植物检疫学植物检疫性细菌病害.ppt

第六章 检疫性细菌病害,植物检疫性病原细菌的检验方法 梨火疫病 Fire Blight 玉米细菌性枯萎病 Stewarts bacterial wilt of corn 柑橘黄龙病 Citrus Yellow shoot 椰子致死黄化病 Coconut Lethal Yellowing,复习思考题,植物病原细菌检疫检验技术,直接检测：直观检验和生长检验 间接检测 活菌检测 免疫吸附分离法 噬菌体检验 非活菌检测 血清学检测,1、活菌检测,分离培养法：营养培养基、选择培养基或鉴别培养基分离纯化得到的细菌 浓缩接种及离体叶检测：提取液浓缩接种感病植物，观测发病情况。 例如：浙江大学等在1灭菌水琼脂中加75106的苯并咪唑，做平板，加感病植物叶片，针刺摩擦接种，培养（光、温、湿度），短期获得症状。主要应用于水稻细菌性条斑病菌和小麦细菌性黑颖病菌的检测。,2.免疫吸附分离法,原理：接合血清学与平板分离技术，利用与抗原高度亲和性的抗体，来捕获目标细菌，样本中其他细菌均被冲洗掉，再将目标细菌转移或释放到培养基上生长。 方法：平皿免疫吸附评价测定法和免疫吸附稀释培养法 平皿免疫吸附评价测定法简略流程如下：,常用溶入丙酮的硝酸纤维素或指甲油作包被,洗涤液使用包被缓冲液,3.噬菌体检验,原理：噬菌体侵染细菌，裂解寄主细胞，在液体培养时，会使浑浊的细菌悬浮液变清，在固体平板上培养，则出现许多边缘整齐、透明光亮的噬菌斑。噬菌体具有专化性，利用此特点，可鉴别细菌的种类。,4.非活菌检测,非活菌检测的方法很多，下表是检测病原细菌常用的一些方法，前9种血清学方法，均属非活菌检测。它们既能用于病原鉴定，又能直接用于病种或病株，甚至是无症感染组织的检测。,5.血清学检验,原理： 方法：酶联免疫吸附实验（ELISA）、免疫荧光抗体法 免疫荧光抗体法：将荧光染料（异硫氢酸荧光黄或罗丹明）与抗体以化学方法接合，再与抗体反应，形成有荧光标记的抗体抗原复合物，在荧光显微镜下，可观察到黄绿色荧光。,梨火疫病 Fire blight of pear,分布：,1878年首先由burrill描述，在纽约发生，后由Erwin命名，是第一个被确定的植物细菌病害。主要分布于北美洲于西北欧，中欧、地中海、东南欧及大洋州和亚洲也有分布。大约40多个国家。,梨火疫病的地理分布,寄主： 梨火疫病菌寄主范围很广，能为害梨、苹果、山楂、木旬子、李等多个属220多种植物，大部分属蔷薇科Pomoideae亚科。 危害性： 仁果类果树的一种毁灭性病害。一棵多年生的梨和苹果树发病后可在几星期内死亡,症状：侵害花、果实、枝条和叶片。 花:侵染后变深褐色，枯萎。 叶片:从叶缘沿叶脉扩展，先呈水浸状，后黑褐色。 嫩稍:先水浸状，后褐色至黑色，向下弯曲，呈鱼钩状。 果实：病部褐色凹陷，扩展到全果，潮湿时病部生粘稠的细菌溢，初乳白色，后红褐色。 病枝:叶片凋萎，幼果僵化，但病叶病果不脱落，远望似火烧状，故称火疫病。 伤口：初期水浸状，后下陷，呈溃疡斑，病健交界处产生龟裂纹，韧皮部红褐色，有黏液状菌脓。 严重时，病害从嫩稍很快扩展到枝条、主干，直至根部，全株死亡。,Advanced fire blight on fruit - note bacterial ooze on fruit.,Fireblight in nursery stock,主要鉴定特征： 梨火疫病最典型的症状是花、果实和叶片受火疫病菌侵害后，很快变黑褐色枯萎，犹如火烧一般，但仍挂在树上不落，故此得名。目前国际上将其症状据受侵害的部位，分成个阶段。,（1）花枯萎：侵染开放的花引起花枯萎。一般发生于早春，病菌直接从花器侵入，初为水渍状斑，花基部或花柄暗色，不久萎蔫。病菌可扩展至花梗及花簇中其它的花；在温暧潮湿条件下，花梗上有菌脓渗出。