物强烈结合的一些金属离子，如：g2+ 、 Ag2+ 、 Pb2+ 。 金属离子的浓度常为0.02mol/L。,例： 调pH4.0 沉淀（杂蛋白） 胰岛素粗品溶液 30 % 丙酮 上清液 调pH6.0 上清液 Zn2+ 胰岛素锌盐,金属离子沉淀蛋白质,2有机盐法 含氮有机物如苦味酸、苦酮酸、鞣酸、尿素等能与有机分子碱性基团形成复合物而沉淀。 3无机复合盐法：如磷钨酸盐、磷钼酸盐等。 以上盐类复合物都具有很低的溶解度，极易沉淀析出。 若沉淀为金属复合盐，复合物中金属离子的去除可用离子交换法、EDTA螯合剂、通H2S使金属变成硫化物而除去； 若为有机酸盐或磷钨酸盐，则加入无机酸并用乙醚萃取，把有机酸和磷钨酸等移入乙醚中除去，或用离子交换法除去。,成盐类复合物沉淀,16. 亲和沉淀 affinity precipitation,亲和沉淀是沉淀分离的一种，将亲和反应的高度选择性、低处理量特性与沉淀操作的大处理量有机结合形成了亲和沉淀技术。 其沉淀原理与通常的沉淀方法有很大的不同：不是依据蛋白质溶解度差异，而是依据“吸附” 蛋白质的特殊聚合物溶解度的大小。 利用蛋白质与特定的配基（免疫配位体、基质、辅酶等）之间高度专一的相互作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术。,亲 和 沉 淀,亲和沉淀过程： 配基与载体的选择 将配基与可逆溶解载体偶联后形成载体-配基复合物， 将目标蛋白质与键合在可溶性载体上的亲合配基络合形成复合体； 改变溶液条件，使复合体沉淀析出； 所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，洗去可能存在的杂质； 用一种适当的试剂将目标蛋白质从配位体中离解出来。,例子：胰蛋白酶的亲和沉淀,配基（大豆胰蛋白酶抑制剂）固定于载体（聚合脂质体-醇磷脂乙醇胺 胰蛋白酶粗溶液加入一定量聚合物溶液进行吸附； 加入0.2MNaCl使复合体沉淀 0.01 M NaOH洗脱沉淀，释放胰蛋白酶,16.9 选择性沉淀法,概念：选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀下来，而与目的物分开。 原理：利用蛋白质、酶和核酸等生物大分子对某些物理或化学因素敏感性不同，有选择地使之变性沉淀，以达到分离提纯的目的。 方法：）利用对热的不稳定性,加热破坏某些组分，而保存另一些组分；）酸碱变性。 ）利用表面活性剂(三氯乙酸)或有机溶剂引起变性；,选择性变性沉淀法是使杂质变性沉淀，又对目的物没有明显影响，所以在操作之前要对欲分离的物质中的杂蛋白等杂质的种类、含量及其物理化学性质等有比较全面的了解。 例如对于-淀粉酶等热稳定性好的酶，可以通过加热进行热处理，使大多数杂蛋白受热变性沉淀而被除去。,选择性变性沉淀法,酚、氯仿、十二烷基磺酸钠等 目的是使核酸和蛋白质分离，蛋白质变性沉淀，核酸则存在于水溶液中。 在核酸提取液中加入氯仿-戊醇，振荡一段时间、使蛋白质在氯仿-水的界面上形成沉淀而被除去，核酸仍然留在水溶液中。 在DNA、RNA混合溶液中，用异丙醇选择性地沉淀DNA，而RNA留在溶液中。,选择性沉淀法选择性分离核酸,粘多糖沉淀剂,CTAB(十六烷基三甲基季铵盐溴化物) 与多糖上的阴离子形成形成季铵络合物， 降低离子强度，络合物析出。,选择性变性沉淀法,各种沉淀方法应用范围,盐析法：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。 等电点沉淀法：用于氨基酸、蛋白质等两性物质的沉淀。多与其它方法结合使用。 非离子多聚体沉淀法：用于分离生物大分子。 生成盐复合物沉淀：用于多种物质(特别是小分子) 选择性沉淀（热/酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。,沉淀法应用,沉淀法应用,酵母醇脱氢酶的分段盐析 尿激酶的沉淀分离 沉淀法大规模提纯血浆蛋白 胰蛋白酶的提取 柠檬酸的提取 四环素的提取 生活例子：咸鸭蛋,1、分段盐析法分离酵母醇脱氢酶,过滤液经过30%丙酮沉淀杂蛋白后，然后进行分段盐析,分段盐析法分离酵母醇脱氢酶,丙酮沉淀杂蛋白后粗酶的比活上升4.94倍 分段盐析中饱和度在5055区段中析出的组分与粗酶相比其比活上升9.62倍， 工艺优点： 丙酮沉淀杂蛋白后，再加大丙酮浓度使粗酶沉淀的过程,如果不在低温下逐滴加入冷丙酮，酶活力极易丢失 而盐析中，硫酸铵的加入会稳定蛋白质的构象，使之难于变性,所以在分段盐析中酶的总活力很少丢失 分段盐析可以多次重复进行，以便纯化倍数提高但有机溶剂沉淀法易使蛋白质变性，不易反复使用,2尿激酶的沉淀分离,尿激酶：分离方法包括沉淀法、吸附法、层析法 沉淀法： 金属离子形成复合盐 脱盐 盐析,Zn 离子沉淀尿激酶,低浓度时，zn 能选择沉淀尿激酶。在3mM可得85-92 回收率，而沉淀物的量并不多； 加大Zn 浓度虽然能提高有限回收率，但沉淀物量大，纯度降低。,沉淀量,酶活,EDTA 溶出效应,硫酸铵替代EDTA,将20gL硫酸铵(氨水调pH)按1:4溶出UK,尿激酶等电点9.5,硫酸铵溶解尿激酶锌络合物,硫酸铵的选用 1)它在低浓度时可能有盐溶作用，促进沉淀蛋 白溶解； 2)因为本身有NH4+，与Zn 2+有络合作用，有 利于沉淀物溶解； 3)硫酸铵为盐析所用，在最终盐析中，只需补 加规定量即可，而不引入其他成分。,尿激酶盐析沉淀,沉淀量 回收率 纯度,目前国际上通用的血浆蛋白分离方法是采用传统的低温乙醇工艺，此工艺经多方验证和几十年的临床实践证明是安全、有效的。 利用乙醇的低介电常数性质以及不同蛋白质在一定温度、pH、离子强度及浓度下在不同浓度乙醇中溶解度不同来分离血浆蛋白，生产出多种血浆医用蛋白，成为著名的Cohn乙醇沉淀法 可将血浆蛋白分离为个组分。常利用(纤维蛋白原)、(免疫球蛋白)、(白蛋白)3个组分。,3、利用沉淀法大规模提纯血浆蛋白,利用沉淀法提纯白蛋白与免疫球蛋白,血浆,PH6/Pr5% I0.14 /T-4/E20%,过滤,过滤液IV 沉淀I+II+III,滤液IV 沉淀 (I+II+III),PH6/Pr2.4% I0.09 /T-5/E40%,过滤,沉淀 滤液V,PH4.8/Pr1.2%/ I0.09 T-7/E40%,沉淀V(白蛋白) 滤液,过滤,PH5.2/Pr1.0% I0.01 /T-4/E14%,过滤,沉淀 滤液,PH7.1/Pr0.4%/ I0.05 T-6/E25%,沉淀II(球蛋白) 滤液,过滤,4、胰蛋白酶的提取,