血浆中药物分析实验第一部分.ppt

生物样品中药物分析,一、生物样品中药物分析的性质和意义 二、生物样品中药物分析的对象和特点 三、生物样品的种类 四、生物样品分离、纯化与浓集,一、生物样品中药物分析的性质和意义 （一）生物样品中药物分析的性质 （二）生物样品中药物分析的意义,（一）生物样品中药物分析的性质,生物样品药物分析，又称体液药物分析、生物药物分析，是随着临床药学、临床药理学的发展和需要而建立起来的一门新兴学科。,生物样品药物分析，旨在通过各种分析手段，了解药物在生物样品内的数量和质量变化。 获得药物代谢动力学的各种参数、药物在生物样品内的生物转化、代谢的方式和途径等信息。 从而为药品生产、临床医疗、实验研究等方面对研究中的药物作出估计与评价，对药物的改进与发展作出贡献。,（二）生物样品中药物分析的意义,1.新药评价和新药开发中的意义 大量事实证明，如无临床药理学和临床药学研究给新药以确切的评价，要做到临床安全、合理、有效地用药将会遇到许多困难。 因此，加强药物在生物样品内作用机理的研究，以了解和阐明药物结构、理化性质、剂型及生产工艺与药物疗效等关系，已成为评价药品质量的重要内容和依据。,2.在临床合理用药中的意义 影响血药浓度的因素很多，同一种给药方案难以对每一个病人都达到理想的治疗效果。 为达到用药安全、合理、有效，必须设计个体化给药方案，就需要做好对治疗药物监测，以血药浓度为指标，达到个体化用药。,课堂活动,地高辛血药浓度监测例结果分析 请阅读该文献后，回答下列问题（以小组为单位，上交讨论结果）： 为什么要进行地高辛血药浓度监测？ 影响地高辛疗效的因素有哪些？,一、生物样品中药物分析的性质和意义 二、生物样品中药物分析的对象和特点 三、生物样品的种类 四、生物样品分离、纯化与浓集,二、生物样品中药物分析的对象和特点 （一）生物样品中药物分析的对象 （二）生物样品中药物分析的特点,（一）生物样品中药物分析的对象,凡是生物样品内药物到达之处，如体液、器官、组织、排泄物等都是分析的对象。 所以生物样品内药物分析的样本有血液、尿液、唾液、胆汁、淋巴液、泪液、脊髓液、汗液、乳汁、各种器官以及呼出的气体等。,生物样品内药物分析的目标，不仅是母体药物也包括代谢产物。 因为代谢产物常具有生理活性，弄清它们的种类、结构、数量及分布情况，可了解药物在生物体内的变化及消除规律，这对安全用药和正确评价药物质量也是非常重要的。,由于新药进入临床试验之前，或者对已上市药在某一方面的重新评价，一般要求先在动物体上进行实验，所以生物样品内药物分析对象不仅是人体，也包括动物体。,（二）生物样品中药物分析的特点,与常规药物分析相比，生物样品内药物分析在灵敏度和选择性等方面有较高的要求。 微量药物存在于大量生物介质中，样品中含内源性干扰杂质，这些干扰物质又随疾病情况不同而有所不同。,很多药物在生物样品内经过代谢可产生一种或多种代谢物，母体药物和代谢物又能同生物大分子结合。 这一切给药物分离、分析带来困难，这就要求分析方法具有更高的选择性。,另外，在生物样品中，药物浓度都很低，一般血药浓度在10-6-10-9g/ml之间。 且生物样品若为血液，采集量又受到一定限制，因此要求分析方法要有较高的灵敏度。,一、生物样品中药物分析的性质和意义 二、生物样品中药物分析的对象和特点 三、生物样品的种类 四、生物样品分离、纯化与浓集,血液(血浆、血清)：体现药物浓度和治疗作用之间的关系最常用的生物样品。,血液（blood） 血液中药物浓度可以较好地体现药物浓度和治疗作用之间的关系。 是最为常用的生物样品。 分为全血、血浆和血清。,全血、血浆和血清的区别,全血：血液经抗凝处理后的全部血液。 血浆：离心除去血细胞后所得到的淡黄色液体。 血清：如血液不经抗凝处理，让其自行凝固，则在抽血后的一段时间内，血液会自动在一系列凝血因子的作用下发生凝集，血液首先凝固成一个整体，再经过一段时间或用离心机离心，血液中凝固的部分会与一些清澈淡黄色的液体分离开，这些液体称为血清。,血浆和血清的区别,血清与血浆从表面上看似乎没有什么不同，但其内在的主要区别是血清中不含纤维蛋白原，是未经抗凝处理过的血液凝固后得到的。,1. 血样的采集： 一般用注射器直接采集静脉血，每次15ml； 动物实验时，采血量不宜超过动物总血量的十分之一。,2. 血样的制备 测定血中药物的浓度，通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，尤其是血浆，并非指全血。,血浆的制备 采集的静脉血液置含有抗凝剂的试管中，混合后，以25003000r/min离心510min使与血细胞分离，所得淡黄色上清液即为血浆（ plasma ） 。 