随着枯萎发展，花梗、花等变褐至黑褐色，条件适宜时可继续侵染杀死小枝并形成小溃疡斑。,（2）溃疡枯萎：是指前一季越冬溃疡边缘的病菌重新复活的结果。初症是在复活的溃疡附近的健康树皮组织上出现窄的水渍状区，几天后，树皮内部组织出现褐色条斑，随后病菌侵入附近繁殖枝内部并引起萎蔫死亡。这些枝条特别是嫩枝与下面谈及的枝枯萎有明显区别，即在萎蔫之前枝尖芽褪色（黄至桔黄色）。,（3）枝枯萎：细菌直接侵入前 13叶的枝尖，然后杀死整个枝条及支持枝。初症是枝尖萎蔫，但萎蔫前不褪色，象拐杖状。条件适宜时，几天内可移动1530cm，造成整枝死亡，病枝、枝皮、叶通常变黑。潮湿时，枝条上出现菌脓。后期，终芽前出现的枝枯萎一般不会萎蔫，且仅在枝最上部出现坏死。随着病菌不断深入，并侵染主干，皮层收缩，下陷，形成溃疡斑。,（4）病菌亦可直接从气孔、水孔等自然孔口或蕾苞，或由风引起的伤口侵入叶片，初叶边坏死，并向中脉、中柄、茎扩展，后变黑，通常有菌脓。 （5）损伤枯萎和砧木枯萎：这二种比较特殊，前者主要是由于晚霜、冰雹或大风损伤引起，如果实 很容易引起果实枯萎。后者仅限于高感品种EMAL-26、 EMLA-9和MARK-39砧木。通常是由感病的接穗在这些砧木上发病后引起，最终成溃疡带而杀死树体。,病原菌： 学名：Erwinia amylovora（Burrill）Winslow 异名： Micrococcus amylovorus Burril Bacillus amylovorus (Burrill) Trevisan Bacterium amylovorus (Burrill) Chester 分类地位：原核生物界(Procaryotes),薄壁菌门(Gracilicutes),肠杆菌科(Enterobacteriaceae)欧文氏菌属(Erwinia)解淀粉欧文氏菌,形态特征：直杆菌，有荚膜，周生鞭毛，能运动，大小为0.9-1.8 0.6-1.5m，多数单生，有时成双或短时间内3-4个呈链状。革兰氏染色阴性。在蔗糖培养基上27下培养3d，菌落直径34mm，白色至奶油色，半球形隆起，有黏性，表面光滑，边缘整齐，中心绒环状。,生物学特性：兼性厌氧，过氧化物酶阳性，氧化酶阴性，好气条件下利用葡萄糖产酸不产气，厌氧条件产酸缓慢。明胶碟形液化缓慢。不产生硫化氢，不利用丙二酸盐。葡萄糖酸盐氧化和七叶苷水解不稳定。氯化钠浓度高于2以上时生长延缓，至67%时则完全抑制。 抗青霉素，对氯霉素、链霉素和土霉素敏感。 细菌生长的温度范围637 ，最适温度2527.5，致死温度4550，10 min，最适酸碱度为PH6.0。,梨火疫病菌以简单的细胞分裂繁殖，一个细胞在条件适宜时，天内在寄主植物组织中能达到109细胞，每个细胞都是一个侵染源，感染寄主而引起病害的发展。除蛋白酶外，病菌不产任何有助于侵入寄主的酶，主要是在环境条件适宜时，通过胞间组织侵入薄壁组织的病菌产生胞外多糖。胞外多糖在病害发展过程中起重要的作用，其是菌脓的重要成份。菌脓的理化性质随湿度变化而变化，干时皱、硬，大时膨胀易被雨水扩散，中等湿度的菌脓粘易被昆虫、风传播。,发病规律： 病菌在病株病疤边缘组织处越冬，挂在树上的病果也是越冬场所，如果冬季温和，病菌还能在病株树皮上度过，来年早春病菌在上年的溃疡处迅速繁殖，遇到潮湿、温和的天气，从病部渗出大量乳白色粘稠状的细菌分泌物，即为当年的初侵染源，通过昆虫、雨滴、风、鸟类以及人的田间操作将病菌传给健株。病菌亦通过伤口、自然孔口（气孔、蜜腺、水孔）、花侵入寄主组织，有一定损伤的花、叶、幼果和茂盛的嫩枝最易感病。,传播途径 近距离传播：雨水是果园短距离传播的主要因子，其次风亦是中短距离传播的重要因子，往往在沿着盛行风的方向，病原菌以单个菌丝、菌脓或菌丝束被风携带到较远距离。除次之外，昆虫对病菌的传播扩散起一定的作用。传病昆虫包括蜜蜂在内有77个属的100多种昆虫，其中密蜂的传病距离约为200 400 m 。 