药物分析药物的定量分析与分析方法验证.ppt

第四章 药物定量分析与分析方法验证 第一节 定量分析样品的前处理方法 一、概述 含金属或卤素的药物，在分析前需要经过不同方法处理之后，方可进行测定。 处理方法因金属或卤素在分子中结合的牢固程度而异，如：有机卤素药物，所含卤素原子均直接与碳原子相连，但不同药物中卤素所处的位置不同，则与碳原子结合的牢固程度就有差异。如果卤素和芳环相连接，则结合牢固，与脂肪链的碳原子相连接，则结合不牢固；,而含金属的有机药物，有两种情况： 一是金属原子不直接与碳原子相连，通常为有机酸及酚的金属盐或配位化合物，称为含金属的有机化合物，其分子结构中的金属原子结合不够牢固，在水溶液中既可离解出金属离子，如有机结构部分不干扰分析时，可在溶液中直接进行其金属的鉴别或含量定； 二是金属原子直接与碳原子以共价键相连接，结合状态比 较牢，称为有机金属药物，在溶液中其金属一般不能解离成离子状态，应该根据共价键的牢固程度，经适当处理，将其金属转变为适于分析的状态，应该根据共价键的牢固程度，经适当处理，将其金属转变为适于分析的状态（多转变为无机的金属盐或离子），方可进行其金属的鉴别或含量测定。,不经有机破坏的分析方法 分析方法分两大类： 经有机破坏的分析方法,二、不经有机破坏的分析方法 （一） 直接测定法 凡金属原子不直接与碳原子相连的含金属药物或某些C-M （金属原子直接与碳原子相连）键结合不牢固的有机金属药物， 在水溶液中可以电离，因而不需有机破坏，可直接选用适当的方 法进行测定 。,（二）经水解后测定法 1直接回流后测定法 2用硫酸水解后测定法,例：富马酸亚铁的含量测定：富马酸亚铁 + 稀酸 -Fe2+,例：三氯叔丁醇含量的测定：Cl3-C(CH3)2-OH + NaOH -Cl-,例：硬脂酸镁含量测定：Mg(C17H35COO)2 + H2SO4 - Mg2+,（三）经氧化还原后测定法 1碱性还原后测定 2酸性还原后测定 3利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量,例1：碘番酸含量的测定 碘番酸在醋酸条件下用锌粉还原,使碳碘键断裂,形成无机碘化物,后用银量法测定; 例2：泛影酸含量的测定P81,三、 经有机破坏的分析方法 （一） 湿法破坏：一般采用强酸、加热湿法破坏法。 1 硝酸-高氯酸法 2 硝酸-硫酸法 3 硫酸-硫酸盐法 4 其它湿法,（二） 干法破坏：将有机物灼烧灰化达到分解的目的。 供试品-坩埚-加热-炭化-高温灼烧-炭化完全。,（三） 氧瓶燃烧法 氧瓶燃烧法（oxygen flask combustion method）系将有机药物放入充满氧气的密闭的燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别、 检查或测定含卤素有机药物或含硫、氮、硒等其它元素 的有机药物。,本法是快速分解有机物的简单方法，它不需 要复杂设备，就能使有机化合物中的待测元素定 量分解成离子型。该方法被各国药典所收载。 1 仪器装置 燃烧瓶为500ml、1000ml、或 2000ml磨口、硬质玻璃锥形瓶，瓶塞应严密、空 心、底部熔封铂丝一根（直径为1mm），铂丝下 端做成网状或螺旋状，长度约为瓶身长度的23 ， 如图,2 称样 3 燃烧分解操作法 4 吸收液的选择：多数用水或水加氢氧化钠,例： 氧瓶燃烧 NaOH吸收 含碘有机药物-I 2-NaI+NaIO3 溴+醋酸 KI 硫代硫酸钠 -HIO3-I2-NaI,第二节 定量分析方法特点 一、 容量分析法 （一） 容量分析法的特点 （二） 容量分析法的计算问题 1 滴定度：每1ml某摩尔浓度的滴定液所相当的被测药物的重量。