孙怡群厌氧菌的实验室检查.ppt

厌氧菌的实验室检查,西京医院检验科细菌室 孙怡群,一、 厌氧菌的分布和正常菌群 二 、厌氧培养方法简介 三 、厌氧菌鉴定方法简介 四 、厌氧菌药敏实验方法简介,一、厌氧菌的分布和正常菌群,1.什么是厌氧菌,2.根据对氧的耐受性分类,3.厌氧机理,4.厌氧菌分类的变迁和检索,5.正常菌群中的厌氧菌,厌氧菌（ Anaerobes）是指一群在菌细胞代谢的呼吸链中不能以分子氧作为终末电子受体的细菌，它们以有机物或无机物作为终末电子受体，必须在低Eh，并含一定浓度CO2环境中才能生长的细菌，它们的能量只能来自酵解途径，这类细菌称为厌氧菌。,1.什么是厌氧菌,2.根据对氧的耐受性分类,专性厌氧菌,微需氧菌,厌氧菌,绝对厌氧菌,中等厌氧菌,耐氧厌氧菌,微需氧菌,（1）专性厌氧菌,一般以有机物为终末电子受体，只有在低氧分压（绝对无氧环境）、低氧化还原电势（Eh）中才能生长的细菌，它包括两大类： 绝对厌氧菌：（对氧极端敏感的厌氧菌EosA)只能在0.5%氧分压下生长或暴露在空气中10分钟左右立即死亡的细菌，如齿垢密螺旋体（T.denticola)，月形单胞菌（Selenomonas) 中等厌氧菌： 指能在2%-8%氧分压中生长，或暴露在空气中60-90分钟仍能存活的厌氧菌。临床上多见，如脆弱类杆菌（B.frgilis)、产气荚膜梭菌（C.perfringens)、普氏消化链球菌（P.prevola)以及双歧杆菌属中许多种都属于此类菌。,（2）微需氧菌,在含10%左右氧分压能生存，一般只有在含5%-10% CO2条件中才能生长的细菌如弯曲菌属（Campylobacter）、乳杆菌属（Lactobacillus）、丙酸杆菌属等细菌多属于此类细菌，它包括两大类： 耐氧厌氧菌 ：10%氧分压能存活 微 需 氧 菌 ：5-10% CO2中能存活,兼性厌氧菌,既能在有氧环境中又能在无氧环境中生长的细菌，即既能以分子氧作为终末电子受体，又能以有机物作为终末电子受体；既能通过氧化又能通过酵解途径获得能量的细菌。这类菌严格地说一般不属于厌氧菌的检验和研究范围。,3 .厌氧机理（4个学说）,厌氧菌为什么不能在有氧条件下生长繁殖？,(1) 细胞色素和氧化酶学说,(2)触酶和过氧化物酶 学说,（3）Superoxide dismutase(SOD)学说,（4）分子氧干扰和氧化还原电势学说,1) 分子氧干扰厌氧菌的繁殖 2)分子氧干扰 RNA的合成 3) 一般厌氧菌在 -100mv - 250mv才能生长, Eh比游离氧更重要, 产气荚膜梭菌只要低Eh, 即使环境中有少量氧也生长.,4.厌氧菌分类的变迁和检索,(一)革兰氏阴性无芽孢厌氧杆菌,类杆菌属（Baeteroides) 最初分为3大群,1.B.fragilis group,B. animal group （动物群）,B.fragilis group （脆弱类杆菌群）,2.B.oralis group prevotella 口腔菌群,3.B.melaninoge nicus porphyromonas（产黑色素类杆菌）,类杆菌属 新增4个 菌种,纤维类杆菌（B.gracilis),粪类杆菌（B.caccae),屎类杆菌（B.merdae),便类杆菌（B.stercoris),类杆菌属,包括25个菌种,普雷沃氏菌属,包括17个菌种,卟啉单胞菌属,包括9个菌种,新增加来自动物口腔 4个菌种（p.cangingiralis) (p.macacae),猕猴卟啉单胞菌(p.macacae),犬齿龈卟啉单胞菌(p.cangingiralis),利氏卟啉单胞菌(P.levii),卡氏卟啉单胞菌（P.cafoniae),梭杆菌属 Fusobacter ium, 新增加3个新种和 3个亚种,龈沟梭杆菌（F.alocis),沟迹梭杆菌（F.sulci),溃疡梭杆菌（F.ulcerans),具核梭杆菌文森氏亚种、多形亚种、动物亚种（F.nucl.sub.polymorphum多形Sub.vincentii 文森氏, Sub.animalis 动物）,梭杆菌属,二氧化碳 嗜纤维菌属 新增二个菌种,溶血二氧化碳嗜纤维菌（C.heamolytica),颗粒二氧化碳嗜纤维菌属（C.granuluca),有害月形单胞菌（S.noxia),月形单胞菌属新增加七个菌种,佛路格氏月形单胞菌（S.flueggei),致伤月形单胞菌（S.infelix),戴安娜月形单胞菌（S.dianae),阿特米斯月形单胞菌（S.artemidis),嗜酸血月形单胞菌（S.aidaminophila),乳酸月形单胞菌（S.lacticifex), 新增加一个菌属称为嗜胆菌属（Bilophila)包括一个菌种:沃氏嗜胆菌(B.wadworthia),（二)革兰氏阳性无芽孢杆菌,1 .