远距离传播：主要是感病寄主繁殖材料，包括种苗、接穗、砧木、水果、被污染的运输工具、候鸟等。,梨火疫病的远距离传播,发生条件： 受伤的花朵、幼果和嫩稍最易受病菌侵染。经冰雹袭击，病害蔓延更加迅速。较高气温（1824）和较高的湿度（70以上）有利于病菌侵染。,检验方法： 1.产地检验： 2.症状观察：梨火疫病的症状很典型，是鉴定的重要方法，但必须与其他症状相似的梨梢枯病区分开。梨梢枯病仅限于危害花器、叶片和嫩梢，不危害枝条和茎干，病部无细菌溢脓，叶片上最初为深褐色斑点，周围有红色晕圈，枯死的病叶不会长期挂在树上,3.分离培养 可采用选择性培养基和鉴别性培养基进行。 MS培养基 菌落为红橙色，背景为兰绿色。配方：琼脂20g，甘露醇10g， L-天门冬酰胺3g，牛胆酸钠2.5g，磷酸氢二钾2.0g，烟酸0.5g，MgSO47H2O0.2g，次氮基三乙酸0.2g，硫酸十七烷基钠0.1ml，0.5%溴麝香草酚兰水溶液9ml，0.5%中性红2.5ml，蒸馏水970ml，pH7.3灭菌后加1%放线菌酮5ml，1%硝酸铯水溶液1.75ml。 CG培养基 在29培养48小时后形成典型的火山口状菌落。配方：水380ml，蔗糖160g，营养琼脂12g，结晶紫0.8ml（1%乙醇溶液），0.1%放线菌酮20ml。,4.致病性实验 梨火疫病菌致病性试验可用梨片或梨嫩枝测定，亦可用烟草过敏反映检查。NA上培养48小时的细菌配成108 cells /ml的悬液，注入烟草叶片或接种于1cm厚梨片、或针刺接种于丈长的巴黎枝条，28下培养，一般1012小时后，烟草注射区出现白色坏死斑。13天后，梨片或枝条上出现白色菌脓，则可确诊。 5.血清学检验：免疫荧光、ELISA、ODD和凝集实验 6.分子生物学方法：核酸探针和PCR技术,检疫和防治 1.严格检疫，禁止从疫区引入蔷薇科仁果类果树树苗。 2.剪除病梢病枝。 3.药剂防治：120mg/kg链霉素喷雾，或花期用波尔多液喷雾防治，效果很好。 4.种植抗病品种： 5.避免在低洼易涝地定植。芽前刮除发病树皮，在生长季节每隔7天检查1次各种发病新梢和组织，发现后及时剪除。对因各种农事操作造成的伤口都要进行涂药保护等。,玉米细菌性枯萎病 Stewarts bacterial wilt of corn,分布：1889年纽约首先报道，现已20多个国家。分布于美国、加拿大、墨西哥、越南、泰国、马来西亚、前苏联、波兰、瑞士、意大利、前南斯拉夫、罗马尼亚、希腊、哥斯达黎加、波多黎各、圭亚那、秘鲁、巴西。,寄主植物 主要是甜玉米，也侵染马齿玉米、粉质玉米、硬粒玉米和爆裂玉米。 危害： 维管束病害、毁灭性病害。,症状：整个生育期都可危害，以开花期症状最明显。早期症状表现为植株矮化，萎蔫，雄穗退色早枯，叶片边缘产生波纹状不规则病斑，初期水浸状，黄色，与叶脉平行，贯穿全叶，宽110mm，严重时病叶萎蔫死亡。生长后期，叶片产生许多小病斑，结合成大块，火烧状干枯死亡。髓部有空腔，导管被黄色黏液阻塞，萎蔫植株的下部切口有黄色细菌溢脓。果穗的菌脓可通过内层包叶的气孔渗出，籽粒表面沾满细菌菌脓，病籽粒变形、皱缩和变色。,Necrotic lesions on mature leaves; second phase of Stewarts wilt disease.,病原菌：玉米细菌性枯萎病菌 学名 Pantoea stewartii (Smith) Mertaert et al. 