重组体的筛选与鉴定.ppt

第六章 重组体的筛选与鉴定,转化子：在DNA分子克隆中，通常将导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子； 重组子：含有重组DNA分子的转化子； 期望重组子（目的重组子）：含有外源目的基因的重组子。,*为什么要进行筛选和鉴定？ （1）不带任何外源DNA插入片段，仅由线形载体分子自身连接形成的环状分子； （2）由一个载体分子和数个外源DNA片段组成的重组分子； （3）单纯由数个外源DNA片段连接而成的多聚DNA分子；,转化后的克隆群体：,*鉴定的方法有哪些？ 载体表型选择法 根据插入序列的表型特征选择 DNA电泳检测法 核酸杂交检测法 免疫化学检测法 转译筛选法,第一节、载体表型选择法,根据载体所携带的标记基因的表型进行选择。 一、抗药性标记插入失活选择法 二、-半乳糖苷酶显色反应选择法,一、抗药性标记插入失活选择法,插入效应:外源DNA片段与载体特定部位连接后，使载体的相关功能发生改变，为重组子的筛选提供信息。 插入失活 插入表达,抗药性插入失活指的是外源DNA插入载体的抗药性筛选标记中，导致该基因结构破坏而失活，使细胞丧失对抗生素抗性的功能。,transfer of colonies,+ampicillin,+ ampicillin + tetracycline,这些克隆是有重组质粒的细菌,二、-半乳糖苷酶显色反应选择法,在LacZ体系中，两个彼此互补的突变基因各自编码产生的多肽产物均无活性，但两个突变体间通过肽互补作用可呈现有功能的-半乳糖苷酶活性，进而可分解底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）而产生深蓝色物质，使菌落呈现蓝色。,当外源基因DNA片段插入载体中LacZ 肽区段的多克隆位点后，会阻断序列的读码结构，使其编码的肽失去活性，使重组子所在的细菌不能完成-互补而形成白色菌落。根据这种-半乳糖苷酶的显色反应，可以检测和筛选出携有外源基因重组子克隆。此法又称蓝白筛选法。,第二节、根据插入序列的表型特征选择,根据克隆片段为寄主提供的新的表 型特征选择重组体DNA分子,例如：亮氨酸（Leu)缺陷菌在无Leu培养基中不生长,当含Leu外源基因在此缺陷菌中表达时可生长，以此来筛选阳性克隆。,*局限性： 克隆的DNA片断是一个完整的基因序列 能在原核生物中实现功能表达,第三节、DNA电泳检测法,一、直接电泳检测法 二、酶切电泳筛选法 三、PCR扩增检测法,一、直接电泳检测法,菌落 提取质粒 单酶切 电泳 适于插入片段较大的重组子初筛,二、酶切电泳筛选法,经初筛鉴定有重组子的菌落，小量培养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的内切酶切割，释放出插入片断。,三、PCR扩增检测法,利用外源DNA插入位点两侧存在的特定序列设计引物，对外源DNA进行PCR分析。,电泳检测法,凝胶电泳检测,加样孔,DNA Marker,空质粒,重组质粒,重组质粒酶切,重组质粒的PCR扩增片段,第四节、核酸杂交检测法,一、原理 具有一定同源性的两条核酸单链（DNA或RNA）在适宜的温度和离子强度等条件下，可按碱基互补配对原则高度特异的复性形成双链。,二、核酸杂交检测方法,1.核酸探针 概念：核酸探针是指带有标记的与目 的基因同源互补的一段核苷酸序列。 大小：长度以50-300个碱基为宜 种类：DNA探针、CDNA探针、RNA探针,2.探针标记物 放射性标记物 常用的有32P、35S; 非放射性标记物 常用的有生物素、地高辛和荧光素等。,3.核酸杂交方法 液相杂交 固相杂交,4杂交膜的选用 硝酸纤维素膜:本底浅，与小片段核酸(200bp)结合不牢，质地脆，不易操作； 尼龙膜:韧性好，耐用，结合力强，可与小至10 bp的片段共价结合。,5.固相核酸杂交的主要过程： 1）核酸的变性； 2）变性核酸在膜上的固定； 3）预杂交； 4）杂交； 5）洗膜； 6）结果显示。,1）菌落杂交或噬菌体杂交 把生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑按照其原来的位置不变地转移到滤膜上，在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用，以从成千上万的菌落或噬菌斑中鉴定出含有重组体分子的菌落或噬菌斑的方法。 *适于从基因文库中筛选目的基因,6.几种常用固相核酸杂交方法,菌落杂交筛选法,2）Southern杂交 提取总DNA 酶切 琼脂糖凝胶电泳 碱变性 转膜 固定 杂交,3） Northern印迹杂交 (Northern blot hybridization)： *不能采用碱变性法。 *常采用甲醛、聚乙二醛、二甲基亚砜、甲基氢氧化汞等变性方法。,4.