可将大肠杆菌分为150多型.ppt

生物学(选修1) 生物学技术实践,细菌的结构,基本结构细胞壁、细胞膜、细胞质、核质、 质粒,特殊结构荚膜、菌毛、鞭毛、芽孢,一、细菌的基本结构 Basical Structure of Bacterium,细胞壁 cell wall 1. 化学组分 聚糖骨架 肽聚糖 peptidoglycan 四肽侧链 G+菌 五肽交联桥 磷壁酸 teichoic acid 肽聚糖 peptidoglycan 脂多糖 lipopolysaccharide,LPS G- 菌 脂质双层：内有OMP 外膜 脂蛋白,革兰阳性菌细胞壁结构,革兰阴性菌细胞壁结构,质粒（plasmid） 质粒是染色体外的遗传物质，存在于细胞质中。 为闭合环状的双链DNA，带有遗传信息，控制细菌某些特定的遗传性状。质粒能独立自行复制，随细菌分裂转移到子代细胞中。质粒不是细菌生长所必不可少的，失去质粒的细菌仍能正常存活。质粒除决定该菌自身的某种性状外，还可通过接合或转导作用等将有关性状传递给另一细菌。质粒编码的细菌性状有菌毛、细菌素、毒素和耐药性的产生等。,二、细菌的特殊结构 Special Structures of Bacterium,1. 荚膜 capsule 细菌细胞壁外包围的一层粘液性物质结构。大多数为多糖，少数为多肽。厚度小于0.2 m者称微荚膜（microcapsule）。 荚膜的功能： 粘附作用； 抗吞噬作用； 抗有害物质的损伤作用。,荚膜（肺炎球菌）,2. 鞭毛 flagellum,由蛋白质组成的结构，与细菌的运动有关； 具有免疫原性，有鉴别意义； 某些菌的鞭毛与致病有关。,鞭 毛,3. 菌毛 pilus,定义：由蛋白质组成，短而直，光镜下不能观察到。 普通菌毛ordinary pilus：是细菌的粘附结构，能与宿主细胞的特异受体结合，介导细菌在局部定植，与细菌的致病性密切相关。 性菌毛 sex pilus: 数量少，中空呈管状。由F质粒编码产生，与细菌的遗传变异有关。可通过接合方式传递细菌的毒力和耐药性等。,E. coli with fimbriae,4. 芽胞 spore,某些细菌在一定条件下，在菌体中形成的在光学显微镜下可见的一个圆形或卵圆型小体。 芽胞是细菌的一种特殊存活方式，而不是繁殖方式。一个细菌只能形成一个芽胞，一个芽胞也只能生成一个菌体。产芽胞的细菌在未产生芽胞时的菌体称为繁殖体（vegetative form）。,细菌芽胞的大小和位置,资料:大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli） 革兰氏阴性短杆菌，大小0.513微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。正常栖居条件下不致病。但若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在肠道中大量繁殖，几占粪便干重的1/3。兼性厌氧菌。,在环境卫生不良的情况下，常随粪便散布在周围环境中。若在水和食品中检出此菌，可认为是被粪便污染的指标，从而可能有肠道病原菌的存在。因此，大肠菌群数（或大肠菌值）常作为饮水和食物（或药物）的卫生学标准。大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K），后者有抗机体吞噬和抗补体的能力。根据菌体抗原的不同，可将大肠杆菌分为150多型，其中有16个血清型为致病性大肠杆菌，常引起流行性婴儿腹泄和成人肋膜炎。大肠杆菌是研究微生物遗传的重要材料，如局限性转导就是1954年在大肠杆菌K12菌株中发现的。莱德伯格（Lederberg）采用两株大肠杆菌的营养缺陷型进行实验，奠定了研究细菌接合方法学上的基础，以及基因工程的研究。,实验一:大肠杆菌的培养和分离 一、实验目的:,1.进行大肠杆菌的扩增,利用液体培养基进行细菌培养的操作。 2. 进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基进行细菌的划线培养。 3.说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理。,二、实验原理: 大肠杆菌的新陈代谢是异养兼性厌氧型，在生态系统的身份（消费者、分解者），因此可以用LB液体培养基（通用的细菌培养基或普通的细菌培养基）扩大培养。培养后再在LB固体平面培养基上划线进行分离，分离后，培养基上会形成一个个单独的菌落，便于观察鉴定。这种方法有利于消除污染杂菌，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。,进行微生物的分离与培养 属于技能性独立操作水平（A）,三、实验操作要求： 1.培养基的配比与制作 原理:培养基是微生物的生存环境和营养物质,必须无菌。俗话说，“细菌喜荤，霉菌喜素”，细菌培养基通常要用蛋白胨和酵母提取物配制,加入一定的氯化钠（维持一定的渗透压）。细菌通常要求在中性偏碱的环境中生长，所以在配制培养基时需调节培养基的酸碱度。,（一）、根据培养基的物理状态来区分,固体培养基 液体培养基 半固体培养基,1、液体培养基,主要用于增菌培养、鉴别性培养,2、固体培养基,用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定等,3、半固体培养基,观察微生物的动力，有时用来保藏菌种。