异名 Erwinia stewartii (Smith) Dye；Pseudomonas stewartii Smith; Apalnobacter stewartii (Smith) McCulloch; Bacillus stewartii (Smith) Holland; Bacterium stewartii( Smith) Smith; Phytomonas stewartii (Smith) Bergye et al; Pseudobacterium stewartii (Smith) Hrasilnikov,1949; Xanthomomas stewartii (Smith) Dowson 英文名 Stewarts bacterial wilt of corn 分类地位 原核生物界(Procaryoces)，薄壁菌门(Gracilicutes)，肠杆菌科(Enterobacteri-aceae)，泛菌属(Pantoea),形态特征：好气性短杆菌，两端钝圆，无鞭毛，有荚膜，G，单生或双生，0.40.80.92.2。在牛肉膏培养基上形成黄色圆形菌落，全缘，表面扁平光滑，能利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、木糖、甘油鹤甘露糖、醇等产酸，但不产生气体。在肉汤培养液中生长微弱，形成灰色环和黄色沉淀物。 细菌生长温度最低温度89，最适温度30，最高温度39，致死温度53 10min，适宜PH4.58.5，最适6.08.0。,发病规律：初侵染来源带菌的种子和昆虫。土壤和病原残体不能越冬，昆虫是病原细菌的传播介体和重要的越冬场所。最重要的传病昆虫是玉米叶甲，它以成虫带菌越冬，细菌存在于消化道中。越冬后现在早播玉米苗上取食，引起初侵染，并产卵发育成新一代成虫，继续向其它植株传病。,Corn flea beetle (Chatocnema pulicaria) vector of the Stewarts wilt bacterium (Pantoea stewartii).,流行条件：发病与流行主要决定于冬季气温（12、1、2月）的高低，若平均气温总和在37以上，有利虫媒越冬，带菌昆虫成活率高，有可能引起发病。低于32则很少流行。此外有利于发病的条件包括土壤氮肥水平偏高，钾肥水平偏低，高温高湿等。,检验方法： 产地检验： 种植检验：种子长出的植株有明显的症状。 分离培养基：采用伊凡诺夫选择培养基，其成分如下： 甘油30ml 柠檬酸铁铵10g 磷酸氢二钾2 . 5g, 氯化钠15g 硫酸镁0.1g, 琼脂17g 氯化钙0.1g, 蒸馏水1000ml,PH7.0 为了抑制杂菌的污染,还可采用选择性黑色素培养基,其成分如下: 酵母浸膏 1g 甘油 30ml 制霉菌素 200mg/ml 牛胆酸钠 3g 氯化钠 15g 1%水溶性黑色素20ml 琼脂 17g 蒸馏水 1000ml PH6.7 30下培养7d，对光观察，菌落中心呈黑色，边缘透明，菌落圆形，表面光滑，呈粘状。 将分离的细菌接种在玉米苗上，验证是否发病。,4.噬菌体检验法：用专化性噬菌体，如ZP6、ZP82等检验。 5 .血清学检验：用酶联免疫法等检验。 检疫和防治 1.禁止从国外疫区进口玉米种子 2.种子处理： （1）微波炉70处理10min，效果很好。 （2）环氧乙烷熏蒸： （3）恒温处理：50下处理4d，消灭种子内部细菌效果显著，不影响发芽。 （4）抗菌素温浸法： 3.防治传播媒介昆虫： 4.种植抗病品种：,柑橘黄龙病 Citrus Yellow shoot,分布：1939年在中国广东发现该病，现已扩展到亚洲和非洲37个国家和地区，中国主要发生在广东、广西、福建、台湾、海南、云南、贵州、四川、浙江、湖南、江西等省。 寄主：主要是柑橘属、金柑属和枳属。草本植物有长春花 。,危害：是柑橘的毁灭性病害，感病的柑桔品种得病后可在35年内丧失结果能力，甚至枯死。 症状：典型症状是在浓绿的树冠中出现12条或多条的发黄枝梢，有两种类型：一种是整张叶片均匀黄化 ，另一种是叶片呈黄绿相间的斑驳状 。共同特点是叶质硬化、无光泽，但在黄梢下部的老叶仍呈正常绿色。