（药典中用mg/ml表示） aA+bB=cC+dD 2 滴定度（T）的计算,B-滴定液浓度 ; a/b-供试品与滴定液摩尔比; M- 供试品摩尔质量,例：羟苯乙酯含量测定: 先加入定量过量的氢氧化钠,用0.5mol/L硫酸滴定,(羟苯乙酯分子量166.2)求滴定度T,T=0.5X(2:1)X166.2=166.2(mg/ml),例:维生素E中游离生育酚M(C29H50O2)=430.7g/mol 的检查方法如下: 取本品0.10g加无水乙醇5ml溶解后,加二苯胺试液1滴, 用硫酸铈滴定液(0.01mol/L)滴定,消耗硫酸铈滴定液 (0.01mol/L)不得超过1.0ml,反应如下:,试计算每1ml硫酸铈滴定液(0.01mol/L)相当于 生育酚的质量?,3 百分含量计算 （1） 直接滴定法,T滴定度;V消耗滴定液体积;W供试品取量,校正因子F: 当滴定液浓度与药典中规定浓度不相同时,要校正,在药检部门实验里的试剂瓶子一般不标浓度,而是F值.,实际滴定度:T=TF,例:用溴酸钾法测定异烟肼M(C6H7N3O)=137.14的含量时,溴酸钾滴定液的规定摩尔浓度0.01667mol/L. 3C6H7N3O+2KBrO3=3C6H5NO2+3N2+2KBr+3H2O (1)计算滴定度T,解： T=0.01667 (3/2) 137.14=3.429mg/ml,(2)测定原料中异烟肼含量: 实验中配制的溴酸钾浓度为0.01672mol/L,取原料药0.2012g,100ml定容,取25ml用溴酸钾滴定,消耗溴酸钾14.25ml,求含量?,(3)实验四：测定异烟肼片含量: 取20片(标示量0.1g),精称(2.4220g),研细精称0.2560g,置 100ml定容,取25ml用溴酸钾滴定,消耗溴酸钾16.10ml,求含量?,(2)间接滴定法: 先加入定量过量的滴定液A,使其与被测物定量反应, 再用另一滴定液B回滴定反应剩余的A. 本法需进行空白试验校正.,例:P90 司可巴比妥钠的含量测定(略) VB空=23.21ml VB供试=15.73ml F(Na2S2O3) =1.038 T(Br2)= 0.05mol/L(1/1) 260.23g/mol=13.01(mg/ml),二、 光谱分析法 光照在物质上，物质内部发生能级跃迁而产生辐射， 利用光谱进行定性或定量的结构分析称为光谱分析法 （一）紫外-可见分光光度法 1特点 紫外-可见分光光度法是根据物质分子对波长为 200nm760nm 这一范围的电磁波的吸收特性所建立起来的光 谱分析方法。主要特点如下： （1）灵敏度高，可达10-4g/ml10-7g/ml 。 （2）准确度高，相对误差为2% 5%。 （3）仪器价格较低廉，操作简单，易于普及。,2.朗伯-比耳定律 A=ELC A-吸光度；L-液层厚度/cm ； C-溶液浓度；E-比例系数,3.百分吸收系数E 溶液浓度为1%（W/V）厚度为1cm的吸收度,当c的单位为g/L，则A=abc，a称为吸收系数，单位为L/g.cm； 当c的单位为mol/L，则A=bc，称为摩尔吸收系数，单位为L/mol.cm,=*10/M,4.定量分析方法,A-供试品吸光度；D-供试品稀释倍数； W-供试品取量（标示量）（g）； L-液层厚度（cm）,a.对照品比较法 b.标准曲线法 C.吸收系数法,书上例：维生素B2的测定,例：实验三 醋酸地塞米松片含量测定 测定得某片吸光度A=0.598 已知：百分吸收系数 E=357；每片标示量0.75mg； 实验中取本品置于50ml容量瓶中定容，求含量？,分析：为什么含量超过100%？,溶剂和吸收池有吸收，必须做空白试验,二、荧光分析法 某些物质受紫外可见光照射后能发射出比激光波长 较长的荧光，灵敏度高，取样少，方法快速，但干扰 因素多，必须做空白试验。,测定方法： 在一定条件下，用对照品溶液测定荧光强度与浓度成线性关系的范围内，在同一条件下，测供试品、空白、对照品及对照品空白的荧光度，计算得供试品含量。,Cr-对照品浓度；Ri-供试品读数；Rib-供试品空白样读数 D-稀释倍数； Rr-对照品读数；Rrb-对照品空白样读数 W-供试品取样量； -平均片重；,例：地高辛片含量测定 对照品溶液:精密称取地高辛对照品适量,加80%乙醇 溶解并定量稀释成每1ml中含2.50g的溶液,即得. 