微生物生理学.ppt

第一节 微生物生理学研究对象和范围,一、研究对象,微生物生理学（microbial physiology）的研究对象是微生物，它是微生物的一个重要分支，是从生理生化的角度研究微生物细胞的形态结构和功能、新陈代谢、生长繁殖等微生物生命活动规律的学科。,1. 19世纪70年代以后，随着人们对酿酒、动植物病害、人类疾病的防治和土壤微生物活动等的研究，微生物生理学逐渐兴盛起来。 1905年，哈登和杨发现磷酸盐对酒精发酵的作用； 1911年，诺伊贝格开始对酒精发酵作系统研究；20世纪30年代，生物化学的进展又推动了人们对微生物代谢的研究。 2. 随后，克勒伊沃和范尼尔等人从比较生物化学的角度，说明了某些微生物的相互关系和生理学问题。 1933年，克勒伊沃建立了摇床培养技术，导致现代化微生物工业深层培养的生理研究和应用。 3.同时，同位素、电子显微镜、超速离心、微量快速生物化学分析以及生物化学突变株等技术的普遍应用，也推动了微生物生理学研究的发展。,二、微生物生理学的发展过程,4.随着分子生物学的发展，微生物生理学的研究不断地深入到，细胞中的生物化学转化、能量的产生和转换；生物大分子的结构与功能；分子水平上的形态建成、分化及其行为等方面的研究方面。 5.近年来，微生物生理学的研究扩展到了新的或过去不引人注意的微生物类群和可更新能源方面，这使人们对分解纤维素微生物和甲烷产生菌的生理进行深入的考察，并从化能自养菌的研究扩展到利用硫杆菌进行微生物浸矿。 6.另外微生物与其他生物之间的共生、寄生关系是人们多年来一直注意的领域，尤其是共生固氧的研究已有较大的进展。能使石油氧化、农药降解和人工合成的高分子物质分解的微生物，也越来越多地成为人们研究的对象。总之，每一新菌属和新现象的发现，都将为微生物生理学研究提供新的对象，开辟新的领域。,第二节 微生物生理学研究中常用的技术和方法,1.电子显微镜技术 6.层析技术 2.DNA分子铺展技术 7.电泳技术 3.超离心技术 8.电位、电势、极谱技术 4.光谱技术 5.同位素技术,微生物生理学研究内容： 1.生物化学方面 研究微生物代谢、产物合成途径、能量转化等；研究一些特殊类型微生物的生理活动。 2.研究生物大分子结构与功能 阐明微生物遗传信息传递与表达的方式和规律，研究膜结构和功能；极端环境条件下微生物抗性与敏感性的机理及其调节等。 3.研究微生物细胞的重建、形态发生、分化过程与趋向性 研究运动的本质、形态发生与分化的分子机理及有生物活性细胞结构的过程。,第三章 微生物的营养与物质运输,一、营养物质本身的性质 细胞膜的结构决定了不同的物质透过膜的难易程度有差异，物质的化学特性包括分子量、溶解性、电负性、极性等都影响营养物进入细胞的难易程度。 小分子大分子、脂溶性水溶性、不带电荷带电荷物质,二、环境条件 1.温度 2.pH 3.代谢和呼吸的抑制剂 4.通透性诱导物与被运输物质的结构类似物。 三、载体物质生物合成调节,在酶的作用下HPr被激活,在酶的作用下P-HPr将磷酸转移给糖,运送机制:是依靠磷酸转移酶系统,即磷酸烯醇式丙酮酸-己糖磷酸转移酶系统. 运送步骤: 1.热稳载体蛋白(HPr)的激活 细胞内高能化合物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的磷酸基团把HPr激活。 酶 PEP+HPr 丙酮酸+P-HPr HPr是一种低分子量的可溶性蛋白，结合在细胞膜上，具有高能磷酸载体的作用。,2、糖被磷酸化后运入膜内 膜外环境中的糖先与外膜表面的酶结合，再被转运到内膜表面。