病果小，果皮光滑，畸形，无光泽，味酸，果皮着色时黄绿不均匀或在果蒂附近变橙红色，而其余部份仍为青绿色的青果,病原Liberobacter asiaticum （亚洲）、 Liberobacter africanum（非洲） 分类地位：原核生物界(Procaryoces)，薄壁菌门(Gracilicutes)，韧皮部杆菌属 Liberobacter 英文名称：Citrus Huanglongbing；Citrus Yellow shoot；Citrus greening,未能在人工培养基上分离获得纯培养，在电镜下为椭圆形或短杆状的细菌，大小为306005001400m，细胞壁厚度为2530 m。革兰氏染色阴性，对四环素及青霉素敏感。根据其对热的反应和传病木虱的不同，分为两个株系：在亚洲，其发病的最适温度为2732，传播介体为亚洲木虱（Diaphorina citri），病原为柑桔黄龙病原亚洲株系（L. asiaticum）；在非洲，其发病的最适温度为2024,传播介体为非洲木虱 （Trioza aryteae） 病原为柑橘黄龙病非洲株系（L. africanum）。可以通过嫁接及菟丝子传播，但不能通过汁液和土壤传播。,传播：远距离传播主要是来自病区调运的苗木、接穗；大田主要依靠柑橘木虱进行传播，在亚洲是亚洲木虱，在非洲是非洲木虱 。 发生条件：亚洲多发生在热带亚热带地区，喜高温；在非洲多在冷凉气候下发生，30以上高温病害受抑制。,检验与检测： 1.产地检验：每年1012月症状表现最明显 2.生物学诊断：鉴别寄主法 3.电镜检查： 4.荧光显微镜检查：黄色荧光 5.化学诊断：染色法 6.血清学检测：,检疫与防治： 1、实行检疫 禁止病区苗木及一切带病材料进入新区和无病区，新开辟的果园要种植无病苗。 2、建立无病苗圃，培育无病苗木 要切实做到对优良单株进行脱毒（茎尖嫁接脱毒或热力脱毒）并经鉴定证明不带菌；在网室内建立种质圃；在隔离地方或在网室内建立无病母本园；在隔离地方或在网室内建立无病苗圃。 3、挖除病株 发现病株或可疑病株，应立即挖除，用无病苗进行补植。 4、防治柑桔木虱 通过水肥管理控梢以减少木虱繁殖和传播。新梢期喷布12次杀虫剂。果园四周栽种防护林带，对木虱的迁飞也有阻碍作用。,椰子致死黄化病 Coconut Lethal Yellowing,分布 椰子致死黄化病的名称来源于Nutman and Roberts (1955)。他们首次用致死黄化（lethal yellowing）命名在加勒比海、牙买加西部地区发生的一种椰子致死黄化型的毁灭性病害。该病害在加勒比海地区至少已有100年的历史，在西非也有50年的历史。目前分布在拉丁美洲开曼群岛、巴哈马群岛、古巴、多半尼加、海地，非洲和西印度群岛，亚洲的印度尼西亚、辛都、马来西亚、美国佛罗里达洲南部地区等地也有报道。,寄主范围： 除为害椰子树(Cocos nucifera L.)外，还可以为害油棕、枣椰子、扇棕、马尼拉棕、海棕等30多种棕榈科植物。大部分椰子品种抗病性差，在棕榈科的15个主要类群中，至少有7个是感病的。感病寄主属包括：Allagoptera，桄榔属 Arenga，Arikuryroba，Boraxxus，鱼尾属Caryota，散尾属Chrysalidocarpus，椰子属Cocos，Corypha，Dictyosperma，Gaussia，Hyophorbe，Latania，薄葵属Livistona，Mascarena，Nannorrhops，刺葵属Phoenix，Pritchardia，棕榈属Trachycrpus，Veitchia。,危害情况: 是椰子和棕榈科植物的毁灭性病害。在牙买加，据统计1961年的600万株感病的Jamaica Tall椰子中的90在1981年因感染黄化植原体而死亡。