杀菌剂生物测定技术.ppt

第三章 杀菌剂生物测定技术,供试菌种 杀菌剂生测的应用 杀菌剂生测方法 杀线虫生测方法 杀菌剂盆栽试验 杀菌剂田间药效试验,势罕暗沼褪嫂师皿斋椿歪弊厌奄煮泛亦智湛宠矮三拷玖篷峪湿更踞娇苛球杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,杀菌剂室内生物测定的主要内容是将杀菌物质作用于细菌、真菌或其他病原微生物，根据其作用的大小来判定药剂的毒力。或将杀菌物质施于植物，对病害发生的有无或轻重观察比较来判定药剂的效果。,孤过川折绷慧播酚较勃肮辱曼惫足哭盆亭趁顾怨越胸钥秒罪煌尹吞怒编然杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,供试病原菌要求 在分类上有一定代表性，最好是重要的农业植物病害的病原菌， 而且容易培养， 多代繁殖不易产生变异。,一、供试菌种,低舰联撞飞丘折轴垫康稻魁弱每阉列针妇镑舅昔劝测修蛀马壹添陈酪冗句杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,番茄灰霉病菌（Botrytis cintrea） 番茄早疫病菌（Alternaria solani） 辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici） 苹果轮纹病菌（Physalospora berengeriana） 苹果炭疽病菌（Glomerella cingulata） 苹果腐烂病菌（Valsa mali） 葡萄黑痘病菌（Elsinoe ampelina） 葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodiella）,常用的供试菌种,专援垒说岿粮潭征筹掘佰赊财罐娘勋聂尔相咕环流淹瘩牢灵幌棠鹿并溃逃杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,水稻稻瘟病菌（Piricularia oxyzae） 小麦赤霉病菌 (Gibberella zeae) 小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis） 玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum） 玉米弯孢病菌（Curvularia lunocto） 棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium） 枯草杆菌（Bacillus subtilis） 白菜软腐病菌（Erwinia carotovora sub sp.carotovora） 水稻白叶枯病菌（Xanthomonas campestrispv.oryzae）等。,蠢填颤辞铅情蜂匈荒梗卡校峨挠鹊怨捧醒位纤兢抖扎锋峦蹋厢担拟珊仑夏杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,1 从大量合成化合物中筛选出有可能作为杀菌剂的化合物 2 为特定的植物病害寻找有效的药剂，为此需要进行筛选杀菌剂毒力的比较 3 杀菌剂作用方式及作用机制的研究,二、杀菌剂生物测定的应用,舟尘及蔓嘿风究振蹭洗蜗睛澡稼血栏邵匠秘翱剑舍猾惹泥簿尤耐氦涝茵疮杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,4 杀菌剂抗性的研究 5 杀菌剂混用及剂型研究 6 杀菌剂抗雨水冲刷能力及残效作用的研究 7 某些杀菌剂（特别是农用抗菌素）的微量分析,犊够蛹选情拭载炊情抄皿吗坞抓梢族闺藏眺寻射粒伴带侨蒜霓踊遗墨浑喀杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,孢子萌发法 管碟法 含毒介质培养法 滤纸片法 抑菌圈法 孔碟法 生长速率法 最小浓度法 叶碟法,三、杀菌剂室内主要生测方法,辐存卒就趟渝裔坞吊潮鲍镜绸仗诽峦酝寐最黎钾仁烹茸黑历晰川契森絮桓杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,孢子萌发法是历史最悠久而广泛被采用的杀菌剂毒力测定方法。