脆性X综合征.ppt

脆性X综合征,陆军军医大学西南医院 内分泌科,X染色体结构异常遗传病,脆X综合征 Xp22 缺失综合征 Xq26 缺失综合征 其他位点结构异常病例,病 例,一个八岁的男孩有类似多动症以及轻度智力障碍，母亲家族男性有智障发病史，男孩被检出下颌骨宽大，尖耳朵，并且睾丸肥大。 男孩母亲基因可能存在同义突变。判断男孩患有脆性X染色体综合征，一种X连锁不完全显性遗传病。脆性X综合征（fragile X syndrome， FXS ），又称Martin-Bell综合征，,临床表现：主要表现为中度至重度的智力低下，语言障碍，算术能力差，性格孤僻，伴有特殊面容:长脸、方额、前额突出、大耳朵、高腭弓、嘴大唇厚、上门齿长、下颌大并前突、巩膜呈淡蓝色，青春期后男性患者可见明显大于正常的睾丸。无论男女患者，身高和上肢长度均比正常值低，且手指关节的活动度明显增加。指纹中桡侧箕、斗形纹和弓形纹的频率增加，常有通贯手。此外，患者还会出现胆怯、忧郁、行为被动、有精神病倾向，部分患者有多动症。,主要为男性发病。在群体中男性基因频率为1/1000，男性患病率为1/1250，女性患病率为1/2500， 正常男性传递者的频率为1/5000，女性中的频率为1/700（受累者为1/2000）。因此fraX基因的总频率1/850。其发病率是仅次于唐氏综合征的智力低下性疾病，在所有男性智力低下病例中，约有10%20%为本征所引起,发病率,FXS,群体发病率约为1/2 500； 男性发病率为1/1 5001/1 000（外显率80%）； 女性发病率为1/2 000（外显率30%）。,发展由来,1943年Martin和Bell于伦敦首次报道这种X连锁的智力低下家系 1969年美国Lubs在2个具X连锁智力低下的无血缘关系的家系中，发现均带有一条长臂末端具随体样结构的C组染色体，并经放射自显影证实为X染色体，称为“标记X染色体” 1977年澳大利亚Sutherland，定位于Xq27，并命名为脆性部位（fragile site），脆性X综合征因此得名 1991年脆性X综合征致病基因被Verkerk等用定点克隆技术在Xq27.3附近发现，命名为脆性X智力低下基因1（fragile X mental retardation 1FMR1），此时该病才被确定为单基因遗传病。,脆性X染色体综合征,在病理情况下，某些染色体断裂发生的频率很高，称之为脆性染色体。 在无（低）叶酸的培养基中培养后，在Xq27-28部位容易出现断裂或裂隙。 病人以男性多见，呈智力低下，孤僻、长脸、大耳、大睾丸、大生殖器、颌部突出等状；在女性症状较轻，约1/3表现为轻度智力障碍。,脆性X染色体是指在Xq2728带之间的染色体呈细丝样，导致其相连的末端呈随体样结构，由于这一细丝样部位容易发生断裂故称脆性部位。,FMR1基因位于染色体Xq273区，长38 kb，由17个外显子组成。其5 端非翻译区包含一个CGG重复序列，后者上游250 bp处有一CpG岛。CGG重复序列具有多态性。 研究者根据CGG的重复次数将其分为4种基因型，即 正常型(CGG重复次数230)。 全突变者FMR1基因上游启动子区域的CpG 岛及附近的序列可发生甲基化，造成FMR1基因转录失活，其产物脆性X智力低下蛋白(fragileX mental retardation protein，FMRP)表达缺失，从而导致一系列的症状,核型:患者核型为：46， fraX(q27)Y。 脆性X染色体 发生原因：一般认为男性患者的fraX来自携带者母亲。女性由于有2条X染色体，故携带者女性不会发病，但实际上约有1/3女性携带者有轻度智力低下，这一事实可用Lyon的X染色体失活学说来解释。,FXS是一种单基因遗传性疾病 ，是由于Xq27.3的脆X智力低下1 (fragile X mental retardation 1 ,FMR1)基因突变导致其5端(CGG)n三核苷酸重复序列异常扩增，当扩增达到一定数目后便会出现该基因异常甲基化,使FMR1基因的转录功能降低,导致其编码的脆X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein ,FMRP) 减少,引起相应的症状。