在加纳，在过去的30年中，已有约100万株椰子因感病而死亡；在多哥，截至1964年，约60000株或50的椰子树因感病而死亡；在Florida，到1973年，至少20000株(约6)的椰子树感病。在墨西哥和坦桑尼亚，成千上万公顷的椰子已被病害侵袭而死亡。,症状：各龄椰子树均可感病。病害早期的典型症状是花序干枯。开始时顶部复叶有褐色枯死斑，可深入到裹在里边的羽状叶，再向深处扩展，最后致死生长点，未成熟的果实脱落。开花的花序轴从顶端开始坏死、变黑，佛焰苞未成熟就提前开放，然后凋萎、落花、落果。以后叶片开始黄化，下层的叶片迅速发展到主株叶片，直至脱落。芽片感染后表现有不规则的褐色水浸状条斑，逐渐发展到芽腐，并有恶臭味。此时新叶很容易被剥离掉。在叶部呈现黄化症状时，根系出现坏死，不久腐烂，根系受害死亡。,总之,叶片黄化症状是植原体侵入根系后导致生理学、生物化学变化的结果。一般椰子黄化植原体病症状发展过程如下： 大多数感病植株在果实成熟前提前落果 新开的花序黑化 从下部叶片到上部叶片逐渐黄化 针形叶死亡和脱落，可能仅保留少量绿叶 整个树冠脱落，仅留赤裸的呈线杆状枝干,病原：椰子致死黄化植原体 学名 Coconut lethal yellowing Phytoplasma 英文名 Coconut lethal yellowing 分类地位 原核生物界，无壁菌门，软球菌纲，植原体属（MLO）,形态特征 电镜下，典型的植原体颗粒存在于病株的筛管中。颗粒是卵形、椭圆形、及丝状，由三层结构组成即：两层电子密集层，中间隔一层透明层。在感病椰子树韧皮部筛管细胞内可见植原体的存在，形状包括丝状、念珠状及近球状，大小为400-2000 nm。在新近成熟的韧皮部筛管细胞中常见有植原体，而在薄壁组织中未见植原体存在。,传播途径 在自然条件下，椰子致死黄化病的介体为麦蜡蝉（Myndus crudus）。叶蝉（Gypona sp）也有可能是潜在介体。叶蝉介体在美洲的地理分布与病害植原体的分布相吻合。在非洲西部，叶蝉Myndus adiopodoumeensis被怀疑也是一种传播介体。有报道表明化学防治昆虫介体可明显降低病害的传播速度。在国际贸易中带病的植物材料，包括观赏树种，能传带病菌。,检验与检测 1 产地检疫 根据植物受侵染后的症状，鉴定是否感病。 2生物学方法 利用介体昆虫麦蜡蝉在可疑的植物上取食后，接种到长春花上，诱发长春花产生植原体病害的典型症状，但潜伏期较长。 3电镜观察 用电镜观察植物韧皮部组织中是否有植原体存在。 4 核酸杂交和PCR检测技术 Harrison等1992年报道用5种DNA探针可用于椰子和其他棕榈科植物上的椰子致死黄化植原体的检测；Rohde 等1993年报道应用PCR技术成功的检测椰子致死黄化植原体。 检疫措施 1、 严禁从疫区进口椰子果和苗木。 2、 严格把关，加强检疫。 3、 科研单位特殊需要进口，应由检疫机关审批隔离试种一年以上，证明种苗是健康的，方能进口。,防治方法 1、 种植抗病品种。 2、 防治昆虫介体。用杀虫剂防治介体叶蝉能限制或降低病害的传播速度。 3、 注射抗生素：可注射四环素(500ppm)，每株椰子树注射的最大剂量为8克，加水1000毫升。每株病树进行保护性注射抗生素13克可降低病害蔓延速度35倍。也有报道用土霉素盐酸注射液对病株的树干进行注射处理，能抑制植原体病的症状，处理过的植株又能重新健康生长，每4个月处理一次能保持植株不表现症状。 4、卫生措施：及早清除病枝、病枝，重病树应砍伐烧毁,复习思考题,1试述玉米细菌性萎蔫病在国外的分布状况、症状表现特点、病原分类地位、检验方法和防治措施。 2试述梨火疫病在国外的分布状况、症状表现特点、病原分类地位、检验方法和防治措施。 3试述柑橘黄龙病在国外的分布状况、症状表现特点、病原分类地位、检验方法和防治措施。 4.细菌病害的传播特点是什么？ 6试述细菌病害的检验与诊断要点。 7植原体的病害为何检验？