这时，糖被P-HPr上的磷酸激活，并通过酶的作用将糖-磷酸释放到细胞内。 酶 P-HPr+糖 糖-P +HPr 酶是一种结合于细胞膜上的蛋白，它对底物具有特异性选择作用，因此细胞膜上可诱导出一系列与底物分子相应的酶 。,大肠杆菌己糖磷酸运输系统生物合成调节中有两种蛋白在起作用： 1.存在于细胞质中的活化蛋白A； 2.位于细胞膜上的转膜调节蛋白MR。,外 膜 内,外 膜 内,MR C A,MR C,A,G-6-P,四、载体物质生理活性调节 1.膜电势调节 2.胞内磷酸糖调节 3.cAMP环化酶与渗透酶的共同调节,PEP,Pyr,HPr,HPr,-Pi,-Pi,RPr,RPr,RPr,Pase,Pase,-Pi,AC,RPr,-Pi,AC,无活性,有活性,无活性,有活性,乳糖渗透酶与腺苷酸环化酶的协调作用,第四节 代谢产物的分泌,一、氨基酸的分泌,表3-10 乳酸发酵短杆菌细胞内磷脂含量与谷氨酸分泌的关系,谷氨酸发酵控制 生物素：作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA的辅酶，参与脂肪酸的生物合成，进而影响磷酯的合成。 当磷酯含量减少到正常时的一半左右时，细胞发生变形，谷氨酸能够从胞内渗出，积累于发酵液中。生物素过量，则发酵过程菌体大量繁殖，不产或少产谷氨酸，代谢产物中乳酸和琥珀酸明显增多。,O,=,C,HN,NH,HC,CH,H2C,C,S,H,（CH2）4,C,NH,BCCP赖氨酸残基,生物素羧基载体蛋白 （biotin carboxyl carrier protein BCCP）,生物素,O,=,H,OH,+,H2O,ATP,ADP,CO2,生物素羧化酶,-,酶,BCCP-羧基生物素,BCCP-羧基生物素在转羧酶作用下，形成丙二酰CoA 丙二酰CoA与乙酰CoA缩合并脱羧，生成丁酰CoA，如此反复进行合成高级脂肪酸，再合成磷脂 生物素不足时，就抑制了不饱和脂肪酸的生成，从而影响了磷脂的生成，导致磷脂含量不足，使细胞膜结构不完全，从而提高细胞膜的通透性,怎样克服生物素过量带来的问题,为了控制生物素的数量，除了选用的菌种必须是生物素缺陷型以外，所用的原料（主要是玉米浆）每批都要通过摇床实测后确定加入量。当前还有一些措施可以使用。,A、 选用油酸缺陷型： 在大量的研究工作中，发现了这样的现象，即培养基中缺乏生物素时，只要加入油酸，就能起到和生物素相同的效果。 如上所述，生物素的作用在于影响细胞膜中的脂肪酸，而油酸的加入直接增加了合成磷脂所需的不饱和脂肪酸，所以选育油酸缺陷型就成为了重要的替代手段。当选用油酸缺陷型时，只要控制油酸的亚适量，就能控制细胞膜的透性，而与生物素的含量无关。,B 、选用甘油缺陷型： 试验证明，限量甘油（0.02%）培养，细胞膜的磷脂含量只有非甘油缺陷型菌株的50%。只有甘油的加入量起作用，而与生物素以及油酸的含量无关。 这些现象都可以解释一个问题，那就是因为磷脂是由脂肪酸、甘油、磷酸和R（胆碱、乙醇酸、丝氨酸、肌醇）4部分组成，缺少其中的一个都不可能和成，控制其中之一，都可以控制磷脂的含量。 图6-4,C、温度敏感性变异株： 当细菌进行诱变处理后，可以获得温度敏感性变异株。例如在30C时生长旺盛，而在较高温度（37C ）则不生长，或稍生长，而能大量生成谷氨酸。于是可用这样的变异株在富含生物素的培养基中，前期进行30C培养，当菌的生长达到最大时，提高温度至40C ，使其大量积累谷氨酸。,D、 在生物素丰富的条件下，添加聚氧乙烯乙二醇的棕榈酸（C18）、十七烷酸（C17）、硬脂酸（C16）等的饱和脂肪酸酯类或饱和脂肪酸，都能使大量谷氨酸排出于菌体外。 