,遗传病理学FMR1基因,FMR1（Fragile X Mental Retardation 1） 定位Xq27.3，全长约38kb，17个外显子和16个内含子 5UTR有一个(CGG)n 三核苷酸串联重复序列，重复序列中每9-10个CGG重复有1个AGG嵌入，(CGG)n 在重复片段长度和AGG嵌入模式上都存在多态性，在其上游大约250bp处有一个CpG岛。,三种动态突变和非动态突变。 FMR-基因的前突变(premutation)：MR-基因(CGG)n 结构中n 拷贝数扩增至53230时，携带者虽然表型正常，但在传代过程中易发生进一步的扩增，使后代的CGG重复数大为增加，并有异常表型出现。智力水平正常。 FMR-基因的全突变(full mutation)：前突变状态(CGG)53230次扩增至230次时，100%男性携带者表现为典型的脆性X 综合征，53%的女性携带者表现出轻重程度不等的智力低下，此时称为全突变。与智力低下直接相关。,FMR-基因的回复突变：处于前突变或全突变状态的FMR-基因的CGG结构在传代过程中其拷贝数目会发生一定范围的缩减，称为FMR-基因的回复突变。多发于父源性传递。 FMR - 1 基因的非动态突变：指 FM R - 1基因还可发生碱基置换和缺失型突变, 这些突变携带者和FMR - 1基因动态突变的临床表现相同, 但缺乏 X 位点脆性特征。,遗传病理学FMRP蛋白,脆性X智力低下蛋白（FMRP） 它是一种RNA结合蛋白，其结构中含有结合RNA的功能片段、细胞核输出讯号区段和细胞核定位讯号区段。FMRP能够和特定的mRNA结合，并将之从细胞核携带运输至细胞浆特定的位置翻译，可以在细胞核和细胞浆之间来回穿梭，是一种调控蛋白质合成的翻译抑制剂，影响神经细胞突触的可塑性。,遗传病理学,FMR1基因突变 FMRP不表达 FXS,遗传机制,细胞学特点,脆性X染色体（Fragile X ）,FXS的发现,遗传机制,分子机制,脆性x智力低下1基因 Fragile X Mental Retardation 1 Gene,FMR1 gene,Xq27.3,细胞学特点,全突变 Full mutatin,前突变 Premutation,Nomal,n45,50n200,n200,2019/9/28,22,normal controls (N) premutation carriers (P) full mutation patient (F),2019/9/28,23,FMR1基因的结构,The FMR1gene, depicting the K-protein homology (KH) domains and the Arg-Gly-Gly triplet (RGG) box, involved in RNA binding, the nuclear localization signal (NLS), transporting the protein into the nucleus, the nuclear export signal (NES; the consensus sequence LRLERLQID is indicated), exporting the protein from the nucleus, and coiled coil (CC) domains, involved in proteinprotein interactions. In addition, the I304N missense mutation found in a single, most severely affected patient is indicated.