,第七章 检疫性植物病毒,2006.10.2,检疫性植物病毒的检验方法 番茄环斑病毒 马铃薯帚顶病毒 *其他检疫性植物病毒 南方菜豆花叶病毒、可可枝肿病毒、香石竹环 斑病毒,了解检疫性植物病毒的种类、分布及重要性，掌握植物检疫性病毒的检验方法，掌握番茄环斑病毒、马铃薯帚顶病毒引起病害的症状、病原特性、寄主范围、病害的发生发展规律以及检验措施。,检疫性植物病毒的检验方法,生物学检测技术 血清学检测技术 电子显微镜技术 分子生物学检测技术,1.生物学检测技术,原理： 植物病毒对鉴别寄主或指示植物的特异反应。 鉴别寄主谱： 对一种病毒有特殊反应的一组寄主，一般包括35种不同反应类型的寄主植物。一般包括： 系统侵染的寄主 局部侵染的寄主 不受侵染的寄主,例1，TMV和CMV在田间烟草植株上都呈花叶症，为了确定是否有TMV，或是将两者区分开，便可通过下列三种植物的接种来确定。,2.血清学检测技术,原理： 抗原与抗体的特异结合 方法： 免疫电泳和免疫电镜、琼脂双扩散、ELISA等。,两种抗原相同，都与已知的抗血清反应,琼脂双扩散反应沉淀线判断图,抗原1,抗血清,抗原2,抗血清不专化含有两种以上的抗体,抗原2,抗原1,抗原2,抗原1,抗血清,抗血清,两种抗原有一定的亲缘关系但不完全相同,3.电子显微镜技术,原理： 以电磁波为光源，利用短波电子流，分辨率达到0.99，比光学镜要高1000倍以上,主要方法： 超薄切片、负染技术、免疫电镜技术,4.分子生物学检测方法,分子杂交检测 PCR技术检测,分子杂交 在DNA和RNA之间进行，依据是RNA与互补的DNA之间存在着碱基的互补关系。 在一定的条件下，RNA-DNA形成异质双链的过程称为杂交。其中预先分离纯化或合成的已知核酸序列片段叫做杂交探针(probe)，由于大多数植物病毒的核酸是RNA，其探针为互补cDNA也称为cDNA探针。,植物病毒分子探针具专一性强、灵敏度高、准确快速等优点 分子探针的长度一般在5001500核苷酸碱基对（bp） 常用广谱分子探针，即包括多个不同专化性基因的核苷酸片断。,PCR技术检测,PCR （Polymerase chain reaction）聚合酶联反应：将极微量的靶DNA片断，在4h左右特异性扩增上百万倍。 植物病毒主要是RNA病毒，进行PCR检测时，需要将RNA逆转录成互补DNA（cDNA)，再进行PCR，即RTPCR技术。,检疫性植物病毒的检验方法 番茄环斑病毒 马铃薯帚顶病毒 *其他检疫性植物病毒 南方菜豆花叶病毒、可可枝肿病毒、香石竹环斑病毒,了解检疫性植物病毒病害的种类、分布及重要性，掌握植物检疫性病原病毒的检验方法，掌握番茄环斑病、马铃薯帚顶病的症状、病原特性、寄主范围、病害的发生发展规律以及这两种病害的检验措施。,番茄环斑病毒 Tomato ring spot virus,分布： 1936年，美国东部新泽西发生ToRSV至今已有30多个国家和地区发现有该病毒，主要集中在北美温带地区，即美国和加拿大。,寄主： ToRSV寄主范围广，包括双子叶和单子叶植物的35个科，自然界，ToRSV主要侵染木本植物，草本及观赏植物。,危害情况： 1975年，ToRSV侵染加拿大安大略的地区葡萄，产量损失7695，甚至造成绝产。同年，ToRSV 侵染后，纽约葡萄严重减产，奥尔良悬钩子果实减产2150。,症状： 番茄症状（番茄环斑病） 枝条卷曲和坏死，嫩叶、叶柄生褐色坏死环和波纹，果实受侵染，外表产生环斑，灰色到褐色栓皮,葡萄上的症状（葡萄黄脉病） 叶黄脉、斑驳、环斑，节间缩短呈莲蓙状丛生，植株严重矮化，果实败育变小，至绝产，几年内植株渐渐坏死。植株剥皮后，可见增厚的海绵状韧皮组织及坏死凹陷,苹果上的症状（apple union necrosis and decline） 砧木和接穗接合部肿胀，裂开，剥开树皮，树皮内侧变厚，多孔，愈合斑连接处有不明显的线，在这条线相对方向的形成层表面也有一类似的线，沿着这条线有一小的深沟或一条光滑的细缝，坏死的树皮覆盖在沟或缝上。 