表面活性剂、高级饱和脂肪酸的作用，不在于它的表面效果，而是在不饱和脂肪酸的合成过程中，作为抗代谢物具有抑制作用，对生物素或油酸又拮抗作用，阻遏脂肪酸生物合成，于是磷脂形成减少，膜透性加大，有利于谷氨酸向外渗漏。,E、在生物素丰富时，培养中途如果添加青霉素、头孢霉素C，可以使谷氨酸生成。青霉素的作用机制与控制生物素、控制油酸或添加表面活性剂以及控制甘油的机制都不同。 添加青霉素是抑制细菌细胞壁的后期合成，对细胞壁糖肽生物合成系统起作用。这是因为青霉素取代合成糖肽的底物而和酶的活性中心结合，使网状结构连接不起来，结果形成不完全的细胞壁。没有细胞壁保护的细胞膜由于膜内外的渗透压差，是细胞膜受到机械损伤，失去了作为渗透障碍物的作用，从而使谷氨酸排出。另一种解释是：青霉素虽不能抑制磷脂的合成，但能造成磷脂向胞外分泌。表6-5,CH2OH,O,CH2OH,O,O,O,CH3-CH-C=O,NH,C,CH3,H,C=O,NH,C,H,-OOC,（CH2）2,C=O,C=O,NH,C,(CH2)4,H,OH,NH,C,=,O,CH3,NH,C,=,O,CH3,L-Ala,D-Glu,NH3+,NH,C,CH3,H,C=O,L-Lys,D-Ala,（Gly）5,NAM,NAG,肽聚糖结构,N,H,二、核苷酸的分泌 核苷酸不容易分泌到细胞外。Mn2+对产氨短杆菌核苷酸分泌起关键作用。 Mn2+可引起细胞形态变化，在肌苷-磷酸（IMP）发酵中，控制Mn2+限量，造成细胞膨胀，呈不规则型，膜产生异常，膜通透性被破坏，IMP、Hx和R-5-P都分泌于体外；当Mn2+过量时，菌体呈小球状，抑制这些物质的分泌。,三、胞外酶的分泌,第四章 异养微生物的生物氧化,第五章 自养微生物的生物氧化,第六章 微生物的合成代谢,一、微生物代谢过程中的自我调节,微生物代谢调节系统的特点：精确、可塑性强，细胞水平的代谢调节能力超过高等生物。 成因：细胞体积小，所处环境多变。 举例：大肠杆菌细胞中存在2500种蛋白质，其中上千种是催化正常新陈代谢的酶。每个细菌细胞的体积只能容纳10万个蛋白质分子，所以每种酶平均分配不到100个分子。如何解决合成与使用效率的经济关系？ 解决方式：组成酶（constitutive enzyme）经常以高浓度存在，其它酶都是诱导酶（inducible enzyme），在底物或其类似物存在时才合成，诱导酶的总量占细胞总蛋白含量的10%。,第七章 微生物代谢调节,Plac,工业发酵的目的：大量积累人们所需要的微生物代谢产物。 代谢的人工控制：人为地打破微生物的代谢控制体系，使代谢朝着人们希望的方向进行。 人工控制代谢的手段： 改变微生物遗传特性(遗传学方法）； 控制发酵条件（生物化学方法）； 改变细胞膜透性；,第一节 代谢调节的部位,一、控制营养物质透过细胞膜进入细胞 二、通过酶的定位控制酶与底物的接触 三、控制代谢物流向:,一、细胞（及细胞器）膜,1）细胞膜既是溶质进出细胞的主要屏障，有是养分吸收和分泌的通道。通过对透性酶本身的合成控制以及ATP的供应，可以调节基质的输入。中间产物的透性，可以通过控制环境条因素，影响膜双分子层中的磷脂和细菌细胞壁的肽聚糖的形成来调节。 2）真核微生物膜密切相关的调节有： 环境条件对膜脂理化性质的影响； 膜蛋白质的绝对数量及其活性的调节； 跨膜的电化学梯度以及ATP、ADP、AMP体系及无机磷浓度对溶质输送的调节。 细胞壁结构的部分破坏或变形，间接影响到膜对溶质的通透性。,1.