原核生物基因表达调控.ppt

原核生物 的基因表达调控,原核生物的基因表达调控,自然选择倾向于保留高效率的生命过程。 原核生物和单细胞真核生物直接暴露在变幻莫测的环境中，食物供应无保障，只有根据环境条件的改变合成各种不同的蛋白质，使代谢过程适应环境的变化，才能维持自身的生存和繁衍。因此，原核细胞都有一套准确地调节基因表达和蛋白质合成的机制。,原核生物的基因表达调控,每个大肠杆菌细胞有约20 000个核糖体，50种核糖体蛋白、糖酵解体系的酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等都是代谢过程中必需的，其合成速率不受环境变化或代谢状态的影响，这一类蛋白质被称为永久型（constitutive）合成的蛋白质。 另一类则被称为适应型或调节型（adaptive or regulated），因为这类蛋白质的合成速率明显地受环境的影响而改变。如大肠杆菌细胞中一般只有15个-半乳糖苷酶，但若将细胞培养在只含乳糖的培养基中，每细胞中这个酶的量可高达几万个分子。,原核生物的基因表达调控,细菌中所利用的大多数基本调控机制一般执行如下规律：一个体系在需要时被打开，不需要时被关闭。 这种“开-关”（on-off）活性是通过调节转录来建立的，也就是说mRNA的合成是可以被调节的。实际上，当我们说一个系统处于“off ”状态时，也可能有本底水平的基因表达，常常是每世代每个细胞只合成1或2个mRNA分子和极少量的蛋白质分子。为了方便，我们常常使用“off ”这一术语，但必须明白所谓“关”实际的意思是基因表达量特别低，很难甚至无法检测。,原核生物的基因表达调控,内容： 原核基因表达调控总论 乳糖操纵子与负控诱导系统 色氨酸操纵子与负控阻遏系统 其他操纵子 转录水平上其它调控 转录后调控,原核生物的基因表达调控,随着生物个体的发育，DNA分子能有序地将其所承载的遗传信息，通过密码子-反密码子系统转变成蛋白质，执行各种生理生化功能。 科学家把从DNA到蛋白质的过程称为基因表达 （gene expression） ，对这个过程的调节就称为基因表达调控（gene regulation，gene control）。 基因调控是现阶段分子生物学研究的中心课题。,原核生物的基因表达调控,基因表达调控主要表现在以下二方面： 转录水平上的调控 转录后水平上的调控： mRNA加工成熟水平调控 翻译水平调控 不同的生物使用不同的信号来指挥基因调控。 原核生物中，营养状况和环境因素对基因表达起着举足轻重的影响。 在真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平和发育阶段是基因表达调控的最主要手段，营养和环境因素的影响力下降。,原核生物的基因表达调控,在转录水平上对基因表达的调控决定于DNA的结构、RNA聚合酶的功能、蛋白因子及其他小分子配基的相互作用。 转录与翻译的特点： 细菌的转录与翻译过程几乎发生在同一时间间隔内，转录与翻译相耦联。 真核生物中，转录产物只有从核内运转到核外，才能被核糖体翻译成蛋白质。,原核生物的基因表达调控,1. 原核基因调控分类 原核生物的基因调控主要发生在转录水平上，根据调控机制的不同可分为负转录调控和正转录调控。 在负转录调控系统中，调节基因的产物是阻遏蛋白(repressor)。根据其作用特征又可分为负控诱导系统和负控阻遏系统二大类。 在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白(activator)。也可根据激活蛋白的作用性质分为正控诱导系统和正控阻遏系统。,原核生物的基因表达调控,2. 