* * R. Frank Kooy, Rob Willemsen and Ben A. Oostra， MOLECULAR MEDICINE TODAY, MAY 2000 (VOL. 6),2019/9/28,24,*Kenneson A , Warren ST. Semin Reprod Med , 2001 ,19 (2) and Monnier - Barbarino P , Forges T. J Gynecol Obstet Biol Reprod ( Paris) , 2002 ,31 (4),前突变： 一般前突变携带者不出现症状，但最近研究表明，女性携带者可能出现卵巢功能可能不正常，携带者女性有较高的出生双生子倾向,也可能有早熟卵巢衰竭( POF) 和过早绝经*。,2019/9/28,25,95以上的脆性X综合征发病的分子遗传学基础是FMR1基因(CGG)n结构扩增的动态突变。 5以下是由于FMR1基因的错义突变和缺失型突变影响了FMRP的正常结构导致的。,遗传病理学嵌合体,15-20%的脆性X综合征存在嵌合现象： 大小嵌合 体细胞中前突变与全突变嵌合 甲基化嵌合 基因超甲基化与非甲基化嵌合,詹建英， 赵正言.脆X综合征的分子基础及其认知研究进展.国外医学儿科学分册，2007，32（2）：111-112 Comish K，et alDo woman with fragile X syndrome have problems in switching attention ：Preliminary findings from ERP and fMRIBrain corgni，2008，54(3)：235-239,研究发现FMRP广泛分布在神经元及树突，调节蛋白质的合成，影响突触发育和脑的可塑性，被认为是学习与记忆的关键分子。 FXS具有独特的行为认知表型。 因此对FMR蛋白功能及FXS认知等脑功能的研究有望进一步认识本病，改进治疗和教育方式，并有望揭示人类认知的奥秘。,参考文献：,研究进展,临床特征FXS（1）,智力障碍 男性患者大多数都表现为中度至重度智力障，这与甲基化嵌合体及前突变/全突变嵌合体有关 约有30%-50%的女性全突变携带者患病，大多数表现为难以觉察的或轻度的智力障碍，女性全突变携带者是否患病及患者智力障碍的差异是由于X染色体差异性失活所致。,临床特征FXS（2）,特殊面容 颜面瘦长 前额突出 耳朵大 下巴前突下颌大 嘴大唇厚 上门齿长 腭弓高 头围大 巨睾 青春期后表现明显,临床表现：主要表现为中度至重度的智力低下，语言障碍，算术能力差，性格孤僻，伴有特殊面容:长脸、方额、前额突出、大耳朵、高腭弓、嘴大唇厚、上门齿长、下颌大并前突、巩膜呈淡蓝色，青春期后男性患者可见明显大于正常的睾丸。无论男女患者，身高和上肢长度均比正常值低，且手指关节的活动度明显增加。指纹中桡侧箕、斗形纹和弓形纹的频率增加，常有通贯手。此外，患者还会出现胆怯、忧郁、行为被动、有精神病倾向，部分患者有多动症。,2019/9/28,31,女性患者： 由于女性有两条X染色体，异常X染色体随机失活，故其智力低下程度较轻，多有行为及情感异常，体征亦不如男性患者明显。,临床特征FXS（3）,语言障碍 许多患者都具有与智力水平相应的语言障碍，较差的听力和记忆力，有的患者在受到刺激时，不仅词语少、吐词不清，而且没有正确的语言表达形式，有的还有轻度的发音缺陷、典型口吃。,行为异常 可分为截然不同的两类： 胆怯、忧虑、性情孤僻、表现礼貌、且有一定技能 表情欢快、好动、情绪烦躁、手势能力增强，甚至行为暴躁,临床特征FXS（4）,结缔组织异常 皮肤松软，张力减弱，关节松弛过度伸展， 扁平足，关节脱位，二尖瓣脱垂等 神经内分泌功能障碍症状 出生过重、巨头、身材过长等过度生长表现 其它: 斜视、癫痫,临床特征FXTAS,脆性X相关性/震颤共济失调综合征（FXTAS） 迟发的进行性小脑性共济失调和意向震颤 认知能力衰退，包括记忆丧失，行为困难，焦虑，孤僻，痴呆 震颤性麻痹，周围神经病变，下肢近端肌无力和自主机能障碍等 女性患者少见,讨论： 对于一个怀疑是脆性X染色体综合征的智力低下患者，如何确诊？