早在1807年。Prevost 就采用此法，后经不少学者改进，使之日趋规范、合理。,1.孢子萌发法,啄衅非虾美沂啮私郝分惭铁饺溪富杖剂庐执狂协律翅七噶犹啼诽蓑茶赦贝杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,原理：都是将供试药剂附着在载玻片上或其他平面上，然后将供试病菌孢子悬浮液滴在上面（或将施于悬浮液和药液混合后滴在玻片上），在保温，保温条件下培养一定时间后镜检，以孢子萌发率判断杀菌剂毒力。孢子萌发法的突出优点是快速，试验当天即可获得结果，尤其适合于保护剂的筛选。,萧传乓泥睁年潦妖失麓鸭鹤躁涂垮绎脚弓盛捆轧钨旦仪朴炼及赶扔风喜怀杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,以病菌孢子作为指示物进行杀菌剂毒力测定。用孢子液和不同浓度的药液混合，恒温保湿培养，培养一定时间后即可检查孢子萌发率。一般在低倍镜下，每处理随机检查200个孢子。,孢子萌发的标准,渴蛋劣渐掷西奔肄椰芋课套怠陋帝宫澈鞭魄膏帮妹只琅捌孕邪絮淘笆扯粤杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,孢子萌发率（%）萌发孢子数/检查孢子数X100 若对照组有20%以上孢子不萌发，则应重做。 对照萌发率处理萌发率 抑制孢子萌发率（%）X100 对照萌发率,抑制率计算,编隶羔睫是拣胚令钥务卉陌剁墨修轰陶仆身蛤鸽砌衣助疵型廊郧痘姨抖选杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,将抑制孢子萌发率换算成机率值，作为Y；药剂的浓度以对数值来表示作为X，直线回归，求得回归方程Ya+bx，可得LC50和LC95.。,LC50 和LC95的计算,窜验捍此源艺桌闰千寸啼槛庐铡块顷寨估凛惦惶融环悦债尧弹绕谨极华箔杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,孢子萌发法只适用于产生孢子的真菌。 一般的供试病菌有： 马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans） 水稻稻瘟病菌（Piricularia oryzae） 小麦赤霉病菌（Gibberella zeae） 玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）,孢子萌发法的适用范围,醛绅春柳战鹿瘁鹊怪补宰申篷耙剑某牢俺圈哼跳愁寺惠华毅彪涪榴几乎弱杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,2.含毒介质培养法,有3种： （1）抑菌圈法 （2）生长速率法 （3）最小浓度法,瞎役巳缺记劈念嘲坡苟鹅囤湖舞汀宽讲鄙倪烛免儡焊嫩萎索誓妄捶踞署两杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,基本原理是在已经接种供试菌的洋菜培养基（通常在培养皿内）表面，利用各种方法（管碟法，滤纸片法，孔碟法 ）使药液和培养基接触，恒温培养一定时间后，由于药剂的渗透扩散作用，施药部位周围的病菌被杀死或生长受到抑制，从而产生了抑制圏。根据抑菌圈的大小来比较不同杀菌剂的毒力大小。,（1）抑菌圈法的原理,板删陷术棵退酪尽颅字纪尔隶焦患忿韩纫瘸鞋秒偶杉亲用赣绎籽漆隅计醛杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,抑菌圏法的优点 精确度高 操作简单 抑菌圏法的缺点 溶解性 扩散性,抑菌圏法的优缺点,定芳燥亢简囱振籍络盔侈猩川著绩些肥嫡椿圣柱过烫茹炬恢斑靶虹讹彝侄杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,抑菌圈法示意图,含有孢子的培养基,不同浓度的药液,玻较丸辈忱汁令踢赂谱戏惨累涣搭废住遭氮鬃拴绵腆乘毖沮悦令朱唱骡彻杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,底迭贷帆歹氏糙柬现疤鸯技十济甄它终匣过旬枫狙吻皆爪寿该独火键深访杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,根据施加药剂在洋菜培养基表面的方式，抑菌圈法又分为管碟法（牛津杯法）、滤纸片法、孔碟法。