双歧杆菌 包括31个菌种24个亚种共55种,新增加7个菌种,高卢氏双歧杆菌（B.gallicum),鸡胚双歧杆菌（.gallinarum),反刍双歧杆菌（B.ruminantium),波伦亚双歧杆菌( B.saeculare),瘤胃双歧杆菌(B.merycium),殊形双歧杆菌(B.inopinatum),栖牙双歧杆菌(B.denticolaens) (96年从口腔分离新定菌种),其中 两歧双歧杆菌有a,b两个亚种; 嗜热双歧杆菌有a,b,c,d 4个亚种; 婴儿双歧杆菌有a,b两个亚种,亚种中还有游离型和乳酸型两个亚型; 青春双歧杆菌有a,b,c,d 4个亚种; 假长双歧杆菌有a,b,c,d 4个亚种. 长双歧杆菌也有a,b两个亚种.,2.乳杆菌属 包括50个菌种7个亚种,新增加菌种,3. 丙酸杆菌属 包括两大群共9个种,其中皮肤群 3个菌种。 原蛛网菌属取消，已归于丙酸杆菌属, 原丙酸蛛网菌被称为丙酸丙酸杆菌 (P.propionica).,4. 放线菌属现 包括15个菌种,新增加3个菌种,3.白纳德放线菌(A.bernardiae) (90年以后面部或口腔分离菌种）,2.杰税斯放线菌 （ A.gerencseriae）,1.杰格氏放线菌(A.georgiae) (90年后从面部或口腔分离菌株),5.优杆菌属 包括36个菌种,（三）革兰氏阳性无芽孢 厌氧球菌,1.消化球菌属 只有黑色消化球菌一个种,2.消化链球菌属 包括14个菌种,新增4个菌种,1.产氢消化链球菌（P.hydrogenalis) 90年从,粪便,阴道,2.泪液消化链球菌（P.lacrimalis) 92年从 眼泪分离,3.阴道消化 链球菌(P.vaginalis) 92年从阴道分离,4 .解乳消化链球菌(P.lactolyticus) 92年从消化牛乳分离,3.链球菌属 包括6个群36个菌种，其中厌氧链球菌群4个菌种含酿脓、口腔、肠球、产乳酸、厌氧和其它群。,其中,酿脓链球菌群（pygenic streptococci group)5个种,口腔链球菌群（Oral streptococci group)9个菌种,肠球菌群(enterococci group)10个种,乳酸链球菌群（Lactic streptococci group)3个种,厌氧链球菌群(Anaerobic streptococci group)4个种,其它链球菌群(other streptococci group)5个种,4.瘤胃球菌属,5.葡萄球菌属 其中有一个种即解糖葡萄球菌为厌氧菌种。,（四）革兰 阳性芽孢杆菌 梭状芽孢杆菌属 （Clostridium),包括85个菌种和亚种,新增加2个菌种,2.毛状梭菌（C.piliforme),1.隐藏梭菌 (C.celatum),5.正常菌群中的厌氧菌,注：0表示无或很少，+表示常有；+表示大量存在；+表示不规则。,二、厌氧培养方法简介,一个成功的厌氧培养不仅分离培养时保持厌氧，而且在标本的采集、输送、培养基制备及接种等过程尽量要求厌氧操作，任何一个环节失误，都可能导致厌氧菌培养失败。,(一)主要厌氧培养方法,1）物理方法：阻断空气法、煮沸法、真空法、置换法、燃烧法、喷射换气法如转管法。,2）化学方法：焦性没食子酸法、铁丝绒法、保险粉法、厌氧培养器。,3）生物方法：耗氧法、燕麦发芽法,4）混合方法：厌氧袋（Gas-kit), 厌氧罐（Gas-pak), 厌氧手套箱（anaerobic glovebox),厌氧培养皿 酶系统（琼脂内）+自动厌氧器。,还原型,5. N 2HO (CH2)2N S N(CH3)2 还原酶,（二）主要反应,1.CO2和H2的 产生,3.Cu+H2SO4 CuSO4+H2,2. O2消耗 2H2+O2 钯 2 H2O,Na(K)BH4+2H2O NaBO2+4H2,C6H8O7+3NaHCO3 Na3(C6H5O7)+3CO2 +3H2O,60%硫酸铜溶液 ,吐温-80 2%,加入2N H2SO4 1000ml,4 CrSO4+2H2SO4+O2 2Cr2(SO4)3+3H2O,6.