肾脏病相关的免疫学检查.ppt

肾脏病相关的免疫学检查,北大医院肾内科 陈旻,主要内容,ANCA 抗GBM抗体 免疫球蛋白 补体,抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）,Anti-neutrophil Cytoplasmic Autoantibodies,概念,以中性粒细胞和单核细胞胞浆成份为特异性靶抗原的自身抗体 可存在某些小血管炎病人血清中,背景,1982年 Davies等首次报道 1985年 van der Woude等发现ANCA和WG相关 1987年 Savage等发现ANCA和MPA相关 1988年 Falk和Jennette发现部分少免疫复合物 型节段坏死性肾小球肾炎血清可测到 ANCA,小血管炎特点,全身系统性疾病，缺乏特异临床表现，早期诊断有时比较困难； 发病凶险，进展迅速，可出现肺出血和ARF， 严重者危及生命。 ARF：53.8% 肺出血：24.4%,我科的统计资料 从发病到检测ANCA的时间（500例患者）： 平均237.6天，中位数为60天 1个月内确诊者：23.2% 3个月内确诊者：47.2% 1年以上确诊者： 11.0% 最长1例长达4年,Chen M, et al. Postgrad Med J 2005, 81,723-7,ANCA阳性小血管炎发生率,西方国家最常见的自身免疫性疾病 英国：发病率仅次于RA 我国：不少见 北京大学肾脏病研究所近8年共新诊断700例 确诊的人数逐年增加,发病率确实在增加？ 医生对该疾病的认识深入？,ANCA意义,ANCA是小血管炎的特异性血清诊断工具 ANCA滴度变化与病情相关 诊断小血管炎 判断活动性 估计复发,系统性血管炎,以血管壁的炎症和纤维素样坏死为病理特征的一组疾病（vasculitides） 分类 原发性和继发性 原发性血管炎的分类 目前通用1994年Chapel Hill血管炎命名分类 Jennette et al. Arthritis Rheum 1994;37:187-192,血管的解剖分类,大血管 中等血管 小血管 （内脏血管）,大动脉主动脉,中动脉、小动脉,微小动脉、毛细血管、小静脉,系统性血管炎命名分类（Chapel Hill， 1994）,大血管 巨细胞（颞）动脉炎 Takayasu动脉炎（高安病，大动脉炎） 中血管 结节性多动脉炎（经典型结节性多动脉炎） Kawasaki 病（川崎病） 小血管 韦格纳肉芽肿病（Wegeners granulomatosis, WG） 变应性肉芽肿性血管炎（Churg-Strauss syndrome, CSS） 显微镜下型多血管炎（Microscopic polyangiitis, MPA） 过敏性紫癜 原发性冷球蛋白血症性血管炎 皮肤白细胞碎裂性血管炎 Jennette et al. Arthritis Rheum 1994;37:187-192,ANCA检测方法,一、间接免疫荧光法 Indirect immunofluorescence， IIF 二、酶联免疫吸附 Enzyme Linked Immunosorbance Assay， ELISA,间接免疫荧光法,最常用、经典，方法简便 缺点：不易区分ANA，主观性,IIF多见两种荧光模式,胞浆型 cANCA 胞浆内呈粗大颗粒，不均匀分布，靶抗原主要为PR3,环核型pANCA 荧光沿细胞核周围成线状分布，靶抗原主要为MPO,应注意与ANA区别,ANA阳性，特别是强阳性者，单独应用IIF检测ANCA是不可取的（需要结合ELISA）,ANCA检测方法,二、酶联免疫吸附 Enzyme Linked Immunosorbance Assay， ELISA 总抗原ELISA: 嗜天青颗粒粗制品做抗原 灵敏度、特异性稍差 特异性抗原ELISA: 优点：可区分不同靶抗原 特异性好，灵敏度高，主要ANCA检测手段 缺点：价格昂贵，抗原来源困难,已知的ANCA靶抗原,PR3,cANCA的主要靶抗原 抗PR3抗体相对特异性较高，主要用于诊断WG 中性粒细胞嗜天青颗粒中被发现的第三个中性丝氨酸蛋白酶（前二个是HLE、CG） 由228个氨基酸所组成 ，分子量29kD 可以消化、降解不溶于水的弹力蛋白，还可以消化、降解某些微生物。