,诊 断,细胞遗传学诊断,核型分析,诊 断,细胞遗传学诊断,基因诊断,可用RFLP连锁分析、DNA杂交分析、PCR扩增等方法来检出致病基因。,Xq27,脆性位点是一种在染色体特定位置上出现的断裂点，呈一裂隙。,脆性位点是在一定条件下出现的，如缺乏叶酸的培养基或加入5-氟脱氧尿苷等药物。,这种脆性位点是按孟德尔遗传规律进行传递的。,脆性位点（Fragile site）,脆性X染色体（Fragile X, Fra X）,根据2005年最新ACMG指南 对于以下几种临床情况应进行分子生物学检测： 智力缺陷, 发育迟缓, 性格孤僻, 行为体征疑为脆性X综合征者； 具有不明原因的智力障碍者； 具有脆性X综合征家族史者； 具有脆性X综合征或不明原因智力缺陷家族史，生育前进行遗传咨询者； 脆性X综合征携带者母亲的胎儿； 卵胞刺激素升高并伴有卵巢早衰的妇女，特别是具有不明原因智力缺陷家族史者； 未明原因的新发震颤/小脑性共济失调患者，特别是伴有不明原因的智力缺陷家族史者。,FXS实验室诊断方法有： 细胞遗传学、 Southern印迹杂交、 聚合酶链反应（PCR）、 RT-PCR 免疫组化分析,1.1 细胞遗传学检测,该方法至今已发展成熟-诊断的重要指标。 培养中期细胞染色体Xq27显示脆性位点大于4%为阳性。甲氨蝶呤或5-氟脱氧尿苷可诱导出脆性位点提高显现率，与原位杂交荧光技术结合可分析检测数量和结构的异常并提高图谱分辨率至10万bp。fra(X)并不是在所有的中期细胞中都能找到，标本来源于外周淋巴细胞、羊水、绒毛或脐血。一般智力低下男性患者fra(X)的表达率为10%30%。年龄较大、表型正常的女性携带者可不表达，表达常低于5%。故不用于对表型正常的女性携带者的诊断。该法费时费力、检出率低于50%，且只能对男性患者及部分女性患者做出诊断，不能检出不全显性患者及女性杂合子，对于男性患者也易产生假阴性。所以应用较局限。,2019/9/28,44,2019/9/28,45,1.2 Southern印迹杂交法,FXS 5端的（CGG）n的异常扩增及CpG岛异常甲基化使其上的特异性酶切位点消失，需用限制性核酸内切酶识别、结合并切割特异性序列，产生不同长度的核酸片段，用于诊断。根据待测片段的大小选择合适内切酶。 全突变使用HindIII或EcoRI可得到很强的杂交信号，不完全突变需使用PstI方可产生清晰的高分辨条带。,目前认为应用较远侧探针（StB12.3）对双酶解（如EcoRI/EagI）DNA样本进行杂交，可检出全部前突变和全突变等位基因及嵌合体状态，同时可了解甲基化状态，是最可靠的诊断方法。Southern印迹杂交法缺点为：需要DNA样品多、需要同位素标记、操作复杂、费用大、耗时长、不易推广；若酶解不完全会产生杂交带，可产生错误诊断；较难鉴别(CGG)n大的正常个体和小的前突变个体；有较大的漏诊率和约5 %的误诊率。,1.3 聚合酶链反应ms-PCR技术,为目前快速、准确检测（CGG）n重复的方法，传统的聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction,PCR)技术可以检测正常个体及小片段的前突变等位基因的（CGG）n重复数。对于较长片段的前突变及全突变患者，由于高的GC含量，序列内部易于形成发夹结构不易扩增，可利用甲基化敏感性聚合酶链反应（methylation sensitive Polymerase Chain Reaction ;ms-PCR），引入特异性的引物使扩增不出来的等位基因产生smear条带，通过不同的探针标记引物，利用毛细管电泳法检测PCR扩增产物，可以准确的检测（CGG）n重复数。结合普通PCR及ms-PCR技术，可以鉴别正常个体、前突变、全突变男性及全突变女性。由于PCR技术优先扩增较小片段的等位基因，因此对于呈嵌合型的患者，也会产生PCR扩增产物，易于产生假阴性。PCR技术是快速筛查脆性X综合征的基因诊断方案。难以扩增出全突变的等位基因，因此限制了它对于脆性X综合征患者临床诊断方面的应用，PCR技术和Sothern blot技术的联合应用，可以弥补相互之间的缺陷。