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细胞原代培养,一、组织块培养法,实验目的,原代培养方法之一：组织块法,设备与器材,设备 器械 试剂 材料,超净工作台,设备与器材,设备 器械 试剂 材料,培养箱,CO2,设备与器材,设备 器械 试剂 材料,倒置显微镜,设备与器材,设备 器械 试剂 材料,水浴锅,设备与器材,设备 器械 试剂 材料,解剖器材,设备与器材,设备 器械 试剂 材料,玻璃器皿,设备与器材,设备 器械 试剂 材料,其它器材,设备与器材,设备 器械 试剂 材料,液与培养液,PBS,设备与器材,设备 器械 试剂 材料,小牛血清,设备与器材,设备 器械 试剂 材料,怀孕大白鼠,培养要点,一）材料新鲜 二）严格无菌操作 三）剔除脂肪等附着组织 四）组织块剪小（直径5mm）,操作演示,处死 解剖 冲洗 剪碎 培养 观察,击头致死,操作演示,处死 解剖 冲洗 剪碎 培养 观察,酒精浸泡,操作演示,处死 解剖 冲洗 剪碎 培养 观察,送入无菌室,操作演示,处死 解剖 冲洗 剪碎 培养 观察,再次消毒,操作演示,处死 解剖 冲洗 剪碎 培养 观察,剪开皮肤、腹肌、腹膜,操作演示,处死 解剖 冲洗 剪碎 培养 观察,取出胎鼠,操作演示,处死 解剖 冲洗 剪碎 培养 观察,挑开胎鼠腹腔取出肝组织,操作演示,处死 解剖 冲洗 剪碎 培养 观察,PBS液冲洗（45次）,操作演示,处死 解剖 冲洗 剪碎 培养 观察,剔除其它组织,操作演示,处死 解剖 冲洗 剪碎 培养 观察,PBS液再次冲洗,操作演示,处死 解剖 冲洗 剪碎 培养 观察,剪碎肝组织,操作演示,处死 解剖 冲洗 剪碎 培养 观察,将组织移入培养瓶,操作演示,处死 解剖 冲洗 剪碎 培养 观察,加入培养液37C培养,操作演示,处死 解剖 冲洗 剪碎 培养 观察,一天后倒置显微镜观察,初学者易犯的错误,操作中不更换器械 冲洗次数不够 组织碎片太大 组织块摆放太密 培养液加入太多,初学者易犯的错误,操作中不更换器械 冲洗次数不够 组织碎片太大 组织块摆放太密 培养液加入太多,初学者易犯的错误,操作中不更换器械 冲洗次数不够 组织碎片太大 组织块摆放太密 培养液加入太多,初学者易犯的错误,操作中不更换器械 冲洗次数不够 组织碎片太大 组织块摆放太密 培养液加入太多,初学者易犯的错误,操作中不更换器械 冲洗次数不够 组织碎片太大 组织块摆放太密 培养液加入太多,二、消化培养法,实验目的,掌握消化法培养原代细胞的步骤,设备与器材,设备、器械、试剂、材料都与原代培养基本相同。 新需试剂有,胰蛋白酶液,设备与器材,血球计数板、器,培养要点,肝组织剪碎至1mm左右。 合适的胰蛋白酶浓度（通常为0.25%） 合适的消化时间：消化时，待组织块变得较疏松，颜色暗白为止（通常为37C 2040分钟之间）,实验材料，前期步骤同细胞原代培养。 将剪碎的鼠肝脏组织进行消化,操作演示,加胰蛋白酶液消化,准备 取材 剪碎冲洗 消化 过滤 离心 加培养液 计数 分装培养 观察,操作演示,37C水浴锅内消化,准备 取材 剪碎冲洗 消化 过滤 离心 加培养液 计数 分装培养 观察,操作演示,过滤,准备 取材 剪碎冲洗 消化 过滤 离心 加培养液 计数 分装培养 观察,操作演示,平衡、离心,准备 取材 剪碎冲洗 消化 过滤 离心 加培养液 计数 分装培养 观察,操作演示,弃胰蛋白酶液，加入培养液,准备 取材 剪碎冲洗 消化 过滤 离心 加培养液 计数 分装培养 观察,操作演示,细胞浓度以5x10 为宜。,准备 取材 剪碎冲洗 消化 过滤 离心 加培养液 计数 分装培养 观察,5,操作演示,分装,准备 取材 剪碎冲洗 消化 过滤 离心 加培养液 计数 分装培养 观察,操作演示,培养,准备 取材 剪碎冲洗 消化 过滤 离心 加培养液 计数 分装培养 观察,操作演示,24小时后倒置显微镜下观察,准备 取材 剪碎冲洗 消化 过滤 离心 加培养液 计数 分装培养 观察,初学者易犯的错误,水浴锅未预热 组织块太大 胰蛋白酶消化 不足或过度 吹打用力过度,初学者易犯的错误,水浴锅未预热 组织块太大 胰蛋白酶消化 不足或过度 吹打用力过度,初学者易犯的错误,水浴锅未预热 组织块太大 胰蛋白酶消化 不足或过度 吹打用力过度,初学者易犯的错误,水浴锅未预热 组织块太大 胰蛋白酶消化 不足或过度 吹打用力过度,细胞传代培养,实验目的,细胞在原培养瓶内分离稀释后传到新培养瓶的操作叫传代。要获得稳定的细胞株或得到大量同种细胞，当培养细胞形成致密的单层后需要进行传代培养。