控制营养物质透过细胞膜进入细胞 如：只有当速效碳源或氮源耗尽时，微生物才合成迟效碳源或氮源的运输系统与分解该物质的酶系统。,二、酶本身,1.调节酶的生成量 基因水平调节 2.调节酶的活性 分子水平调节,1)可逆反应途径由同种酶催化，可由不同辅基或辅酶控制代谢物流向：如: 两种Glu脱氢酶：以NADP为辅基 Glu合成 以NAD为辅基 Glu分解 2)通过调节酶的活性或酶的合成量。 关键酶: 某一代谢途径中的第一个酶或分支点后的第一个酶。 粗调：调节酶的合成量 细调：调节现有酶分子的活性 3)通过调节产能代谢速率。,控制代谢物流向：( 通过酶促反应速度来调节),三、酶与底物的相对位置及间隔状况,1）真核微生物酶定位在相应细胞器上；细胞器各自行使某种特异的功能； 2）原核微生物在细胞内划分区域集中某类酶行使功能： 与呼吸产能代谢有关的酶位于膜上； 蛋白质合成酶和移位酶位于核糖体上； 同核苷酸吸收有关的酶在G-菌的周质区。,第二节 酶活性的调节,通过改变现成的酶分子活性来调节新陈代谢的速率的方式。是酶分子水平上的调节，属于精细的调节。 （一）调节方式：包括两个方面： 1、酶活性的激活：在代谢途径中后面的反应可被较前面的反应产物所促进的现象；常见于分解代谢途径。 如：粗糙脉孢霉的异柠檬酸脱氢酶的活性受柠檬酸促进 2、酶活性的抑制：包括：竞争性抑制和反馈抑制。 反馈：指反应链中某些中间代谢产物或终产物对该途径关键酶活性的影响。 凡使反应速度加快的称正反馈； 凡使反应速度减慢的称负反馈（反馈抑制）； 反馈抑制主要表现在某代谢途径的末端产物过量时可反过来直接抑制该途径中第一个酶的活性。主要表现在氨基酸、核苷酸合成途径中。 特点：作用直接、效果快速、末端产物浓度降低时又可解除,如：天门冬氨酸转氨甲酰酶受ATP激活，受CTP抑制（终产物）。 大肠杆菌糖代谢过程中，许多酶都有激活剂和抑制剂（表3-1）。共同控制糖代谢。,二、酶活性调节的方式,1.终产物抑制与激活 2.底物水平的抑制与激活 3.辅助因子的调节 4.酶原的激活 5.潜在酶的激活,1.无分支途径的调节方式,（1）前馈作用（feedforword）指的是在代谢途径中前面的底物对其后某一催化反应的酶又作用。该作用可以是对酶活性的抑制或激活。 （2）终产物抑制 反馈抑制主要表现在某代谢途径的末端产物过量时可反过来直接抑制该途径中第一个酶的活性。主要表现在氨基酸、核苷酸合成途径中。 （3）补偿性激活 分支代谢途径中，当某一终产物的合成需要两种前体时，另一前体物的大量存在可能激活受终产物抑制的酶的活性。,1.协同反馈抑制concerted feedback inhibition,定义：分支代谢途径中几个末端产物同时过量时才能抑制共同途径中的第一个酶的一种反馈调节方式。 举例：谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum） 多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa） 天冬氨酸族氨基酸合成中天冬氨酸激酶受赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制和阻遏。,二、分支代谢途径的调节方式,天冬氨酸 E,R 4-磷酸天冬氨酸 E 天冬氨酸半醛 E,R E 二氢吡啶二羧酸 同型丝氨酸 同型丝氨酸磷酸 E,R R O-琥珀酰同型丝氨酸 苏氨酸 E,R 六氢吡啶二羧酸 胱硫醚 2-酮丁酸 R 二氨基庚二酸 同型半胱氨酸 R 赖氨酸 甲硫氨酸 异亮氨酸,天冬氨酸族 （谷氨酸棒杆菌）,2.