,1.4 逆转录聚合酶链反应 RT-PCR技术,绝大多数FXS征男性患者无FMR1基因的表达，而女性患者的FMR1基因是杂合的，FMR1基因表达降低，但可检测到。所以RT-PCR在男性患者、缺失或点突变的个体是检测不到扩增引物，而对于正常个体、前突变及女性可以获得扩增条带。Hmadcha A等用RT-PCR方法检测该FMR1基因的表达。 Wu LQ等设计合成了2对特异性引物检测位于X 染色体上的HPRT基因的转录产物，通过巢式PCR技术对cDNA进行扩增、检测。有助于FRAX患者的诊断及表型的预测，对于遗传咨询有较大的帮助，不能鉴别女性患者及检测前突变状态，从而应用有限。,1.5 FMRP免疫组化分析,应用此方法检测FMRP的表达量。可诊断由于（CGG）n的扩增导致的脆性X综合征患者，及检出由于缺失、点突变导致FMR1基因不表达的患者，同时简便、经济、快速，适用于群体筛查，其敏感性100%，特异性97.5%。但由于女性患者体内有一定比例的活性X染色体，且具有全突变的等位基因多位于失活的X染色体，大多数淋巴细胞的FMRP降低不明显，易于形成假阴性，且由于前突变等位基因能正常转录，FMRP表达多在正常范围内，亦不适用于前突变携带者的筛查，因此仅适用于男性患者的诊断。Rife M等比较了PCR和FMRP免疫组化检测在人群筛检方面的差别，认为PCR是最合适、方便、省时的方法。但对于那些PCR检测失败的患者，推荐应用该方法。,1.6 产前诊断,2005年ACMG指南建议妊娠10-12周的FXS携带者妇女用绒毛膜绒毛标本，可显示前突变。CVS细胞不同于外周血细胞，它不存在甲基化的X染色体失活，全突变的FMR1基因5-UTR的三核苷酸（CGG）n重复序列甲基化也可有可无。利用FMR1基因甲基化和X染色体失活诊断全突变有失准确性。若CVS结果阳性，应于妊娠15周抽取羊水细胞排除全突变和嵌合体状态。,2.FXS治疗新进展,目前无有效的治疗方法。 近来在FXS的治疗中最明显的进步就是在动物实验中认识到了FXS潜在的缺陷和发展了的可能的治疗。,2.1 一般治疗,叶酸可以“修复”FXS细胞传代时的脆性位点,使FMR基因表达功能正常的FMRP,改善智力状况。同时还可予维生素C、维生素E、微量元素锌、硒等。 智低者营养脑细胞,茴拉西坦、吡拉西坦、胞二磷胆碱等可改善症状。癫痫可按发作类型正规抗癫痫治疗。 中医中药疗法,应用加味六味地黄丸培补肾元,针灸推拿促进智力发育,改善小儿痴呆。治疗效果与患儿年龄和原发神经疾病有关。16岁智低和痴呆患儿年龄较大效果不佳,癫痫患儿服药不规范控制不良。,2019/9/28,54,采用叶酸治疗，剂量一般为0.52.0mg/kg/日。据报道，可改善患者行为和运动能力、语言质量等，一般认为对智力改善不明显，对成年患者无效。 另有报道其他治疗尤其是中枢神经系统兴奋剂效果明显优于叶酸，多数脆性X染色体综合征男性和受累女性出现注意力缺乏、活动过度，兴奋剂如哌醋甲酯、右旋苯异丙胺，以及抗癫痫药苯妥英钠均可使用，在相对低剂量时患者反应最佳，剂量太大时易出现情绪不稳和爱发脾气等现象。,2.2.1针对FMRP表达减少的治疗,2、2、1 针对FMR1的基因治疗 FMR1突变导致FMRP减少引起FXS的发生，FMRP是一种 mRNA绑定蛋白，其在中枢mRNA 翻译、转运及靶向作用中起重要作用。FMRP负相调控mRNA翻译为蛋白质.Rattazzi等提出基因治疗的可能性，通过给Fmr1 KO小鼠注射一种小的、可扩散的带有FMR1 cDNA基因的腺伴随病毒，此病毒包含 5启动子区和 3 非翻译区的基因，通过渗透作用通过血脑屏障，从而传递Fmr1 cDNA进入大脑。 Musumeci 等发现在Fmr1 KO小鼠予以人类FMR1基因和FMR1 cDNA治疗，和野生型FMR1小鼠比较听源性癫痫的易感性，由于听源性癫痫具有年龄易感性，所以在不同的年龄检测，发现听源性癫痫在6 个月大的小鼠可以完全治愈 ，而在成年小鼠仅可部分治愈。,2.2.2 FMRP蛋白的添加治疗,最近文献报道：蛋白转导领域能够转导大分子蛋白进入细胞甚至进入大脑。