指示剂 6%GS : 0.1N NaOH : 0.05%亚甲兰 =2:0.1:0.2,(CH3)2N,N,S,N(CH3)2,亚甲兰,可拧开的瓶帽,三、厌氧菌的鉴定方法简介,（一）临床常见疾病与厌氧菌感染,（二）厌氧菌检验,1.厌氧菌感染的病源学特点：,1）感染面与临床各科所在的部位有关，有的感染率可达100%，60%以上标本为混合感染。,2）混合感染现象： a 单种使用某种抗生素开始有效，很快无效。 b 病源涂片常只见肠球菌感染，并多易变性易改性。,3）检出率为57-78%，国内30-67%,4）继发性和慢性迁延性感染多见。,2、厌氧菌感染的临床和 细菌学特征,（二）厌氧菌检验,1. 标本采集,一个成功的厌氧培养总是从采集标本开始。,原则：一切污染正常菌群的标本都不宜做此检验，如咳痰、齿龈拭子、 粪便、排泄尿、洗胃液等。,2. 标本输送,原则：厌氧条件下常温、混合气体中输送，输送时保持一定湿度,3. 分离程序,4.厌氧菌鉴定的培养基选择原则,1）根据病变所在部位选择培养基种类,1. 侧脓胸穿刺液（P、F、梭）,2. 肝脓肠穿刺液,链,类,梭,2)根据疾病诊断（病名）选择选择性培养基,韦荣氏,消化链,脆,放,如侧脑脓肿,3）原则上使用选择性培养基同时宜加用非选择性培养基平板。,4）厌氧菌培养的特殊性 厌氧培养一定要加用需氧培养作为对照。,5.厌氧菌培养基及其组成,1）营养丰富的物质: 胰蛋白胨、植胨、水解蛋白、 动物肽链与蛋白、酵母膏（粉）、牛肉膏、 BHI、甚至血。,2）碳水化合物: 各类糖。,3）还原性物质: 降低氧化还原电势 L-盐酸半胱 氨酸、硫乙醇酸盐等。,4）盐类与缓冲盐类: PBS、 Mg2+ 、Fe2+ 、 Ca2+、 Zn2+等。,5）促生长物：如氯化血红素（hemin），维生素K 1。,6. Finegold氏厌氧菌三级鉴定法,一级鉴定 二级鉴定 三级鉴定,一般是初代培养结果，耐氧试验选择性培养基、标本来源、菌落和菌细胞特征报告。特殊培养基培养结果,可有助于初步鉴定，如七叶苷胆汁（BBE）平板上出现黑色带晕大于1mm菌落，经检为G b，染色不均，菌体可见有空泡者，多形态,可初步定为脆弱类杆菌（B.fragilis)。又如在KV血平板上，菌落深陷生长可能是解脲类杆菌和纤维类杆菌。,一级鉴定,3 基因探针初步应用,制备菌液 点样（NCP滤膜上） 80 干烤5-10min及变形处理 预杂交液 加入杂交液 加入显色剂 结果。 我们的经验是敏感性为89%，特异性91.7%。对脆弱类杆菌灵敏度为10pgDNA和104CFu/mL，能准确确诊。,1厌氧菌药敏使用的培养基,（1）GAM：胰胨10g 眎胨5.0g等,（2）W-C：胰酶水解酪蛋白10g，酵母粉5g,葡萄糖1g, 氯化纳5g， L-半胱氨酸 1g，Vk10.5mg ，氯化血红素 0.5g 琼脂15-20g PH7.2,药敏的主要方法,1.K-B纸片法 2.国际厌氧菌药敏标准方法限量琼脂 稀释法 3.试管稀释法 4.微量稀释法,一、受试菌的准备,二、抗生素的稀释和准备,三、培养基的准备,四、抗生素的MIC试验,五、结果观察,厌氧菌的药敏方法介绍,5.每次药敏试验受试菌中应注意加入标准菌株作为质控.,B.fragilis脆弱类杆菌(ATCC 25285或NCTC 9343),B.thetaiotaomicron多形类杆菌(ATCC 29741),C.perfringens产气荚膜梭菌(AATCC 13124),E.lentum迟缓真杆菌(ATCC 43055),6.琼脂稀释法中质控菌株MIC值(g/ml)允许范围（表1）,表1 质控菌株MIC允许范围(ug/ml青霉素u/ml),续表1 质控菌株MIC充许范围(g/ml青霉素u/ml),续表1 质控菌株MIC充许范围(g/ml青霉素u/ml),*此表引自美国实验室标准化委员会(NCCLS)对厌氧菌药敏规定介绍 1996.12 *实用抗菌药物学第二版 戴自英等主编 上海科学出版社，1997,二、抗生素的稀释和准备,1.准确称取抗生素(我们一般称取2.56g,加DW或其它液体4ml)，以对倍稀释法稀释成系列浓度2560、1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5。抗生