积累反馈抑制cumulative feedback inhibition,定义：每一分支途径末端产物按一定百分比单独抑制共同途径中前面的酶，所以当几种末端产物共同存在时它们的抑制作用是积累的，各末端产物之间既无协同效应，亦无拮抗作用。,3.合作反馈抑制cooperative feedback inhibition,定义：两种末端产物同时存在时，共同的反馈抑制作用大于二者单独作用之和。 举例：在嘌呤核苷酸合成中，磷酸核糖焦磷酸酶受AMP和GMP （和IMP）的合作反馈抑制，二者共同存在时，可以完全抑制该酶的活性。而二者单独过量时，分别抑制其活性的70%和10%。,（5）顺序反馈抑制sequential feedback inhibition,一种终产物的积累,导致前一中间产物的积累，通过后者反馈抑制合成途径关键酶的活性，使合成终止。 举例：枯草芽孢杆菌芳香族氨基酸合成的调节,5.同功酶调节isoenzyme,定义：催化相同的生化反应，而酶分子结构有差别的一组酶。 意义：在一个分支代谢途径中，如果在分支点以前的一个较早的反应是由几个同功酶催化时，则分支代谢的几个最终产物往往分别对这几个同功酶发生抑制作用。某一产物过量仅抑制相应酶活，对其他产物没影响。 举例：大肠杆菌的天冬氨酸族氨基酸合成的调节,天冬氨酸族,天冬氨酸 E,R III I E,R 4-磷酸天冬氨酸 E 天冬氨酸半醛 E,R II I E 二氢吡啶二羧酸 同型丝氨酸 同型丝氨酸磷酸 E,R R O-琥珀酰同型丝氨酸 苏氨酸 E,R 六氢吡啶二羧酸 胱硫醚 2-酮丁酸 R 二氨基庚二酸 同型半胱氨酸 R 赖氨酸 甲硫氨酸 异亮氨酸,（1）平衡合成,在黄色短杆菌（Brevibacterium flavus）中天冬氨酸的合成 PEP Py 草酰乙酸 乙酰CoA Asp 柠檬酸 ATP CO2,3.代谢途径的横向调节,（2）代谢互锁,表面完全不相关的两条途径之间的调节。这种作用一般在高浓度下才显示，且为部分抑制。 Asp Asp- p Asa DAP Lys，二氢吡啶二 羧酸合成酶 Hse Thr Ile Py 异丙基 Leu 苹果酸,(三)酶活力调节的机制,变构酶理论： 变构酶为一种变构蛋白，酶分子空间构象的变化 影响酶活。其上具有两个以上立体专一性不同的接受部位，一个是活性中心，另一个是调节中心。,活性位点:与底物结合 变构位点:,与抑制剂结合,构象变化,不能与底物结合 与激活剂结合, 构象变化,促进与底物结合,变构酶,根据变构酶蛋白的作用，可以把它们分为两类: (1)非酶变构蛋白酶 主要包括调节蛋白和受控载体蛋白。调节蛋白即由调节基因编码的在操纵子表达中起调节作用的蛋白，其本身没有催化活性，但是它们可以控制相应的酶的活性，或影响酶与蛋白质的合成。 有些载体蛋白也是变构蛋白，如乳糖透性酶。（2）变构酶,2.共价修饰调节理论,（1）可逆性共价修饰 （2）不可逆共价修饰,3.其他调节方式 （1）缔合与解离 （2）竞争性抑制,第二节 酶合成的调节,通过调节酶的合成量进而调节代谢速率的调节机制，是基因水平上的调节，属于粗放的调节，间接而缓慢。 （一）酶合成调节的类型 1.诱导(induction)：是酶促分解底物或产物诱使微生物细胞合成分解代谢途径中有关酶的过程。微生物通过诱导作用而产生的酶称为诱导酶（为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的酶类）。 举例：E.coli在含乳糖的培养基中合成-半乳糖苷酶和半乳糖苷渗透酶等。 诱导物(inducer)：底物或结构类似物，如：异丙基- -D-硫代半乳糖苷（IPTG，isopropylthiogalactoside）。 