来自人免疫缺陷症病毒的A蛋白：TatFMRP融合蛋白，利用腹腔注射可以传递大分子进入细胞并通过血-脑屏障。置入FXS成纤维细胞和FmrKO小鼠的初级培养物神经元，FMRP蛋白的摄取效率和水平在神经元比期望的要低的多。,现在基因治疗可能不是FXS治疗最好的方法.人类脆性X染色体相关基因FMR基因包括FXR1基因和FXR2基因。分别定位于X .q27.3，3q28和17p13.1。它们分别翻译蛋白FMRP, FXR1P和 FXR2P，这三种蛋白主要存在于细胞浆中在脊椎动物中表达广泛，FMRP在大脑和睾丸中表达最高，FXR1P主要在于横纹肌表达，但未发现FMRP和 FXR2P在横纹肌中表达，至今还没有发现FXR1和FXR2与任何病理缺陷相关。但由于由于FMR1基因突变导致其编码的FMRP蛋白减少导致FXS，同时FXR1P和FXR2P是否会在由于FMR1突变导致的FXS中起到补偿作用，至少部分补偿，至今还是一个未知话题。,FMRP蛋白与mRNAs的转录和翻译有关，靶mRNAs水平在FXS脑区没有改变，但是由靶mRNAs转录的蛋白L-型Ca2+通道亚单位和 MAP1B在特殊脑区下调，提示FXS靶编码蛋白的表达有缺陷。L-型Ca2+通道参加记忆突触的形成。2003年Veng等发现Ca2+通过L-型电压敏感Ca2+通道增加造成成年小鼠的海马CA1 区的Ca2+增加，通过L-型Ca2+通道的Ca2+注入可能对记忆的形成有害。利用L-型电压敏感Ca2+通道拮抗剂尼莫地平长期治疗与年龄相关的操作记忆缺陷和海马a蛋白的增高，尼莫地平可改善年龄相关的操作记忆缺陷和降低海马a蛋白的表达。海马CA1区与年龄相关的操作记忆减退及a蛋白的增加与记忆缺陷相关。其中年龄可能起到重要的作用在记忆减退的形成中。,邓等利用尼卡西平给予7周龄FMR1 KO小鼠进行治疗，尼卡西平用法15mg/kg体重量，每天腹腔注射一次。连续注射30天后利用 Morris 实验评定发现尼卡地平对其学习记忆的无明显改善，但利用旷场行为实验和可孔板探究实验发现尼卡地平可减少其自主活动的兴奋性。尼卡西平对FMR1基因敲除小鼠的症状具有一定疗效。根据以上Veng等的研究，尼卡地平也许会对不同年龄阶段FMR1基因敲除小鼠学习记忆有影响，因此利用尼卡地平对不同年龄阶段的治疗FMR1基因敲除小鼠以观察其疗效也有待于进一步研究。,2.4 亲代谢性谷氨酸盐受体5 拮抗剂的应用 (metabotrop ic glutamate recep tor 5, mGluR5),mGlu5受体主要在皮质、髓纹、海马、小脑表达。mGluR5激动剂能使实验动物产生脆性X综合征相似的病理改变和临床症状。 mGluR5抑制剂能够部分逆转脆性X综合征模型动物的异常行为。提示mGluR5信号的过度活动可能参与脆性X综合征的发病。FMRP是一种mRNA结合蛋白,可作为翻译抑制因子负性调节突触后膜mRNA的翻译和表达。因此推测FMRP缺乏和减少可能导致mGluR5激发的mRNA翻译增多,参与神经系统发育的蛋白过度表达及影响树突棘的发育。,最近的研究表明在培养的普通大鼠海马神经元中加入mGLUR5激动剂DHPG,树突棘表现出类似FMR1 KO小鼠的形态异常。利用mGLUR5抑制剂：如2-甲基-6-苯基嘧啶（2-methyl-6-(phenylethynyl)pyridine MPEP）治疗、较低浓度的MPEP和另外几种不同的mGluR拮抗剂分别用于减低mGluR活性，可回复FXS模型的先天的求偶行为. Parnass 等报道MPEP可使树突棘的形态在适当外界干预的条件下数分钟内就发生改变。MPEP可以改善FMR1 KO小鼠的激越症状：癫痫和焦虑。及孤独症。也许还可以改善认知障碍。,2.5 糖原合成酶激酶-3抑制剂的应用 （glycogen synthase kinase-3 GSK3）,并用mGluR5拮抗剂和GSK3抑制剂没有垒加作用。相反表现为它们的同步激活，用于抑制mGluR5的同时也导致了GSK3的抑制.推测GSK3可能是FXS病理学的一个基本的中间步骤