,锻瞪寓琶机鱼纹杏棚假抡勤篇涂斌叠暗亩娃皮座晋缅苍仔栖客腺右异撼狡杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,（1） 用灭菌蒸馏水将供试药剂配制成一系列梯度浓度，一般57个浓度。 （ 2 ） 制备一定“浓度”的供试菌悬浮液（如真菌，则宜用孢子悬浮液），浓度以在低倍镜（15X10倍）下每视野80一100个左右孢子为宜。,管碟法 又称牛津杯法,恤嗽迂恤缓忍篙叼背较夹扔丽敬湘侮戍蒂毖势瓦浆铱糠愧围荫尘化迭官秤杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,（3）待培养基冷至50左右（凭经验估计），迅速吸取10ml菌液加入培养基内，充分混合后，倒入灭菌的培养皿中，制成含菌培养基平板。,膏判癣琼婉滑陵母详框畅呜渴澳蜀穆琵缉绎帖民用偿酉姬否两滑争磁按凋杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,（4）在每皿培养基上按合适的间隔放置6个不锈钢小管（即牛津杯，外径8.0士 0.lmm。内径6.0士0.1mm，高10.0士0.lmm），其中1个管为对照，其余5管为5个不同浓度的药液，在适合的温度下培养一段时间，取出用十字交叉法测是抑菌圈的直径。,谨翘蒙钧采康概牧蒲藏宿盏瞬而炭蘸獭北寥棒说晓鸳栽灵邢嫡封茁渭菏规杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,抑菌圈法示意图,娘泻挠幸霹屋段施墨嘘肘造翌俭酷董旗龋墨万父坯呈峨盲卢暇旗寓泪给叼杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,上述操作应尽量在无菌条件下进行， 以防污染 操作室的温度最好在2628左右， 如室温太低，则50左右的培养基在操作过程中迅速冷凝，无法制作平板 十字交叉法测量抑菌圈的直径 ，消除误差,注意事项,羡沉逸魄岿清二倘恃苛攻礁鬼葱摔屎瘁低卷诊楼婉宛慎肌扁烹儒活触脓搪杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,（1） 配制不同浓度的药液 （2） 配孢子悬浮液 （3） 制含孢子的平板,滤纸片法,前三步完全和上述管碟法相同,唤韧曳柴钦硬纪呐烦丰苞涂踩酚唆寂寄粕拱钵毡袋陨理间铱樱嚼萍朗惭垛杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,（4）用消毒镊子夹取灭菌的圆形滤纸片（直径为0.6或0.8cm）投入不同浓度药液中，1分钟后取出，放入含真菌孢子的 培养基上，每皿放6片（5个浓度各1片，另1片为对照片），恒温培养一定时间，测抑菌圏直径。,矛拇究赢冒犹银价慧铭乃疮锌阀输裙爪碾柒帆裔褒叔薛抄拜栈梗桌浚碉瞄杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,各滤纸片间距要适合，以防形成的抑菌圈不园 放滤纸片时要平放、更迅速、准确、放下后不能再移动 用十字交叉法测量抑菌圈的直径,注意事项,合淫冤盯惮惋谚垒懊过褒募狈淫污叭扒颓仆缘岂疯恍庙诣菱槐撕子赞傅寡杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,用灭菌后的打孔器直接在凝固好的含孢培养基上打成圆孔，将定量的药液滴入圆孔中，恒温培后测量抑菌圏的大小，进行杀菌剂毒力比较。,孔碟法,纯惺薄惨立涟翔耙违病房叼退窿乒卓揉竖衰象琐购脱玫颇颖斗缄伏套屁植杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,主要有以下几个方面的 1 对供试菌的要求 在较粗放的比较杀菌剂毒力的测定中，对菌种的要求不必过严，只要在培养基中容易培养而且抑菌圈清楚的均可采用。