原核基因调控的主要特点： 原核生物通过特殊代谢物调节的基因活性主要分为可诱导和可阻遏两大类: 可诱导调节。是指一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。这类基因中最突出的例子是大肠杆菌的乳糖操纵子。 可阻遏调节。这类基因平时都是开启的，处在产生蛋白质或酶的工作过程中，由于一些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭，阻遏了基因的表达。比如大肠杆菌中的色氨酸操纵子。,原核生物的基因表达调控,3. 弱化子对基因活性的影响 在这种调节方式中，起信号作用的是有特殊负载的氨酰-tRNA的浓度，在色氨酸操纵子中就是色氨酰-tRNA的浓度。当操纵子被阻遏，RNA合成被终止时，起终止转录信号作用的那一段DNA序列被称为弱化子。 属于这种调节方式的有：大肠杆菌中的色氨酸操纵子、苯丙氨酸操纵子、苏氨酸操纵子、异亮氨酸操纵子和缬氨酸操纵子以及沙门氏菌的组氨酸操纵子和亮氨酸操纵子、嘧啶合成操纵子等等。,原核生物的基因表达调控,4. 降解物对基因活性的调节 有葡萄糖存在的情况下，即使在细菌培养基中加入乳糖、半乳糖、阿拉伯糖或麦芽糖等诱导物，与其相对应的操纵子也不会启动，不会产生出代谢这些糖的酶来，这种现象称为葡萄糖效应或称为降解物抑制作用。 降解物抑制作用是通过提高转录强度来调节基因表达的，是一种积极的调节方式。,原核生物的基因表达调控,5.细菌的应急反应 细菌有时会碰到紧急状况，比如氨基酸饥饿氨基酸的全面匮乏。细菌会产生一个应急反应停止包括生产各种RNA、糖、和蛋白质的几乎全部生物化学反应过程。 实施这一应急反应的信号是鸟苷四磷酸(ppGpp)和鸟苷五磷酸(pppGpp)。产生这两种物质的诱导物是空载tRNA。 当氨基酸饥饿时，细胞中便存在大量的不带氨基酸的tRNA，这种空载的tRNA会激活焦磷酸转移酶，使ppGpp大量合成。 ppGpp的出现会关闭许多基因，以应付这种紧急状况。 ppGpp 影响RNA聚合酶与这些基因转录起始位点的结合，使基因被关闭。 ppGpp与pppGpp的作用范围十分广泛，它们影响一大批操纵子而被称为超级调控因子。,原核生物的基因表达调控,原核生物的基因表达调控,操纵子=调控序列+转录单位,乳糖操纵子模型,大肠杆菌能利用乳糖作为碳源，而利用乳糖作为碳源的酶只有当乳糖成为惟一的碳源时才会被合成。 大肠杆菌乳糖操纵子（lactose operon）包括3个结构基因：Z、Y和A，以及启动子、控制子和阻遏子等。转录的调控是在启动区和操纵区进行的。,乳糖操纵子模型,P为启动子，O为操纵区，lac I 编码阻遏子 3个结构基因各决定一种酶：Z编码-半乳糖苷酶；Y编码-半乳糖苷透过酶；A编码-半乳糖苷乙酰基转移酶。 -半乳糖苷酶是一种-半乳糖苷键的专一性酶，除能将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，还能水解其他-半乳糖苷（如苯基半乳糖苷）。 -半乳糖苷透过酶的作用是使外界的-半乳糖苷透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。 -半乳糖苷乙酰基转移酶的作用是把乙酰辅酶A上的乙酰基转移到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。,乳糖操纵子模型,1. 酶的诱导lac 体系受调控的证据 一般情况下，lac+基因型大肠杆菌细胞内-半乳糖苷酶和透过酶的浓度很低，每个细胞只有12个酶分子。但是，在乳糖培养基上酶的浓度很快达到细胞总蛋白量的6%或7%，超过105个酶分子lac mRNA/细胞。 