,（二）、根据培养基的用途来区分,增殖培养基 选择培养基 鉴别培养基,1、增殖培养基,在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基。,增菌、运送用培养基,2、选择培养基,在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需要的菌种生长的培养基，称之为选择培养基。,分离培养用的培养基,3、鉴别培养基,在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助开快速鉴别某种微生物。这样的培养基称之为鉴别培养基。,鉴别用培养基,LB培养基的配方如下: 胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L 酵母提取物(Yeast extract) 5g/L 氯化钠(NaCl) 5g/L 另外根据经验值用NaOH调节该培养基的pH,使其达到7.4(该pH适合目前使用最广的原核表达菌种E.coli的生长),（三）培养基制备的基本方法和注意事项,培养基的制备记录 培养基成分的称取 培养基各成份的混合和溶化 培养基pH的初步调正 培养基的过滤澄清 培养基的分装 培养基的灭菌 培养基的质量测试 培养基的保存,范例解读：牛肉膏蛋白胨培养基的配制 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基.其配方如下: 牛肉膏3g,蛋白胨10g,Nacl5g,琼脂1520g,水1000mL,PH7.47.6 1.称药品 按实际用量计算后,按配方称取各种药品放入大烧杯中.牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶解后倒入大烧杯;也可放在称量纸上称量,随后放入热水中,牛肉膏使与称量纸分离,立即取出纸片.蛋白胨极易吸潮,故称量时要迅速.,2.加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量,然后放在石棉网上,小火加热,并用玻棒搅拌,待药品完全溶解后再补充水分至所需量.若配制固体培养基,则将称好的琼脂放入己溶解的药品中,再加热融化,此过程中,需不断搅拌,以防琼脂糊底或溢出,最后补足所失的水分. 3. 调pH 检测培养基的pH,若pH偏酸,可滴加lmol/L NaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸检测,直至达到所需pH范围.若偏碱,则用lmol/L HCl进行调节.pH的调节通常放在加琼脂之前.应注意pH值不要调过头,以免回调而影响培养基内各离子的浓度.,4.过滤 液体培养基可用滤纸过滤,固体培养基可用4层纱布趁热过滤,以利培养的观察.但是供一般使用的培养基,这步可省略. 5.分装 按实验要求,可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内.分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染. 分装量:固体培养基约为试管高度的l/5,灭菌后制成斜面.分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜.半固体培养基以试管高度的1/3为宜,灭菌后垂直待凝.,6.加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞.棉塞的形状,大小和松紧度要合适,四周紧贴管壁,不留缝隙,才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用.要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内,以防棉塞脱落.有些微生物需要更好的通气,则可用8层纱布制成通气塞.有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞.,7.包扎 加塞后,将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸,以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞.若培养基分装于试管中,则应以5支或7支在一起,再于棉塞外包一层牛皮纸,用绳扎好.然后用记号笔注明,培养基名称,组别,日期. 8.灭菌 将上述培养基于121.3湿热灭菌20min.如因特殊情况不能及时灭菌,则应故人冰箱内暂存. 9.摆斜面 灭菌后,如制斜面,则需趁热将试管口端搁在一根长木条上,并调整斜度,便斜面的长度不超过试管总长的1/2. 10.无菌检查 将灭菌的培养基放入37温箱中培养2448h,无菌生长即可使用,或贮存于冰箱或清洁的橱内,备用.,2.无菌技术(灭菌操作): 在培养微生物时必须进行无菌操作。 （1）各种器皿必须是无菌的，如各种大小的培养皿、试管等等通常用高压蒸汽灭菌法灭菌（自主学习：P20-21）。 （2）各种培养基也必须是无菌的。如加入培养基的三角瓶、试管也要在1210 C 下灭菌15min（自主学习：P21 ）。 （3）在操作过程中必须是无菌的（菌转移操作必须是无菌的）。在将培养基加入到三角瓶、试管和培养皿中时，三角瓶口、试管口、和培养皿壁上不能沾有培养基，否则容易发生污染（自主学习：P21 ）,无菌操作,斜面接种时的无菌操作 (1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞,检验操作过程的无菌操作要求,（1）、在操作中不应有大幅度的动作； （2）、使用玻璃器皿应轻取轻放。 （3）、在正火焰上方操作； （4）、接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌； （5）、在接种培养物时，协作应轻、准。 （6）、不能用嘴直接吸吹吸管。 （7）、带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。,3.接种之平板划线操作 如果用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线的过程中菌液逐渐减少，细菌也逐渐减少。划线最后，可使细菌间的距离加大。在培养1020h后，可由一个细菌产生单个菌落，菌落不会重叠。如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上，在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。“龙生九子，各有不同”。 例如：我们要筛选乳酸菌，可用斜面扩增的菌制作酸奶，根据效果不同，如发酵时间快慢不同、口感不同、发酵是条件不同等等，筛选出工作菌株。划线分离法也可将污染的杂菌除去，如乳酸菌是厌氧菌，但时间长了也有可能被需氧杂菌污染，因此在制成酸奶时，酸奶上,层会有麻稣的口感。将菌种重新划线分离后，可除去需氧杂菌。 用于基因工程的大肠杆菌的工程菌，也可用划线分离法获得产物表达能力高的菌株。由于工程菌的质粒中通常有抗性基因（如抗氨苄青霉素基因），如在培养基中加入一定量的氨苄青霉素（选择培养基），由于非工程菌的其他杂菌都没有抗性，所以在划线后只有存在抗性基因的工程菌能生存下来。因此，用这一方法可以筛选高表达能力的工程菌的菌株。 涂布分离法（自主学习） 划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更容易分开，但操作复杂些。细菌的两种分离法各有优点，都可采用。,4.菌落观察 细菌的菌落表面一般是光滑而湿润,有粘稠性,多数透明或半透明,但也有细菌的菌落表面是干燥、有皱褶的。放线菌由于有纤细的菌丝并可产生孢子，所以菌落表面是紧密的绒状、坚实多皱，长孢子后就成粉末状。由于菌丝和孢子有多种色素，所以在菌落培养基底部和菌落表面都有不同的颜色，菌丝可深入到培养基内，菌落不易用接种环或接种针挑动。酵母菌菌落类似于细菌菌落，表面光滑,而湿润，有粘稠性，但大多呈乳白色（少数呈红色）；酵母菌落为绒毛状，孢子有各种颜色，容易区分。 如果菌落无法辨认,只有借助于显微镜观察。在显微镜下，细菌（在高倍镜下才能看到）一般为杆状、球状和弧状；放线菌菌丝是没有横隔的分枝丝状体，气生菌丝顶端分裂成串状孢子，孢子丝有直线形、螺旋状、弯曲式或轮生等；酵母有卵圆形或丝状，但卵圆形细胞大于细菌；霉菌以菌丝组成菌丝体，菌丝结构和丝状酵母的菌丝相似。,染色法,革兰染色 Gram stain：由丹麦细菌学家革兰(Hans Christian Gram)创建的一种鉴别染色法。采用4 种试剂分4 步： 结晶紫 碘液 95%乙醇 复红 （初染） （媒染） （脱色） （复染） 革兰阳性菌 革兰阴性菌 （菌体为紫色 ） （ 菌体为红色）,革兰阳性菌 革兰阴性菌,四.设备、用品及材料： 自主学习：P21-22 五.实验步骤: 1.在两个250ml的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养基和50mlLB固体培养基(刚配好,尚未凝固),加上封口膜。将培养皿用牛皮纸包好,放入灭菌锅内,1kg压力灭菌15min。 2.灭菌后,待高压锅或灭菌锅压力与大气压相同时(即没有压力了)打开锅盖。自主学习：P22-23,3.将大肠杆菌斜面和有液体培养基的三角瓶放在左手中,靠近酒精灯火焰;右手拿着接种环,并用右手无名指和小指夹住斜面的棉塞和三角瓶封口膜(请看P23图2)。将接种环在火焰上烧红,再深入到斜面,使环接触培养基冷却后,再取菌体。将菌体放入三角瓶的液体培养基中,将三角瓶的封口膜和斜面的棉塞复原。三角瓶在370C摇床震荡培养12h。 4.划线分离。在酒精灯火焰上灼烧接种环，将摇床上培养12h的菌液打开，,接种环部分深入到菌液中。然后，在固体培养基的平板上连续划线（请看P23图3），接种环只在菌液中蘸菌液一次。划线后盖好培养皿。将培养皿倒置（盖在下面），放到370C恒温培养箱中培养1224h后，可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。 5.在无菌操作下将单菌落用接种环取出,再用划线法接种在斜面上, 370C培养24h后， 40C