供试品溶液:取本品20片,精密称定,研细,精密称取 适量(约相当于地高辛1.25mg)置100ml量瓶中,加80% 乙醇适量,振摇1h使溶解再加80%乙醇稀释至刻度,滤过, 精密量取续滤液2ml,置10ml量瓶中,加80%乙醇至刻度, 摇匀即得. 测定法:精密量取供试品溶液与对照品溶液各1ml,分别置10ml量瓶中,依次各加0.1%抗坏血酸的甲醇溶液3ml 与精密标定的过氧化氢溶液(0.009mol/L)0.2ml,再用 盐酸稀释至刻度,照荧光分析法,测得Ri Rib Rr Rrb值.,对照品浓度:Cr=2.5g/ml=2.5x10-3mg/ml,稀释倍数:,W=取样量（约相当于地高辛1.25mg),如标示量0.8mg（配方中有标注）, 则取约1.5片的质量左右.,三、色谱分析法 1、高效液相色谱（HPLC） 高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂,缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱中.将供试品由流动相带入柱内,根据供试品不同成份在溶剂中表现出不同的性质,将其分离,然后检测得到色谱信号. 例如图:两种成份 保留时间:相邻两峰中前后 各峰保留时间tR1 ,tR2 峰宽:W1,W2,(1)分离度:,R值越大说明分离越好,R1.5较好. 较好的色谱图为:,峰窄,对称性好,两峰相隔分明较好. W 1W 2要换算成时间,保证R无量纲,例:用HPLC测得两组分的保留时间8.0min和10.0min, 峰宽分别是2.8mm,3.2mm,记录纸速5.0mm/min,求两 峰分离度? 解:,(2)理论板数: 将色谱过程看作一系列相继平衡的阶段, 每一个 平衡阶段为一个理论板,在每一个板上的成份在两 相间建立平衡.,tR:保留时间, Wn/2:半峰高宽. H:板高, L:柱长.,(3)测定含量方法(定量) （1）内标法：先测对照品和内标物的峰面积(峰高),计算校正因子f,f:校正因子; AX:供试品峰面积(峰高); AS:内标物的峰面积(峰高) CS:内标物的浓度;,AS:内标物峰面积(峰高); CS:内标物浓度; AR:对照品峰面积(峰高); CR:对照品浓度;,再测含有内标物的供试品,计算含量,2)外标一点法:测对照品和供试品色谱, 得出峰面积AR,AX,CR:对照品浓度,（2）外标法测定供试品中主成分含量： 外标法可分为标准曲线法和外标一点法。 1）标准曲线法：,2. 气相色谱法GC 流动相为气体,称为载气,固定相为高分子多孔小球或 涂喷固定液的载体.供试品被加热气化,由载体带入色谱 柱,在柱内各成份被分离后测定成份及含量. 含量测定法:内标法 内标溶液: 内标物+溶剂 峰面积:AS 浓度: CS(mg/ml) 对照品: 标准样+内标物 AR CR 供试品: 未知样+内标物 AX CX 校正因子:,第三节 药品质量标准分析方法验证 验证内容有：准确度、精密度（包括重复性、中间精密度和 重现性）、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。 一、 准确度 （一）含量测定的准确度 准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程 度，一般以回收率（%）表示。准确度应在规定的范围内建立。 回收率的计算可按下式：,(二) 数据要求,二 、 精密度 精密度系指在规定的测定条件下，同一个均匀样品，经过多 次取样测定所得的结果之间的接近程度。 (一) 精密度表示方法 1. 偏差(deviation，d ) .标准偏差(standard deviation ，SD ),3. 相对标准偏差(relative standard deviation,RSD ),也称变异系数(coefficient of varation,CV ),(二) 重复性、中间精密度及重现性 1. 重复性 在相同的条件下，由一个分析人员测定所得结果的 精密度称为重复性。 2中间精密度 同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不 同设备测定结果的精密度，称为中间精密度。 