,髓过氧化物酶（MPO）,pANCA的主要靶抗原之一 在中性粒细胞嗜天青颗粒中含量最为丰富，可以占到细胞干重的5 MPO可以催化过氧化氢和卤素（Cl-）反应产生次氯酸，杀死吞噬的微生物。,杀菌/通透性增高蛋白 （BPI）,1995年由Zhao等人发现 中性粒细胞内最重要的G-菌的内源性抗生素 IIF法中不典型ANCA的靶抗原之一 抗BPI抗体多见于慢性炎症性肺部疾病（特别是长期绿脓杆菌感染者）如囊性纤维化,中性丝氨酸蛋白酶家族的其它成员,人白细胞弹力蛋白酶（HLE），组蛋白酶G（cathepsin G），PR3和天青杀素（azurocidin） 消化、降解许多细胞外基质 杀菌、抑菌的能力,其它,乳铁蛋白 防御素（defensins）和-葡萄糖醛酸酶（-glucoronidase） 等等,ANCA相关疾病,一、 原发系统性小血管炎 韦格纳氏肉芽肿 WG 显微镜下多血管炎 MPA 过敏性肉芽肿性血管炎 CSS ANCA相关坏死性新月体性肾小球肾炎 NCGN （原发性小血管炎的肾脏局限型）,ANCA相关疾病,二、其它 过敏性紫癜 结缔组织病：SLE、类风湿性关节炎 炎症性肠病：溃疡性结肠炎、克隆病 自身免疫性肝病、原发性硬化性胆管炎 感染性疾病：囊性纤维化、寄生虫感染（溶组织阿 米巴、盘尾丝虫病）、病毒感染（HIV） 药物： 肼苯哒嗪、丙基硫氧嘧啶,抗原特异性ELISA、IIF和疾病的关系,C-ANCA/抗PR3抗体的临床意义 （欧洲14个中心的评估报告）,Hagen et al. Kidney Int 1998;53:743,P-ANCA/抗MPO抗体的临床意义 （欧洲14个中心的评估报告）,Hagen et al. Kidney Int 1998;53:743,C-ANCA和抗PR3抗体同时阳性用于诊断WG的敏感性为73% P-ANCA和抗MPO抗体同时阳性用于诊断MPA和iRPGN的敏感性分别为67%和82% 特异性达99%,Hagen et al. Kidney Int 1998;53:743,总结,ANCA是小血管炎的特异性血清学诊断工具，且有助于指导治疗，估计复发 目前，只有anti-PR3和anti-MPO具有较明确的临床价值,抗肾小球基底膜抗体,Anti-Glomerular basement membrane autoantibodies，Anti-GBM,抗GBM抗体相关疾病,定义：是指在循环中或脏器中沉积了抗GBM抗体的 一组临床疾病 临床分类： 1 急进性肾炎I型：抗GBM抗体阳性，无肺出血， 新月体性肾小球肾炎 2 Goodpasture病：三联征新月体性肾炎、 肺出血、抗GBM抗体 3 抗GBM抗体阳性，临床表现较轻的肾小 球肾炎，无明显肾功损害,急进性肾炎 rapidly progressive glomerulonephritis,临床征候群 急性肾炎综合征 短期内出现少尿或无尿 肾功能迅速恶化 病理表现 多为新月体性肾炎（50%，50%）,新月体性肾炎 Crescentic Glomerulonephritis,分型（根据免疫荧光病理分为三型） I型 抗肾小球基底膜（GBM）抗体型 抗GBM抗体沿肾小球基底膜线样沉积 II型 免疫复合物型 III型 少免疫沉积型（pauci-immune) 未见或微量免疫复合物沉积,I型中合并ANCA（+）者为IV型，不合并ANCA者仍为I型 III型中ANCA（-）者为V型，ANCA（+）者为III型,在荧光病理的基础上根据血清学又可分为五型,新月体肾炎病理分型与抗GBM及ANCA,抗GBM抗体检测的重要性,预后凶险，早期血浆置换可有一定的疗效 临床出现少尿无尿、Scr大于700umol/L、病理新月体大于85%则预后不良。