在无葡萄糖有乳糖的培养基中，lac+细菌中将同时合成-半乳糖苷酶和透过酶。,乳糖操纵子模型,1. 酶的诱导lac体系受调控的证据 用32P标记的mRNA与模板DNA进行定量分子杂交，表明培养基中加入乳糖12分钟后，编码-半乳糖苷酶和透过酶的lac mRNA量就迅速增加，去掉乳糖后，量立即下降。,乳糖操纵子模型,1. 酶的诱导lac体系受调控的证据 实验室常用两种乳糖类似物异丙基巯基半乳糖苷（IPTG）和巯甲基半乳糖苷（TMG），在酶活性分析中常用发色底物O-硝基半乳糖苷（ONPG）。因为它们都不是半乳糖苷酶的底物，所以又称为安慰性诱导物。,乳糖操纵子模型,2.1. lac操纵子的本底水平表达 两个矛盾： 诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合，而转运诱导物需要转运酶，转运酶的合成有需要诱导。 人们发现乳糖并不与阻遏物相结合，真正诱导物是异构乳糖，而后者是在-半乳糖苷酶的催化下由乳糖形成的。 解释：在没有诱导物的情况下，转运酶和-半乳糖苷酶仍有本地水平的表达。阻遏物的结合并非绝对紧密，偶尔会掉下，使得转录可以进行。表达量足以使诱导过程得以启动。,乳糖操纵子模型,2.2. 大肠杆菌对乳糖的反应 在以甘油为碳源的培养基中 加乳糖以前，lac操纵子本底水平表达 加乳糖后，阻遏物失活，mRNA大量表达 乳糖耗尽，阻遏物浓度逐渐大于异构乳糖，阻遏状态重新形成，mRNA水平下降。 -半乳糖苷酶半衰期长，其活性下降滞后。,乳糖操纵子模型,2.3. 阻遏物lacI基因产物及功能 lac操纵子阻遏物mRNA是由弱启动子控制下永久型合成的，该阻遏蛋白有4个相同的亚基，每个亚基均含有347个氨基酸残基，并能与1分子IPTG结合,每个细胞中有510个阻遏物分子。 Lac I 基因由弱启动子变为强启动子，细胞内将不可能产生足够的诱导物来克服阻遏状态，整个lac操纵子在这些突变体中将不可诱导。,乳糖操纵子模型,2.3. 阻遏物lacI基因产物及功能 lac操纵子阻遏物mRNA是由弱启动子控制下永久型合成的，该阻遏蛋白有4个相同的亚基，每个亚基均含有347个氨基酸残基，并能与1分子IPTG结合,每个细胞中有510个阻遏物分子。 Lac I 基因由弱启动子变为强启动子，细胞内将不可能产生足够的诱导物来克服阻遏状态，整个lac操纵子在这些突变体中将不可诱导。,乳糖操纵子模型,2.4. 葡萄糖对lac操纵子影响 -半乳糖苷酶在乳糖代谢中的作用是把前者分解成葡萄糖及半乳糖。如果将葡萄糖和乳糖同时加入培养基中，大肠杆菌在耗尽外源葡萄糖之前不会诱发lac操纵子。,某大肠杆菌突变体，它不能将葡萄糖-6-磷酸转化为下一步代谢中间物，该细菌的lac基因能在葡萄糖存在时被诱导合成。所以，不是葡萄糖而是它的某些降解产物抑制lac mRNA的合成，科学上把葡萄糖的这种效应称之为代谢物阻遏效应。,乳糖操纵子模型总结,分解代谢酶系的诱导表达,乳糖操纵子模型,2.5. cAMP与代谢物激活蛋白 cAMP是在腺苷酸环化酶的作用下由ATP转变而来的，在真核生物的激素调节过程中也起着十分重要的作用。,将细菌放在含葡萄糖的培养基中培养，cAMP的浓度就低；如果培养基中只有甘油或乳糖等不进行糖酵解途径的碳源，cAMP的浓度就会很高。,乳糖操纵子模型,2.5. cAMP与代谢物激活蛋白 大肠杆菌中的代谢物激活蛋白，由Crp基因编码，能与cAMP形成复合物。CRP和cAMP都是合成lac mRNA所必需的，cAMP-CRP是一个不同于阻遏物的正调控因子，而lac操纵子的功能是在这两个相互独立的调控体系作用下实现的。 半乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖、山梨醇等在降解过程中均转化成葡萄糖或糖酵解途径中的其他中间产物，这些糖代谢中有关的酶都是由可诱导操纵子控制的，被称为降解物敏感型操纵子，由cAMP-CRP调控。,乳糖操纵子模型,cAMP-CRP复合物与启动子区的结合是lac mRNA合成起始所必需的，因为这个复合物结合于启动子上游，能使DNA双螺旋发生弯曲，有利于形成稳定的开放型启动子-RNA聚合酶结构。阻遏物则是一个抗解链蛋白，阻止形成开放结构，从而抑制RNA聚合酶的功能。,乳糖操纵子与碳源供应,cAMP的诱导表达(葡萄糖降解物的阻遏表达),色氨酸操纵子模型,trp体系参与生物合成，它不受葡萄糖或cAMP-CRP的调控。色氨酸合成主要分5步完成，有7个基因参与整个合成过程。 操纵子中各基因功能： trpE和trpG编码邻氨基苯甲酸合酶， trpD编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶， trpF编码异构酶， trpC编码吲哚甘油磷酸合酶， trpA和trpB则分别编码色氨酸合酶的和亚基。 在许多细菌中，trpE和trpG，trpC和trpB分别融合成一个基因，产生具有双重功能的蛋白质。,色氨酸操纵子模型,色氨酸操纵子模型,trpE基因是第一个被翻译的基因，与紧邻的是启动子区和操纵区。前导区和弱化子区分别定名为trpL和trpa。 trp操纵子中产生阻遏物的基因是trpR，该基因距trp基因簇很远。后者位于大肠杆菌染色体图上25分钟处，而前者则位于90分钟处。在位于65分钟处还有一个trpS（色氨酸tRNA合成酶），它与携带有色氨酸的tRNATrp共同参与trp操纵子的调控作用。,色氨酸操纵子模型,1. trp操纵子的阻遏系统 trpR基因突变常引起trp mRNA的永久型合成，该基因产物因此被称为辅阻遏蛋白（aporepressor）。除非培养基中有色氨酸，否则这个辅阻遏蛋白不会与操纵区结合。辅阻遏蛋白与色氨酸相结合形成有活性的阻遏物，与操纵区结合并关闭trp mRNA转录。 效应物分子色氨酸是trp操纵子所编码的生物合成途径的末端终产物。 当培养基中色氨酸含量较高时，它与游离的辅阻遏蛋白相结合，并使之与操纵区DNA紧密结合；当培养基中色氨酸供应不足时，辅阻遏物失去色氨酸并从操纵区上解离，trp操纵子去阻遏。,色氨酸操纵子模型,2. 弱化子与前导肽 在trp mRNA 5端有一个长162bp的mRNA片段被称为前导区，其中123150位碱基序列如果缺失，trp基因表达可提高6-10倍。mRNA合成起始以后，除非培养基中完全没有色氨酸，转录总是在这个区域终止，产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子，终止trp基因转录。这个区域被称为弱化子，该区mRNA可通过自我配对形成茎-环结构。,色氨酸操纵子模型,2. 弱化子与前导肽 前导肽 分析前导序列发现，它包括起始密码子AUG和终止密码子UGA，能产生一个含有14个氨基酸的多肽，这个假设的多肽被称为前导肽。 在前导序列的第10和第11位上有相邻的两个色氨酸密码子。组氨酸操纵子含有7个相邻的组氨酸密码子，苯丙氨酸操纵子也有7个苯丙氨酸密码子，这些密码子参与了操纵子中的转录弱化机制。,色氨酸操纵子模型,2. 弱化子与前导肽 mRNA前导区的序列分析 trp前导区的碱基序列已经全部测定，引人注目的是其中4个分别以1、2、3和4表示的片段能以两种不同的方式进行碱基配对，有时以1-2和3-4配对，有时只以2-3方式互补配对。,终止构型,抗终止构型,色氨酸操纵子模型,2. 弱化子与前导肽 mRNA前导区的序列