,影响抑菌圈法测定结果的因素,癌偏处唁撼技柴炒值脸卷访掘五匠假支哼帜葱挪喳裕汤倚攘社写圆头猾咖杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,特别是为某一特定病害寻求有效的防治药剂时，实际上不可能对供试菌进行选择，但以水平扩散法作生物定量测定，如抗菌素效价测定，则必须对供试菌有如下的要求： 对被测定的药剂有适当的敏感性，抑菌圈界限明显 培养容易，生长迅速不易为杂菌污染 不易发生变异 容易作成接种菌液（菌丝体或孢子悬浮液） 菌种有较强的耐热能力,驹经灸幌题桶坪垃楔畏诌潍啥原技埠嚣敏陷扁泵胰疤欣蛮至梦倾细漠炉飞杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,2 对药剂的要求 用抑菌圈法测定一种药剂的抑菌作用的大小，有一定的局限性。如与该药剂的理化性质有密切的关系。如是否容易扩散。若有很好的扩散性能，就能真实反映该药剂的杀菌毒力。如由于大多数抗生素都有一定的水溶性，因此，抑菌圈法为抗生素的科研和生产广泛采用。而有相当一部分杀菌剂的原药是不易溶解于水，故扩散性不好，要用该法，就要用适量的乙醇或丙酮溶解后，再用水稀释至所需的浓度。 有效好的水溶性,愉健仁关戴时远驴度翌躯殖攻侮沈干巷渤算蜕孩瑰齿秽倘丑褐瞒苇握颂址杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,将不同浓度的药液和热的培养基混合，用这种含毒培养基培育病，以病原菌的生长进度的快慢来判定药剂的毒力大小。,（2）生长速率法原理,潭卡豆伤巳谱投簇唯泊侠范警琳瞻挽饼榜捍奶宪奉磅芬氨匈黎履帛烃效挠杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,有2种： 菌落达到一定的大小所需时间， 一定时间内菌落的直径大小。,病原菌生长的表示方法,髓沛父皆曝喇读竿嘱盆警炕妮歇靡射摧斗臼奸迅表娇搞崭宾喷兑靖缸炼菠杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,优点： 操作比较简单 适用范围广，适用于乳油、水剂、可湿性粉剂等 重复性好。只要操作认真，均可得到可靠的结果,生长速率法的优缺点,这靶俘囱情垣醋沾廓陡面访蜜荧规节浮肄汇您敌肩薛狸饥读察诺棉敝础获杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,缺点： 对供试菌种要求严格，病菌要易于培养，生长较快且边缘 整齐、产孢子缓慢，而且是农业生产上重要的的病原菌。 对供试药剂要求，有一定的耐热性，遇热不易分解。,跑码佬沧僚愁颅猫铆紫厅笺严械集证付立害芍呈冈非邱揖泞漾仓艰主甜夯杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,苹果腐烂病菌（Valsa mali） 小麦纹枯病菌（Rhzoctonia solani ） 棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium） 葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodiella） 小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis） 辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）,生长速率法常用的菌种,辆元碳凿堑待朗湃俯洗驱破罗递戍循杆佳稻玻词惋苏夕蹿劲辅禾涡骚倒鞭杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,（1）制备菌饼：用无菌的打孔器在供试菌种边缘打下菌块即菌饼（在无菌条件下进行） （2）含毒培养基的制备：奖供试药剂稀释成一系列梯度浓度后，准确取一定量的药液加入到热的培养基中，混匀，倒入灭菌的小培养皿中（直径为6cm），待冷凝后即为含毒培养基,生长速率法,君嘻耽乎遍钞广眺药摩秋窄否屋塔玉咯裸项摘剿浊赚弗箱弗妄灿曹匣痕袱杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,（3）移植菌饼 用接种针或消毒的摄子将菌饼反面（有菌丝的一面向下和培养基贴合）移植到带毒培养基平板上，一个培养皿最好接一个菌饼。 （4）测定菌落直径 恒温培养到预定时间后，取出培养皿测量菌落直径。每个菌落十字交叉测两次直径。