叶变少，变小，黄化，嫩枝呈束状丛生，果实较小，果皮颜色加深。树皮颜色淡红,桃树和李属其它树种上的症状（桃树黄芽花叶）：沿中脉产生扁椭圆形羽缘状病斑，由灰绿色变为浅绿色，芽发育成为小而变形的丛生叶，成浅黄色而死亡。 （桃树茎痘病）：树皮变厚，发软，海绵状，剥开树皮，树干上出现凹陷的痘斑和沟槽。叶片褪绿，叶芽发育推迟，落叶提前，果实畸形，果味变异，提前成熟和脱落。,复盆子上的症状：侵染当季不表现症状，第二年叶片表现黄色斑驳，条纹或脉褪绿，叶片生长推迟，病株表现不结果或形成易碎果 悬钩子上的症状：植株矮化，小果并减产，幼龄植株叶片出现褪绿环斑。第二年，叶片症状不明显，但新叶出现偏上性，早落。第三年有1080的果枝死亡。,病原： 番茄环斑病毒 学名 Tomato ring sopt virus （ToRSV） 异名 烟草环斑病毒2号 Tomato ring spot virus No.2 烟病毒13号 Nicotiana virus 13 桃黄芽花叶病毒 Peach yellow bud mosaic virus 葡萄黄脉病毒 Grape yellow vein virus 分类地位 线虫传多面体病毒组 R/1:2.8/44+2.4/41:S/S:S/C,Ve/Ne Nepovirus,病毒特性： 等轴对称球形，直径28nm，在烟草汁液中，58 下10min、20 下2d、4 下21d、20 下几个月以后失去侵染力。接种的烟叶和黄瓜子叶汁液，稀释限点为103，而系统侵染的烟草汁液，稀释限点低于101。,生物学特性： 稳定性差，难纯化，纯化的病毒制剂中有两类粒体：无RNA的蛋白外壳的T粒体和侵染性核蛋白的B粒体，B粒体具侵染性，二者血清学性质有差异。T粒体分子量3.2106，沉降系数53S，B粒体分子量5.5106，沉降系数126128S。B粒体RNA分子量2.3106 ，占粒体重量的40,生理分化： 烟草株系：以烟草环斑病毒2号为代表，是典型株系。自然发生在温室的烟草幼苗，主要分布在美国东部。 桃黄芽花叶株系：自然发生在杏、扁桃、桃上，分布在美国西部。此株系与Price 的烟草株系较难区分。因为两株系在草本寄主上的症状相似，血清学上无区别，而且大多数分离物在桃树上都产生黄芽花叶症状 葡萄黄脉株系：自然发生在葡萄上，在草本寄主上引起的症状与上述两个株系类似，但可在豇豆上引起顶枯，血清学上也与上述两个株系不同，主要分布在美国西部 其他株系：李属植物上不同分离物 （李褐线分离物 Prune brown line，李茎环孔分离物Prunus stem pitting和樱桃叶斑驳分离物Cherry leaf mottle）存在血清学差异，但差异不明显。樱桃叶斑驳分离物不能由Xiphinema californicum传播,传播： 田间传播介体是剑线虫属，其中Xiphinema americanum优势种群。成虫和三龄幼虫都能传毒，在病根部饲毒1h可获得病毒，而后在1h内又能将病毒传给接种植物。 由繁缕、千日红、悬钩子、大豆、弗吉尼亚草莓、烟草、番茄和红三叶草等植物的种子传播。 杂草是重要的田间毒源。 远距离传播依靠植物的种子和苗木调运进行,检验方法： 生物学检测： 黄瓜：局部褪绿斑，而后产生系统褪绿和斑驳 苋色藜和昆诺阿藜：小局部褪绿斑，后系统侵染顶端枯死 菜豆：局部褪绿斑或坏死斑，系统症状为皱缩和顶叶坏死 烟草：局部坏死或环斑，幼叶系统褪绿环纹和斑纹，后隐症 矮天牛：局部坏死斑，幼叶坏死和枯萎 番茄：局部坏死斑，幼叶产生系统斑驳和坏死 豇豆：局部褪绿斑或坏死斑，引起系统侵染，植株顶端坏死,形态学检测：浸渍法制样，电镜观察病毒粒体形态，测量粒体大小。 血清学和PCR检测：琼