诱导作用的类型：同时诱导：诱导物加入后，微生物能同时诱导出几种酶的合成，主要存在于短的代谢途径中。 顺序诱导：先合成能分解底物的酶，再合成分解各中间代谢物的酶达到对复杂代谢途径的分段调节。,组成酶（固有酶）：不依赖底物或底物结构类似物的存在而合成的酶。如：EMP途径的一些酶。 诱导酶：依赖于底物或底物结构类似物的存在而合成的酶。如：乳糖酶。,（一）酶合成调节的类型-2,2.阻遏（repression）：,是阻碍代谢过程中包括关键酶在内的一系列酶的合成的现象，从而更彻底地控制和减少末端产物的合成。 阻遏作用的类型： 末端产物阻遏（end-product repression）：由于终产物的过量积累而导致生物合成途径中酶合成的阻遏的现象，常常发生在氨基酸、嘌呤和嘧啶等这些重要结构元件生物合成的时候。 例如过量的精氨酸阻遏了参与合成精氨酸的许多酶的合成。,分解代谢物阻遏（catabolite repression）： 当微生物在含有两种能够分解底物的培养基中生长时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶的合成的现象。最早发现于大肠杆菌生长在含葡萄糖和乳糖的培养基时,故又称葡萄糖效应。分解代谢物阻遏导致出现“二次生长（diauxic growth）”. 直接作用者是优先利用的碳源的中间代谢物实质是：因代 谢反应链中某些中间代谢物或末端代谢物的过量积累而阻遏代谢中一些酶的合成的现象。,2.分解代谢物的阻遏Catabolite Repression ：,1）二次生长现象及其机制： 分解葡萄糖的酶 组成酶（固有酶） 分解乳糖的酶诱导酶， 受葡萄糖分解代谢产物的 调控。,Figure 9. The Diauxic Growth Curve of E. coli grown in limiting concentrations of a mixture of glucose and lactose,3.酶合成调节的机制,操纵子学说概述： 1、操纵子（operon）：是基因表达和控制的一个完整单元，其中包括结构基因，调节基因，操作子和启动子。 结构基因(structural genes)：是决定某一多肽的DNA 模板，可根据其上的碱基顺序转录出相应的mRNA，然后再可通过核糖体转译出相应的酶;（编码蛋白质的DNA序列） 启动子(promoter)：能被依赖于DNA的RNA聚合酶所识别的碱基顺序，是RNA聚合酶的结合部位和转录起点；（在许多情况下还包括促进这一过程的调节蛋白结合位点。） 操纵子（operator）：位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，是阻遏蛋白的结合位点，能通过与阻遏物相结合来决定结构基因的转录是否能进行； 调节基因（regulator gene）：用于编码组成型调节蛋白的基因，一般远离操纵子,但在原核生物中,可以位于操纵子旁边,编码调节蛋白。,Structure of a typical operon,3、阻遏物（repressor）与阻遏物蛋白（aporepresseor）二者都是由调节基因编码产生特异性调节蛋白(regulatory potein) ；它俩是一类低分子量变构蛋白，有两个结合位点，一个与操纵基因结合，另一位点可与效应物结合；当调节蛋白与效应物结合后，就发生变构作用，变构后与操纵基因的结合能力可提高或下降。