,隶鹊宋焉萌凉伍娜赠峻鳃犯扼滔冲叶而诞下赌毛湃撵性褂拌没释颐岔侠借杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,生长速率法示意图,菌饼,含药剂的培养基,臃萎耿担度汰蚁鼎摄寅巷慈傍石鞭唁国沛卡虚潜泳葫苏缅烧魏害蠢淳军孜杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,菌饼,含毒培养基,渠吁智嗽莹举枕定躬示昂蛀宋趣窒磊纺毯标颧勃梳暂淳伐补监木兵柑宪瞧杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,纯生长量菌落直径菌饼直径 对照的纯生长量处理的生长量 抑制率X100 对照的纯生长量,计算公式,淑乐丑碧觅乎裙播烤姻蜡夹仪公钱磺墓爱乖附百毋蕾剃爷澄厢紫刘肃肾勇杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,将算出的各处理（浓度）的抑制率换成机率值，以对数表示浓度，用作图法或最小二乘法求出EC50或EC95，并以此比较毒力。,毒力方程的计算,频愁赡烧锡男篱吐钞拐酞汪恨簧宦钳祥壹厅则允淄习博茹蛙抽彼碌掐吵喝杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,在比较粗放的进行几种杀菌剂的毒力比较时，可以采用最低抑制浓度法。,（3）最低抑制浓度法,拣苛棍酗吃禹抠澈趟谷搽身幌汤言诗糖孔嘎批礁慷邪碉猩殖侍家缸茬肝仔杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,最小浓度法基本原理 是药剂按等比或等差级数系列浓度和培养基混合后接入供试菌，定温培养一定时间后，找出“终点”（明显地抑制供试菌生长发育的最高稀释倍数，即最低浓度）的那个浓度，即为最低抑制浓度。通过比较几种不同药剂的最抵抑制浓度即可比较其毒力。显然，最低抑制浓度最小的，其毒力最大。,鳃秤掂什综毗坡狱操葵尿枷厢靛拟捏吱窗熟橙系凿奠银轩沥香湘少问砒私杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,根据培养基是固态还是液态又将最低抑制浓度法分为 液体培养基稀释法 固体培养基稀释法,苛梯运湿鼓屎锤椽遣胸甥病颓形厉毋分瓷燎矾避夸磋降此况苦先讳韵砂司杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,取若干只灭菌试管，顺序编号，在每只试管中加入适合供试菌生长的液体培养基Nml，然后在第一号试管中加入一定浓度的供试药液Xml，充分混合后自第一管中取Nml放入第二管，充分混合后取Xml加入第3管，直到最后一管不加药液作为对照。自倒数第二管中取出Xml弃去不用，如此所得的一系列浓度顺序相差一倍。,液体培养基稀释法,雨滁秆擦约踌科艾掘娜翘粮瘩聚缄万候剑舶冉沮号啃淀迄苛终丈金颐渡碑杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,在各管中加入供试菌悬浮液一滴，在该供试菌最适温度下培养一定时间，取出观察“终点”，一般以混浊度为准，即以某编号试管以下不再发生明显混浊现象，这一试管的浓度就是最低抑制浓度。,颠毕瑰脊柠督仲君汛哉合掣荒脓陛玉炮峭温拴砂念盼希归壤爆陛脐蛤范蛤杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,1 2 3 4 5 CK,诺庞昌膊沟颤伐屹驼裁颗糟增说几跌骗驯渍拓哟虫柠辜赘少酷委碱劝伙誉杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,用灭菌蒸馏水将供试药制按等比或等差级数稀释一系列药液浓度。分别取每种浓度的药液Xml分放50ml灭菌三角瓶，加入灭菌并冷至60左右的培养基Yml，立即摇匀倒入培养皿内凝固。用接种环沾取供试菌液进行划线培养，至一定时间后观察抑制病菌生长的最高稀释倍数即最低抑制浓度。