斑点杂交(dot hybridization)： 直接将变性DNA样品点于硝酸纤维素膜上，固定好后再进行杂交。,（1）DNA斑点杂交 （2）RNA斑点杂交 （3）完整细胞斑点杂交,Control,样品,标记探针浓度检测,四类核酸分子杂交法的技术路线比较,第五节、免疫化学检测法,一、放射性抗体检测法 二、免疫沉淀检测法 三、酶联免疫吸附测定（ELISA） 四、免疫印迹（western blotting）法,一、放射性抗体检测法,1、原理： 一种抗原产生的免疫血清含有好几种IgG抗体，分别识别抗原分子上的不同定子（决定簇），并分别同各自识别的抗原定子相结合；, 抗体分子能够十分牢固地吸附在固体基质(如聚乙烯等塑料制品)上，而不会被洗脱掉； 通过体外碘化作用，IgG抗体便会迅速地被放射性同位素125I标记上。,2、放射性抗体检测法的过程,二、免疫沉淀检测法 原理 抗原抗体凝集反应。 2.方法 把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。,菌落,沉淀素,免疫沉淀检测法,3.缺点：只能检测分泌出细胞的蛋白质 改良： 采用cI857溶原性大肠杆菌做受体细胞； 将含有抗体和溶菌酶的琼脂小心倒在菌落上。,三、酶联免疫吸附测定（ELISA） （enzyme linked immunosorbent assay） 固相的抗原或抗体； 酶标记的抗原或抗体； 酶作用的底物。,1. 原理： 一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。 酶连（enzyme-linke）： 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。,待测基因 产物蛋白,一抗,二抗,酶,待测基因 产物蛋白,一抗,二抗,无色的底物,有色的产物,比色观察,酶,2. ELISA检测的一般步骤 （1）固定样品：将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。,孔底,（2）一抗结合：加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。,一抗,（3）二抗结合：加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。,二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。,二抗,（4）显色反应：加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。,（5）比色：在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。,四、免疫印迹法（western blotting） 1、蛋白质的电泳分离-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE),点样,电泳方向,凝胶中的蛋白质的染色： 考马斯亮蓝： 灵敏度底、只能检出0.3-1g/带，但可褪色回收。 硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,2、将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上转膜 电转移 常用的膜：硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等。,Western装置,3、免疫学检测原理与ELISA相同,待测蛋白,硝酸纤 维素膜,一抗,二抗,辣根过氧 化物酶,底物,产物(显色),PAGE胶,待测蛋白,辣根过氧化物酶：HRPO,第六节、转译筛选法 一、无细胞翻译系统 指保留蛋白质生物合成能力的细胞抽取物 。,用于蛋白质的生物合成研究的体外翻译系统主要有： *大肠杆菌无细胞翻译系统 *兔网织红细胞无细胞翻译系统 *麦胚无细胞翻译系统,二、转译筛选 1、杂交抑制转译法 适用于筛选那些高丰度的mRNA 2、杂交释放转译法 可用于检出低丰度mRNA,1、杂交抑制转译法 原理：mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。,单链mRNA,核糖体 小亚基,核糖体 大亚基,能翻译,mRNA,DNA,核糖体 小亚基,核糖体 大亚基,不能翻译,过程,2、杂交释放转译法 原理：在高甲酰胺溶液中载体上克隆的cDNA与它的mRNA杂交吸附，然后洗脱，释放出与它对应的mRNA，进行体外转录。研究其转录产物的性质是否是预期的基因产物（如分子量、免疫原性等）。,过程,硝酸纤 维素滤膜,载体和插 入的cDNA,总mRNA,cDNA基因的 mRNA,杂交,洗脱,cDNA基因的 mRNA,体外翻译,cDNA编码的蛋白,电泳,凝胶放射自显影,