（有活性可与O结合；无活性不与O结合） 阻遏物:能在没有诱导物时与操纵基因结合的调节蛋白； 阻遏物蛋白:只能在有辅阻遏物存在时才能与操纵基因结合。,三、酶的诱导和阻遏的调节方式,1.单个终产物的生物合成途径 （1）简单终产物阻遏 （2）可被阻遏的酶的产物的诱导作用,2.多个终产物的生物合成途径 （1）多个单功能酶的简单终产物阻遏 （2）多功能酶的多价阻遏 （3）催化两条不同途径的共用酶系阻遏,3.分解代谢途径 （1）分解代谢物阻遏 （2）起始底物的诱导作用 （3）降解代谢途径的中间产物所引起的诱导作用 （4）汇流降解代谢途径 （5）多功能途径的诱导,四、酶合成调节的分子机制,1.诱导作用的分子机制 （1）正调控和负调控 （2）协同诱导和顺序诱导 2.分解代谢物阻遏的分子机制 3.末端代谢产物阻遏的分子机制和弱化调节机制,1.终产物的阻遏：(end product repression):（ 反馈阻遏) 即在合成代谢中，终产物阻遏该途径 所有酶的合成。为基因表达的控制 。 如：色氨酸(Try)合成的调控(正调节),Figure 5. Genetic organization of the Trp operon and its control elements,The Tryptophan Operon,细菌的主要代谢调节机制,五、反馈抑制与反馈阻遏的比较,能荷（Energy charge）: 三磷酸腺苷(ATP)是为许多反应提供能量的高能磷酸化物 ,细胞中的ATP、ADP和AMP含量处于相对平衡的状态细胞中的能量状态,能荷（Energy charge）来表示细胞中的能量状态。能荷（EC）可用下式来表示：,系统中只有ATP时，EC值为1；只有AMP时，EC值等于0。,一、产能代谢的调节：能荷调节,第四节 代谢调控,概念：有氧条件下，发酵作用受抑制的现象（或氧对发酵的抑制现象）。 意义：合理利用能源,通风对酵母代谢的影响,巴斯德效应(The Pasteur effect ),现象：,巴斯德效应（Pasteur effect）机理,巴斯德在研究酵母的酒精发酵时发现：厌氧条件下酵母菌进行酒精发酵，葡萄糖的消耗速度很快；而在有氧条件下，酵母菌进行呼吸作用，糖的消耗速度较低，酒精产量也降低。,呼吸抑制发酵作用的的现象,巴斯德效应的本质是能荷调节。,能荷不仅能调节分解代谢形成ATP的酶活性，也能调节合成代谢利用ATP的酶活性。,细胞能荷可调节酶活性,高能荷的抑制高能荷的抑制异柠檬酸脱氢酶和磷酸果糖激酶等,柠檬酸和ATP都是磷酸果糖激酶活性的抑制剂，从而限制了葡萄糖的利用速度。,有氧条件下，大量合成ATP，细胞能荷增加,异柠檬酸脱氢酶受到ATP抑制，导致柠檬酸的积累,在厌氧条件下，酵母菌无法通过呼吸链产生ATP，细胞能荷较低。,ADP和AMP激活磷酸果糖激酶，使利用葡萄糖生产酒精的速度加快。,通氧,ATP,柠檬酸,能荷,异柠檬酸脱氢酶活性,磷酸果糖激酶活性,6磷酸葡萄糖,基团移位吸收葡萄糖速率,二、细胞渗透性调控,提高细胞渗透性的主要方法： 1.限制培养基中生物素浓度在1-5mg/L，可以控制细胞膜中脂质的合成，从而控制代谢物产量。 2.通过诱变育种的方法，筛选细胞透性突变株，如工程构建和筛选生产菌株的生物素缺陷型、油酸、甘油缺陷型。 3.添加表面活性剂或脂溶剂如棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、土温80等表面活性剂。 4.添加青霉素。 5.控制Mn2+、Zn2+的浓度，干扰细胞膜或细胞壁的形成。