3重现性 在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度，称为重现性。,(三) 数据要求 三、专属性 专属性系指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）可 能存在下，采用的方能准确测定出被测物的特性。 (一) 鉴别反应 (二) 含量测定和杂质测定 四、 检测限 检测限（limit of detection，LOD）是试样中被测物能被检 测出的最低浓度或量。LOD是一种限度检验效能指标，即反映 方法与仪器的灵敏度和噪音的大小，也表明样品经处理后空白 （本底）值的高低。它无需定量测定，只要指出高于或低于该 规定的浓度或量即可。根据所采用的方法来确定检测限。,(一) 常用的方法 1. 非仪器分析目视法 2. 仪器分析时的测定法 （二）数据要求 五、定量限 定量限（limit of quantitation ，LOQ）是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。杂质和降解产物用定量测定方法研究时，应确定定量限。,六、线性 线性系指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓 度直接呈正比关系的程度。相关系数R1 ,用软件可得回归方程.,最小二乘法,七、范围 范围是指能到达一定精密度、准确度和线性、测试方法适用 的高低限浓度或量的区间。 八、耐用性 耐用性 系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响 的承受程度，为常规检验提供依据。 1用于鉴别试验 2用于原料药中杂质测定或制剂中的降解产物测定的方法 3用于原料药中主成分或制剂中有效组分含量测定及溶出 度测定,第四节 生物样品分析方法的基本要求 一、常用样品的种类、采集和储贮藏 生物样品包括各种体液和组织，但实际上最常用的是比 较容易得到的血液（血浆、血清、全血） 、尿液、唾液。 (一) 血样,1、血浆（plasma） ：采取血液（全血）置含有抗凝剂（如： 肝素、草酸盐、枸橼酸盐、EDTA等），离心分离， 取上清液即血浆。 2、血清（serum） ：采取血液（全血）在室温下放置0.5-1h，待血液凝固后，剥离血饼，离心分离，上清液即为血清。 3、全血：取血后要加入抗凝剂防止凝血。,(二)、唾液 一般成人每天分泌约1-1.5L唾液，pH6.2-7.6 采样：漱口15分钟后收集，1分钟收集1mL。 若分泌量少，可采用物理方法（嚼石蜡块）， 化学方法（酒石酸）刺激,4以下保存。 (三)、尿液 健康人排出的尿液淡黄色或黄褐色，成人一日尿量1-1.5L。pH4.8-8.0 采集尿：晨尿、白天尿、夜间尿、随时尿等。 采集后应立即测定，如不能立即测定可加入 防腐剂后冷藏保存,1加入与水相混溶的有机溶剂(使蛋白质分凝聚而使药物释放) 2加入中性盐（使蛋白质脱水而沉淀） 3加入强酸（使蛋白质阳离子形成不溶盐沉淀） 4加入含锌盐及铜盐的沉淀剂（使蛋白质和金属阳离子形成不溶盐沉淀） 5酶解法（操作简单） （二）缀合物的水解 （三）分离、纯化与浓集 1液-液提取法(liquid-liquid extraction ,LLE) 2液-固提取法(liquid solid extraction,LSE) 3被测组分的浓集,二、生物样品分析前处理技术 (一) 去除蛋白质,(四) 化学衍生化 1GC中化学衍生化法 2HPLC中化学衍生化法 三、 定量分析方法验证 (一) 特异性 必须证明所测定的物质是原形药物或特定的活性代谢物， 内原性物质和相应的代谢物及同时服用的其他药物不得干扰 样品的测定。对于色谱法至少要提供空白样品色谱图、空白 生物样品加标准物质色谱图及用药后的样品色谱图。,(二) 标准曲线与线性范围 所测定物质的浓度与响应的相关性，用回归分析方法 所得的回归方程来评价。一般控制相关系数r0.