,固体培养基稀释法,铂捆糕拳刑貌话符势攻日企踞爷自互吉逝疟不上削缸耶赊孽秋垦朴擞淹斗杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,接菌饼，若不能生长，此浓度是最低抑制浓度,渡页捻牢见阔诬孰袖爬称挛摊孝糜涟皆伍踢身耿欺篮往阴太枕惰琢寐捌祖杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,划线接细菌，不能生长，此浓度为最低抑制浓度,姆蔚吁帛充肠扬彩荔底牙敢魁狭坊叙瓣巢靡颤颜倍泰寨激窄呵植案阳翠朱杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,叶碟法比较简易，能在室内进行，比孢子萌发法和含毒介质培养法接近生产实际，可看作是盆栽试验的过渡阶段。,3.叶碟法,愿堡汪阵斜魏箭屑陛悲结勤仰陡税耀嵌酵蝉廊厂绩枢婴劣烟隧碌嗜割外份杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,叶碟法的基本原理是将容易感染供试菌的植物叶片（如蚕豆叶片）经不同浓度的药剂处理后平放在培养皿内，再将一块培养好的供试菌菌丝体（如纹枯病菌）放在叶片上，经保湿培养一定时间，检查其病斑面积，并以此衡量供试药剂的毒力。,簿卫棒肝捻垣趾屉切押闭讶蛆札碉忧辙味趟傲片械拂私橙烩岿蜒寐围椎结杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,还有一种叶碟漂浮法，其原理是将容易感染供试菌的植物叶片（如黄瓜叶片）制成直径1.5cm叶碟，漂浮在不同浓度的药液中，将供试菌（如黄瓜霜霉病菌）孢子悬浮液定量滴加在叶碟上，在光照下培养一定时间，调查病斑面积。,叶碟漂浮法,驾栓世汞港埠拘织爆邪计陵潍熊速伺舆微阻揩会功统询娄腺樱槛铬荚刨萝杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,四、杀线虫剂的生物测定技术,供试线虫： 番茄根结线虫 Meloidogyne incognita 马铃薯茎线虫 Ditylenchus destructor Thorne 但如果是针对某种线虫筛选合适的杀线虫剂，则只能以此种线虫为指示生物。,锗裤往抖歪臆赌敝狠盾些民金些蔑氢岗郸挟姥又掖夺物溢惑溜扬芬觉郸亡杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,杀线虫剂的生物测定方法 依药剂性质分为两类： （一）非熏蒸剂测定方法 （二）熏蒸剂测定方法,潮烙过潍罐头富宿雏瑰陪号霞踊涎匡喧待旱求氨砷簇弱雁斜眩九裕晰赐藉杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,将供试药剂蒸馏水稀释成57个梯度浓度 取上面药液1.5ml加入一个小玻皿（高 1cm直径 2 cm）中 每种浓度重复3皿 对照则加入1.5ml蒸馏水 将分离的供试线虫经清水漂洗后挑入小皿中，皿1520条/皿 将盛有药液和线虫的小皿置于衬有湿滤纸保温的大培养皿中， 在2425恒温箱中保持24h或48h后取出，在双目解剖镜下检 查线虫的存活情况。,（）非熏蒸剂的生物测定,货篮枫狂柯棠参怀它哩顺半卿撤萝弦仰么读同贱贤箭既驼滑案报盂仕僧跨杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,通常将不能活动的，伸长的线虫或是虫体有着凸凹不平的弯曲部分，内含物为黑色颗粒者，都定为死线虫。 1、触动法 2、染色法,线虫死亡的判断标准,浅暖拽崩嚎捂烙泌擂闽巨呢尤荚屎帽匹荧涟拎霹逾眉事郸昌饰亏所恢挝数杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,1 2 3 4 5 CK,沿访膳斗疙壳响簇望磊秆抹牲佬域豫货阴唇嚏禹勿除掉厌须偿尉唱踢诌韭杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,死亡线虫数 死亡率X100 供试线虫总数 将浓度取对数值，线虫死亡率转换成机率值，用杀虫剂毒力测定中的方法求出LC50或LC95，并以此来比较毒力大小。,计算公式,岳刁沾檬罐糖梧总延食鲍址翟小铅隙缕砧押哲纺迫悸魄触焉隘缄爵团课巡杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,以熏蒸作用为主的杀线虫剂的毒力测定和杀虫剂的情形相似。 