,实验材料,培养瓶里已长成单层的细胞,演示操作,传代前准备,1.预热培养用液,2.用75%酒精擦拭双手和工作台面,3.摆放使用器械,4.点燃酒精灯,5.取出已预热的培养用液,6.从培养箱中取出细胞,7.各种器皿火焰消毒,演示操作,传代前准备 胰蛋白酶消化,1.加入消化液,2.显微镜下观察细胞,3.吸弃消化液，加入培养液,演示操作,传代前准备 胰蛋白酶消化 吹打分散细胞,1.吹打制悬,2.吸细胞悬液入离心管,3.平衡离心,4. 弃上清液，加入新培养液,演示操作,传代前准备 胰蛋白酶消化 吹打分散细胞 分装稀释细胞,1.分装,2.显微镜下观察细胞,演示操作,传代前准备 胰蛋白酶消化 吹打分散细胞 分装稀释细胞 继续培养,用酒精棉球擦拭培养瓶，旋松瓶口，放入CO2培养箱中培养。,注意事项,严格无菌操作,污染细胞,未污染细胞,瓶口碰到酒精灯 X,手在瓶口上方移动 X,注意事项,严格无菌操作 适度消化,未消化细胞,细胞消化过程,细胞计数,实验目的,学习并掌握培养细胞数目的测定方法 学会使用血球计数板,设备与器材,设备、器械、试剂、材料都与传代培养基本相同。 新需试剂有,设备与器材,光学显微镜,设备与器材,台盼蓝,0.4%,实验原理,当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中细胞的数目，即可换算出每毫升悬液中的细胞数目。,操作演示,准备工作,取一瓶传代的细胞，按传代细胞培养方法（消化法）介绍的方法繁殖细胞，待长成单层后以备使用。,操作演示,准备工作 细胞悬液的制备,用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液，PBS等平衡溶液），吹打制成待测细胞悬液。,操作演示,准备工作 细胞悬液的制备 细胞计数,盖好盖玻片,制备计数用的细胞悬液,将细胞悬液滴入计数板,统计四个大格的细胞数,计算细胞悬液细胞数,操作演示,准备工作 细胞悬液的制备 细胞计数 细胞计数要点,初学者易犯的错误,未将悬液吹打均匀X,初学者易犯的错误,未将悬液吹打均匀X 盖玻片下有气泡X,初学者易犯的错误,未将悬液吹打均匀X 盖玻片下有气泡X 细胞悬液流入槽中X,细胞冻存,实验目的,学习掌握细胞冻存技术 了解培养细胞的运输方法,设备、器械和试剂,设备、器械、试剂、材料都与原代培养基本相同。 新需器材、试剂有,液氮罐,-20C冰箱,-80C冰箱,冻存细胞登记本,手套、冻存管等,甘油、二甲亚砜,实验原理,细胞培养的需要,实验原理,细胞培养的需要 直接冷冻的危害,冰晶形成,实验原理,细胞培养的需要 直接冷冻的危害 细胞冻存的原则,加保护剂：甘油或二甲亚砜（DMSO）可使细胞内冰点下降：膜透性增加。 缓慢冷冻：细胞内水份逐步均匀的减少，避免冰晶大量形成。,冻存方案,标准方案,室温 -25C ： 降温速率是12C/min； 25 -100C： 降温速率是510C/min； -100C以下： 直接放入液氮中。,标准冻存方案,冻存方案,标准方案 简易冻存方案,简易冻存方案,冻存管用厚棉花分隔，放入盒子中； 置于-20C冰箱内2小时； 立即转入-80C冰箱内4小时； 再迅速置入-196C液氮内长期保存。,操作演示,细胞冻存,细胞冻存,一、筛选细胞,1、观察细胞,2、做标记,3、换培养液,细胞冻存,一、筛选细胞 二、细胞消化（第二天）,细胞消化 方法同传代培养细胞消化。,细胞冻存,一、筛选细胞 二、细胞消化（第二天） 三、细胞离心,细胞离心 按传代培养离心标准，收集细胞。,细胞冻存,一、筛选细胞 二、细胞消化（第二天） 三、细胞离心 四、细胞计数,细胞计数,细胞冻存,一、筛选细胞 二、细胞消化（第二天） 三、细胞离心 四、细胞计数 五、分装细胞,1、弃去上清液,2、加入冻存液,3、装入冻存管,4、用棉花包装,细胞冻存,一、筛选细胞 二、细胞消化（第二天） 三、细胞离心 四、细胞计数 五、分装细胞 六、简易冻存,1、-20C冰箱预冻,2、-80C冰箱预冻,3、作好标签,4、液氮罐中冻存,5、登记入册,冻存注意事项,细胞复苏,实验目的,掌握细胞复苏的方法,设备、器械和试剂,同上述细胞冻存,实验原则,操作演示,一、实验前准备,查找电脑上细胞记录,冻存本上查找细胞,水浴锅37C预热,操作演示,一、实验前准备 二、取出冻存管,寻找标签,取出冻存管,操作演示,一、实验前准备 二、取出冻存管 三、迅速解冻,在水浴锅内迅速解冻,酒精棉球擦拭冻存管,操作演示,一、实验前准备 二、取出冻存管 三、迅速解冻 四、平衡离心,平衡离心 按传代培养离心标准，收集细胞。,操作演示,一、实验前准备 二