蛋白质的结构.ppt

二、蛋白质的结构,蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链结合而成的生物大分子。 蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。（20种aa的平均分子量为110） 蛋白质分子量变化范围很大, 从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。,1.3蛋白质的分类及化学结构,1952年丹麦人Linderstrom-Lang最早提出蛋白质的结构可以分成四个层次: primary structure 一级结构： 氨基酸序列 secondary structure 二级结构： 螺旋，折叠 tertiary structure 三级结构： 所有原子空间位置 quanternary structure 四级结构： 蛋白质多聚体 1969年正式将一级结构定义为氨基酸序列和二硫键的位置。 介于二级结构和三级结构之间还存在超二级结构（二级结构的组合）和结构域（在空间上相对独立的三维结构实体）这两个层次。,蛋白质的结构层次,1 多肽,一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。,多肽的结构,由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。,肽键将氨基酸与氨基酸头尾相连,肽链中的肽平面,肽键平面,肽键,肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。 组成肽键的原子处于同一平面。 肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。 在大多数情况下，以反式结构存在。,两个肽平面以一个C为中心发生旋转,在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为多肽的氨基酸顺序。 通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。 氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln 多肽的命名取从N-端的氨基酸残基开始，称：某氨酰某氨酰 某氨基酸。,四肽的结构,多肽的性质,（1）. 多肽的两性离解 肽在水溶液中是以兼性离子存在的,肽的亚氨基不能解离，因此肽的酸碱性质主要决定于肽链 N端和C端的自由NH2、自由羧基以及R基上可解离的官能团。,多肽的性质,（2）.pK值和pH值 肽中C端的羧基的pK要比自由氨基酸的pK大.肽中N端的氨基的pK要比自由氨基酸的pK小，R基的解离和氨基酸差不多。 pI：肽所带的净电荷为零时溶液的pH。 小肽（25肽）的pI值的求法，先写解离式，找两性离子，把两性离子两边的pK值相加除2即得。大肽不能用此法求。,（3）.旋光性 蛋白质水解所得的各种肽，酶解时不发生消旋，就具有旋光性。 一般短肽的旋光度约等于组成该肽的各个氨基酸旋光度之和. 大肽和蛋白质的旋光度一般大于组成该肽的各个氨基酸旋光度之和.,多肽的性质,(4) 颜色反应,多肽的性质,硝基酚(黄色) 邻硝醌酸钠(橙黄色),多肽的双缩脲反应是多肽特有的颜色反应;双缩脲是两分子的尿素经加热失去一分子NH3而得到的产物。 双缩脲能够与碱性硫酸铜作用，产生兰色的铜-双缩脲络合物，称为双缩脲反应。含有两个以上肽键的多肽，具有与双缩脲相似的结构特点，也能发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色络合物。这是多肽定量测定的重要反应。,尿素 双缩脲 紫红色络合物,天然存在的重要多肽,在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。 但是，也有许多分子量比较小的肽以游离状态存在。这类肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。 如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。,+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Met-脑啡肽 Leu-脑啡肽,L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val L-Orn L-Orn L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu 短杆菌肽S(环十肽) 由细菌分泌的多肽，有时也都含有D-氨基酸和一些不常见氨基酸，如鸟氨酸（Ornithine, 缩写为 Orn）。,习题：,等电点计算： 有一个蛋白质拥有30个侧链羧基（pKa 4.3），10个咪唑基团（pKa 7.0），15个 -氨基（pKa 10.0）。 求该蛋白质的等电点。,2 蛋白质的一级结构,蛋白质的一级结构(Primary structure)包括组成蛋白质的多肽链数目。很多场合多肽和蛋白质可以等同使用。 多肽链的氨基酸顺序。 多肽链内或链间二硫键的数目和位置。 其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。,蛋白质一级结构的测定,蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经知道约十万个不同蛋白质的一级结构。,1 样品必需纯（97%以上）； 2 知道蛋白质的分子量； 3 知道蛋白质由几个亚基组成； 4 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。 5 测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。,测定蛋白质的一级结构的要求,蛋白质和多肽氨基酸顺序的测定,(1)、肽链的拆开和分离 (2)、测定蛋白质分子中多肽链的数目 (3)、二硫键的断裂 (4)、测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比 (5)、N端、C端的测定 (6)、多肽链断裂 (7)、测定每个肽段的氨基酸顺序。 (8)、确定肽段在多肽链中的次序。 (9)、确定原多肽链中二硫键的位置。,酸水解,常用6mol/L的盐酸或4mol/L的硫酸在105-110条件下进行水解，反应时间约20小时。 此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是色氨酸被沸酸完全破坏； 含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；门冬(天冬)酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。,碱水解,一般用5mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。 由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。 部分的水解产物发生消旋化。 该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏。,酶水解,目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（proteolytic enzyme）或称蛋白酶（proteinase）已有十多种。 应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。,测定步骤,(1) 多肽链的拆分。 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。