抗凝剂最常用的是肝素（heparin）。 其它抗凝剂EDTA、枸橼酸盐、草酸盐等。,3.血样的应用： 药物动力学 生物利用度 临床治疗药物浓度监测,尿液用于药物剂量回收、尿清除率、生物 利用度、内源性活性物质、药物代谢分型及代谢物等的研究测定。,毛发用于药物滥用监测及微量元素测定。 肝、胃、肾、肺、脑等脏器组织动物试验研究药物吸收、分布状态及服药过量中毒死亡。,生物样品的贮存与处理,冷藏冰箱(4)中短期保存(1-2d) 冷冻冷柜(-20)或低温冷柜(-80)，中长期保存。 冷藏或冷冻时限经稳定性考察后确定。,血样的贮存： 采集后及时分离血浆和血清（2h），分离后再贮存 若不予先分离，血凝后冰冻保存，则因冰冻有时易引起细胞溶解，会阻碍血浆或血清的分离。,注意事项： 冷冻的样品测定时，需临时解冻。 解冻后的样品应一次性测定完毕，不应反复冻融。 如果采集的样品不能一次性测定，则应以小体积分装贮存，每次按计划取一定数量进行测定。,一、生物样品中药物分析的性质和意义 二、生物样品中药物分析的对象和特点 三、生物样品的种类 四、生物样品分离、纯化与浓集,生物样品的预处理技术： 分离、纯化、富集或化学衍生化等，目的是为药物的最终测定创造良好的条件。 分离消除内源性物质、代谢物或其它共存药物的干扰 纯化与浓集提高被测药物的灵敏度 样品经分离、纯化与浓集与测定方法相结合，达到专属性强、灵敏度高、准确性好。,样品的预处理是体内药物分析中极为重要的环节。 也是分析中最困难、最繁杂的工作。 对于生物样品的预处理很难规定固定的程序和方式，必须结合测定实际和要求，采取恰当的方法和技术。,（一）生物样品预处理的目的,使药物从缀合物及结合物中释放 测定药物的总浓度 使样品纯化 消除生物基质中内源性物质的干扰 提高检测灵敏度 适应和符合测定方法要求的灵敏度 防止分析仪器的污染 提高分析仪器的耐受程度、改善分析结果,使药物从缀合物及结合物中释放,药物在体内存在形式： 游离型药物 代谢物 药物或代谢物与蛋白结合物 预处理：药物或代谢物从“结合物”或缀合物中释放，测定药物或代谢物的总浓度。,样品纯化,生物样品的基质组成复杂、干扰多 例如： 血清： 含有高分子的蛋白质和低分子的糖、脂肪、尿素等有机物，也含有Na+、K+、Cl-等无机物。 尿液： 含有尿素、肌酸、尿囊素、氨、Na+、K+、Cl-等。 药物组分： 药物含量低，一般为“微克”或“纳克”水平，经预处理使药物纯化、富集，以利于进一步检测。,提高检测灵敏度,预处理降低背景噪音提高灵敏度 特异性强、灵敏度高的分析方法 预处理相对简单 不具备分离功能的方法(光谱法) 预处理十分重要,防止分析仪器的污染,生物样品基质中脂肪、蛋白质、不溶性颗粒会污染分析仪器。 因此，应根据分析仪器的耐受程度，选择恰当的预处理方法。,举 例 应用高效液相色谱法检测血药浓度，进行样品预处理的作用。,去除血浆（或血清）中的蛋白质 延长色谱柱的寿命（去除固体杂质） 改善选择性（排除生物基质的干扰） 改善组分可测性（被测组分的富集） 改善组分色谱行为（化学衍生化）,生物样品的预处理方法,有机破坏法 去除蛋白质法 溶剂萃取法 缀合物的水解法 化学衍生化法,去除蛋白质法,可使结合型药物释放 去除蛋白后取上清液直接分析测定 去除蛋白后取上清液经进一步分离、纯化、浓集后分析测定。,去除蛋白质的方法,1.加入与水混溶的有机溶剂蛋白质脱水沉淀 2.加入中性盐“盐析”沉淀蛋白质 3.加入强酸与蛋白质阳离子(铵基) 形成不溶性盐沉淀,去除蛋白质的方法,4. 加入重金属盐与蛋白质阴离子 (羧基)形成不溶性盐沉淀 5. 超滤法半透膜滤除可溶性生物大 分子物质(蛋白质) 6. 酶水解法蛋白分解酶分解蛋白质 7. 加热法蛋白质变性凝固,举例：常用的去除蛋白质的方法,加入与水相混溶的有机溶剂 常用有机溶剂:乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃。 血样与溶剂体积比1：（ 13 ） ，可除去90%以上蛋白质。 高速离心分离（12000r/min ）离心12min，可以将析出的蛋白质完全沉淀。 注意：普通离心机（3000r/min）不能将蛋白质沉淀完全。,液液萃取法,原理： 大多数药物为脂溶性，在有机溶剂中溶解度大于水中溶解度。 大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质。,溶剂选择合适的溶剂是成功的主要条件 了解药物与溶剂的化学结构及其性质相似相溶的原则 沸点低、易挥散，毒性小