,分支途径 赖氨酸发酵:谷氨酸棒杆菌的Hom,1、应用营养缺陷型菌株解除正常的反馈调节,三、菌种遗传特性的改变,分支途径肌苷酸发酵 （IMP合成途径的代谢调控）,1.2 抗反馈控制突变株的应用,抗反馈控制突变株是指对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性，或两者兼有之的菌株。 抗反馈控制突变株可以从终产物结构类似物抗性突变株和营养缺陷性回复突变株中获得。 获得方法及其原理：,1.3选育组成型突变株和超产突变株,如果调节基因发生突变，以至产生无效的阻遏物而不能和操纵基因结合，或操纵基因突变，从而造成结构基因不受控制的转录，酶的生成将不再需要诱导剂或不再被末端产物或分解代谢物阻遏，这样的突变株称为 组成型突变株。少数情况下，组成型突变株可产生大量的、比亲本高的多的酶，这种突变株称为超产突变株。,4.抗性突变株的应用 （1）抗生素抗性突变。 （2）抗噬菌体菌株的选育。 （3）条件抗性突变 （4）敏感突变 5.增加结构基因数目 增加发酵产品的结构基因数目可以提高发酵产物的产量。,四、发酵工艺条件的控制,1.控制培养基成分 2.控制发酵条件,当发酵液处在碱性条件下，酵母的乙醇发酵会改为甘油发酵。 原因：该条件下产生的乙醛不能作为正常受氢体，结果2分子乙醛间发生歧化反应，生成1分子乙醇和1分子乙酸；,CH3CHO+H2O+NAD+ CH3COOH+NADH+H+ CH3CHO+NADH+H+ CH3CH2OH+ NAD+ 此时也由磷酸二羟丙酮担任受氢体接受3-磷酸甘油醛脱下的氢而生成 -磷酸甘油，后者经-磷酸甘油酯酶催化，生成甘油。,2葡萄糖 2甘油+乙醇+乙酸+2CO2,D A B C E F,（二）生物化学方法,1. 添加前体绕过反馈控制点：亦能使某种代谢产物大量产生,(-),(-),(-),2. 添加诱导剂：从提高诱导酶合成量来说，最好的诱导剂往往不是该酶的底物，而是底物的衍生物， 3. 发酵与分离过程耦合： 4. 控制发酵的培养基成分：,第八章 微生物的次级代谢及其调节,次生代谢物（secondary metabolite）:指某些微生物生长到稳定期前后，以结构简单、代谢途径明确、产量较大的初生代谢物为前体，通过复杂的次生代谢途径所合成的各种结构复杂的化合物。 种类：抗生素、色素、毒素、生物碱、信息素（pheromone),生长促进剂、 生物药物素。,二、Gaden对发酵的三分类与Pirt方程：,一类发酵 产物的形成和菌体的生长相偶联,x,p,X,P,时间,X或者P,1.生长偶联型,dP/dt=dX/dt = P- 产物浓度 -系数 -产物形成比率=dP/dt/X,二类发酵 产物的形成和菌体的生长部分偶联,x,p,时间,X或者P,X,P,2.混合生长偶联型,dP/dt=dX/dt+X =+ 如：PHB的生产包括了非产物生物量和产物生物量 dX/dt=dR/dt+dP/dt dR/dt=maxRN/(Ks+N),三类发酵 产物的形成和菌体的生长非偶联偶联,x,p,3.非生长偶联型,时间,X或者P,X,P,dP/dt=X =,Pirt方程, + , =0、 0： 可表示一类发酵, 0、 =0： 可表示二类发酵, 0、 0：可表示三类发酵,第一节 次级代谢与次级代谢产物,一、次级代谢产物类型 1.根据产物的作用分类 （1）抗生素 （2）激素 （3）维生素 （4）毒素 （5）生物碱 （6）色素,2.根据产物的主要成分及其与初级代谢的关系分类 （1）糖类 （2）多肽类 （3）聚酯酰类 （4）核酸碱基类似物 （5）其他类型 （6）色素,二、次级代谢的特点 1.次级代谢产物的产生与微生物的生长不呈平行关系,三类发