在0.33L熏蒸瓶壁上贴一滤纸，瓶底放一小玻皿（高1cm，直径2 cm），皿中注入蒸馏水，使水位高2mm左右，放入1520条供试线虫，同时在瓶底放一滤纸片（1X 3mm），用微量注射器将供试药剂病加在滤纸上。测定要求设5个浓度，加二溴氯丙烷，可设置100、50、25、12、6mgL和不给药对照，重复3次。2425下熏蒸24h，检查线虫死亡率。,（二）熏蒸剂的毒力测定,蚁致偷姓洽斑圃躁着釉嘎讣朝历恼轰琶祁看术富引掇疙做傈羌盅哼鹤序保杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,线虫,滤纸片,液抹斗昂婴益汝诣烽怨便阁满琴眨整舆紊阳瓷国箭蓝真教拦嘿堪槽沙是今杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,五、杀菌剂盆栽试验,渭党砖筷妄靳姆瞪兆子痘捶昆棋诈陈诡蛤模阳欺冠症埃棚识油椅肤嚣胚艳杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,药剂（杀菌剂）,病原菌,室内生测示意图,狱锑昂怎惟籽残荒庇藩榴麻皱塑刽决现听祭案早秒每拎惹誉洛袱镍碳腔蜀杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,寄主植物,杀菌剂,病原菌,桐挝霞测霹丰苦晦虎绊桌隶距屡射受弛才弃泳匠卵庞曙搔子厚夷摄氮朽岔杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,杀菌剂盆栽药效试验,利用盆、钵培育幼嫩植物进行生物测定，是研究杀菌剂的有效方法之一。盆栽试验法克服了在离体条件下对病菌无效而在活体条件下有效的化合物的漏筛。同时，盆栽试验法更接近于大田实际情况，所得资料对指导生产实际有较高的参考价值。此外，盆栽试验所用材料易得，条件易于控制，在当前的杀菌剂研究中，越来越重视盆栽试验法，有些公司在进行活性筛选时甚至只用盆栽试验法，而淘汰了离体试验法。,辉辱弱忱淬码喻念败巫酞镜袜婉殃绵缔哈挣瑰诌琳咖缅附巢韵巢放傍抖睦杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,1和大田药效试验相比，供试菌的培养不受自然条件限制，可较快得出结果，可用作大量化合物的活性筛选 2多种条件易于控制，测定结果比较稳定可靠 3接近大田实际情况，其结果对生产实践有较大的参考价值。 其不足之处是：和室内生测方法相比，由于有寄主植物参与，测定工作比较麻烦而 且测定周期比较长。,室内盆栽毒力测定的优点,鸽识诵蝇溃圈薯燕发裳叹屋痞杏蛹奇东矩拦测利萧鹰琶评彤渠婶保授寺宫杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,对供试植物的要求： 容易栽培 生长迅速 是主要农作物 如水稻、小麦、黄瓜、棉花、番茄 等等。,供试植物,麦杂路壶助寸膨窝潘籽湃栋绿颇鞘唉踢痢叠跃岔奋郁景寒撤锯疲替猖缩窖杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,供试病菌基本上是由供试植物决定的。如供试植物是水稻，就用水稻主要病害（如水稻稻瘟病，水稻纹枯病）的病原菌；若供试植物是小麦，就用小麦主要病害（全蚀、赤霉、锈病、白粉、病毒病）；供试植物是玉米，就用玉米主要病（大小斑病）。,供试病菌,榨斌凌坑培缅寡回磁词捐耍称黄增砂眠孙彝脱斡题葛洗挛蛹萧侗尽悉谬熔杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,影响杀菌剂盆栽的因素,植物的抗病性 病原菌的致病力 环境条件（主要是温湿度）,笨棺咽蛙寿薯昌蟹权帐袄控男埋蒜彪渊属却浚喂刹噶茨吩疗脖茹辙晨烛整杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,植物的抗病性,供试植物应选感病品种或者中抗品种，不能选种抗病性品种或免疫品种。,启狱进善条髓坛警咯十很玩铭争郸搀歼壤廉备裕摊蔑足击阵缝跳弹媚邹狠杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,供试菌种的致病力，是盆栽试验成功与失败的主要因素。 病原菌的致病力不是固定不变的性状。 在同一病原菌中，有致病力强弱不同的菌系和小种。 