,蛋白质一级结构的测定,测定步骤,几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).,蛋白质一级结构的测定,测定步骤,(2) 测定蛋白质分子中多肽链的数目。 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。,蛋白质一级结构的测定,测定步骤,(3) 二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。,蛋白质一级结构的测定,二硫键的切割与保护,1、过甲酸performic acid 不可逆 CH2SO3H 2、还原氧化 不可逆 巯基乙醇，DTT 碘乙酸等 S-CH2-COOH 3、亚硫酸分解Sulfitolysis 可逆 R1-S-S-R2 HSO3- R1-S- + R2-S-SOH3,测定步骤,可以通过加入盐酸胍的方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。,蛋白质一级结构的测定,作用：这些反应可用于巯基的保护。,巯基（-SH）的保护,(4)测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；,蛋白质一级结构的测定,测定步骤,(5)分析多肽链的N-末端和C-末端。,蛋白质一级结构的测定,多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(Carboxyl-terminal) 。 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。,末端氨基酸测定,N末端： 1、Sanger法 2、Edman法 3、DNS-Cl 4、酶降解法,C末端： 1、肼解法 2、酶降解法 3、硼氢化锂法,Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。 在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。,末端氨基酸测定, 二硝基氟苯（DNFB）法,Sanger试剂(DNFB)标记N末端, Edman 降解法(I),Edman 降解法(II),氨基酸的鉴定、分离纯化,PTH-AA,在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。,末端氨基酸测定, 丹磺酰氯法,氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个地向里水解。 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。,末端氨基酸测定, 氨肽酶法,此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。,末端氨基酸测定, 肼解法,羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根具不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。 目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。 羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键；Y都能水解。,末端氨基酸测定, 羧肽酶法,此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽C-端氨基酸可被硼氢化锂还原成-氨基醇，用层析法可以鉴定氨基酸种类。,末端氨基酸测定, 硼氢化锂,N末端和C末端的测序除了用于未知蛋白质的一级结构的研究以外，最常用于基因工程表达产物的末端分析。,测定步骤,(6) 多肽链断裂成多个肽段。可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。,蛋白质一级结构的测定, 酶解法: 胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶,酸性磷酸酶、弹性蛋白酶,多肽链的选择性降解, 酶解法: 胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，酸性磷酸酶、弹性蛋白酶,多肽链的选择性降解,Pepsin：R1和R2苯丙氨酸(Phe),色氨酸(Trp),酪氨酸(Tyr); 亮氨酸(Leu)以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。 R1不能为Pro。,肽链,水解位点,胃蛋白酶,肽链,水解位点,嗜热菌蛋白酶,thermolysin：R3=Phe, Trp, Tyr; Leu，Ile, Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。 R2和 R4不能为Pro。, 酶解法: 另外酸性磷酸酶、弹性蛋白酶也较常用,多肽链的选择性降解, 酶解法: 另外酸性磷酸酶、弹性蛋白酶也较常用,多肽链的选择性降解, 化学法 (Cyanogen bromide) ： 溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。,多肽链的选择性降解,测定步骤,(7)测定每个肽段的氨基酸顺序。,蛋白质一级结构的测定,ABCDE *ABCDE *A，*AB，*ABC，*ABCD，*ABCDE *A,*A+B, *A+B+C+D+E *A,*A+*B, *A+*B+*C+*D+*E 1 2 3 4 5 结论：A B C D E,FDNB,FDNB,完全水解,部分水解,一般测定步骤,(8)确定肽段在多肽链中的次序。 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。 重叠法 多肽 氨基酸序列,蛋白质一级结构的测定,一般测定步骤,(9)确定原多肽链中二硫键的位置。,蛋白质一级结构的测定,一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链， 再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将可能含有二硫键的肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。,二硫键位置的确定,蛋白质一级结构的实例,蛋白质中氨基酸顺序的测定 用几种酶或试剂把蛋白质水解成大小不同的片段，找出重叠部分，确定顺序。 例1：有一个九肽， 用胰蛋白酶水解得到：（1）Ala-Ala-Trp-Gly-Lys,(2) Thr-Phe-Val-Lys; 用糜蛋白酶水解得到: (3)Val-Lys-Ala-Ala-Trp, (4)Thr-Phe, (5)Gly-Lys; 确定此九肽的氨基酸顺序。,顺序为：Thr-Phe-Val-Lys- Ala-Ala-Trp-Gly-Lys,例2：有一肽链，用下述试剂降解后，结果如下：,1、酸解:(1)（Ala,Asp,Glu2,Lys2,Met,Phe) 2、羧肽酶A:(2)第一次降解出的aa是Glu 3、胰蛋白酶:(3)(Glu,Lys) (4)(Asp,Lys,Phe) (5)(Ala,Glu,Met) 4、CNBr水解: (6)(Asp,Glu,Lys2,Met,Phe) (7)(Ala,Glu) 5、糜蛋白酶:(8)(Glu,Lys,Phe) (9)(Ala,Asp,Glu,Lys,Met),解: (1) 表明此肽是一个八肽 (2) C端的氨基酸是Glu (3) Glu-Lys- (4)_ _ Lys(胰蛋白酶) (5)_ _ Glu(位于C端) (6)_ _ _ _ _-Met (7)由(5)可知Met-Ala-Glu (8)由(3)可知Glu-Lys-Phe (9)由(7)可知_ _ -Met-Ala-Glu,由(8)知Glu-Lys-Phe,所以,(4)顺序为:Phe-Asp-Lys,此肽的aa顺序为:Glu-Lys-Phe- Asp-Lys -Met-Ala-Glu,例3