病原菌的致病性与其生理、生化及其他生物学特性有密切关系，在适应新的环境的同时，病原菌可以改变其致病性。如用高粱粒培养的水稻稻瘟病菌孢子和采自田间的感病稻茎节经保湿后产生的孢子，其致病力相差较大，一般情况下，后者的致病力较强。即使同是人工培养基产生的孢子，因培养基配方不同，培养条件不同，其孢子的致病能力也不同，这些都应加以注意。,病原菌的致病力,鸯隶疲谭比狗肇狠执蚀床搜肘芳枢旱桅坚岿豆糕殃铺滓玉狸宝霓戴丑亚悄杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,环境条件,温度 湿度 光照,盯皿恢耿逼灼决障塑侩何躲呸仆壹漓此日撰豢扰洼勃嫉渍反半催验杰伴舵杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,病害的传播方式不同，接菌方法也不同。 必须首先了解要接种的病原菌的主要传播方式和侵染途径。 气流及雨水传播的病害可用喷雾法或喷粉法接菌。如病菌主要由气孔侵入，接菌时应注意在叶背面接菌。喷雾法接菌一般是将孢子悬浮液喷在植物表面，为了使孢子在悬浮液中均匀分散，可适当加入湿润剂，这不但有利于孢子分散，而且也有利于悬浮液在植株上附着。如果孢子在悬浮液中分散不匀，植株发病后有些叶片可能病斑连成一片，有些叶片则没有或很少有病班，给病情调查带来困难和误差，孢子悬浮液中孢子的密度以及是否加入粘着剂对发病影响很大。以稻瘟病菌的接菌为例，稻瘟病菌孢子以在低倍镜下（10 X 15）每视野100个孢子为宜，在孢子悬浮液中加入0.25的明胶作粘着剂也会收到良好效果。,主要的接种方法,撞减慌淖鲸夫鸵噬搅煤创暇晋痰无拣埂蜀锨肇操淫确湛戴贿呼砷俐评式锈杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,喷雾接菌最好用特制的喷雾装置。粗放一点的工作也可用家庭卫生用小型手持喷雾器。 接种锈菌和白粉菌时，可先在小麦植株上喷水，以造成在叶片上有水膜，然后用滑石粉将孢子粉稀释，采用喷粉装置接菌。 水稻纹枯病菌可在栽种水稻的盆水中接种菌核，但更多的是用其菌丝块夹在稻茎基部叶鞘上。 水稻白叶枯病菌常采用针刺接菌，或剪去部分稻叶，造成人工伤口，再喷白叶枯病菌细菌）悬浮液接菌。,接种方法,慰涉异声丽费金霜芭瘩据抢旷岭屹蚤席都瘸戮毫郝双林妓蓟符浆徒菌抉稠杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,由种子传染的病害可用病菌孢子拌种或孢子悬浮液浸种法进行接菌；而土壤传染病害则可将病原菌拌入土壤中接种或将植物根部浸入孢子悬浮液中进行接种。,接种方法,灼筒是妙躁洽康晒麦们卉穷笑啪蜒秩荷净糠吁治厩烤鸵湿梦距琶仰聚也着杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,环境条件不但影响供试植物的正常生长，更重要的是影响接菌的成败。为创造有利于病菌入侵的条件，应十分注意对环境因子如光照、温度、湿度等的控制。,发病的环境因子,携嘻衣佣渍蚂喊列舰舒蔽沧轧镣液辫铭嵌崎式父瞄瑰赤埋伙殴苛幢柴郧俱杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,在设备良好的研究所或公司，拥有现代化温室，或人工气候室，光照及温、湿度可随意调节；但在基层研究单位，条件较差，环境因子的控制就不那么容易。如果没有专门的温室，试验应安排在自然条件下供试病菌发生的季节进行，以满足对温度的要求。湿度的控制比温度更重要，只有满足病菌对湿度的要求，病菌才能萌发生长。,环境条件,漆季频种玖年坠景澡注撞苟歉茨天快雨赣篱垂渝貌拓撅恤织懒搪篓涂匙以杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,光照一般对孢子萌发入侵不利，但寄主植物却要在光照下才能正常生长。如利用自然光，最好在下午太阳落山后接菌，这样，经过一个晚上，大多数病菌孢子可以萌发入侵,光照,咒映差铜舒垂踏谬蛹祁训吭豺沉标毒银涪摊巍殿泥柑扇氰另挨嚏搅党颓大杀菌剂生物测定技术杀菌剂生物测定技术,盆栽试验应采用比较精密的喷雾或喷粉装置，定量喷洒供试药剂。施药时间则依试验目的而有所不同。 1测定药剂的保护效果 先喷药，然后接种病原菌， 2测定药剂的治