,GBM抗原,3(IV)NC1 （IV型胶原 3链 非胶原1区） 正常隐匿，环境或其它因素可诱使其暴露,抗GBM抗体检测方法,间接免疫荧光IIF 正常人新鲜冰冻肾组织切片为底物，不易保存 典型荧光：线条样沿GBM沉积 敏感性、特异性不好，主观性,抗GBM抗体检测方法,酶联免疫法 ELISA 胶原酶消化后的可溶性人GBM的抗原 蛋白成分（包括IV型胶原3链NC1区），易于保存 敏感性、特异性较高，可达95%以上 判定结果客观，可定量 对疾病的诊断和疗效判定有很大意义,IIF法,Ag 加待测血清 加二抗,IIF法,阴性血清,阳性或待测血清,IIF法,玻片标记、标号 PBS 1:10 稀释血清，每点加30ul（阳性、阴性、待测血清） 湿盒中，室温，30 PBS洗3次，每次1以上 加 PBS 1：4稀释（二抗）荧光素标记羊抗人IgG 20ul/点 室温，30 PBS洗1分钟以上 荧光显微镜下读片,抗原特异性ELISA法检测ANCA及抗GBM抗体,Ag 加待测血清 加二抗,抗原特异性ELISA法检测ANCA及抗GBM抗体,+ - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10,Ag+ Ag -,+阳性血清 -阴性血清 1-10待测血清,方法,1. 包被酶标板: 抗原包被孔PR3、MPO、GBM 非抗原包被孔碳酸盐缓冲液 2. 孵育：37C，60 3. 洗板：PBS/Tween20 2次，拍干 4. 一抗：血清1:50稀释（阳性、阴性、待 检） 5. 孵育：37C，30,方法,6. 洗：PBS/Tween20 3次，拍干 7. 二抗：羊抗人IgG (HRP) 1:2000稀释 8. 孵育：37C，30 8. 洗：PBS/Tween20 3次，拍干 9. 底物缓冲液 10. 显色：37C，510分钟 11. 终止反应：1M 硫酸 12.测OD值：=490nm（酶标仪）,数据处理,血清OD值: 抗原包被孔平均OD值非抗原包被 孔平均OD值 建立回归曲线：阴性5%，阳性100%，算 出待检% 正常值建立：50100份正常人血清，分 别算出%，均值3SD,% 100% 19% 5%,0.2 X 1.4 OD,我科正常值,抗MPO-ANCA 23% 抗PR3-ANCA 17% 抗GBM 13%,送检要求,取3ml血，不抗凝，血清，病历摘要（详细） ANCA 120元，GBM 50元 （注明联系电话） 邮寄地址：北京西城区西什库大街8号 北京大学第一医院肾内科 邮编：100034 联系人：许远，庞维 电话2562,咨询、转病人或随访 （010）66551736 陈旻大夫关于小血管炎 崔昭大夫关于抗GBM抗体病,免疫球蛋白,由浆细胞合成和分泌 单体的基本结构 ：两条轻链和两条重链 重链类型：、（根据重链命名） 轻链类型：、,检测方法,IgG、IgA、IgM的测定 琼脂单向扩散法 火箭免疫电泳法 其它：包括免疫透射浊度法、终点散射比浊法等 IgD和IgE：含量很低，需要应用敏感性很高的方法 放射免疫技术 酶联免疫吸附法（ELISA）,肾脏病时血清Ig的变化,多克隆性增高 慢性感染、慢性肝病、淋巴系统肿瘤和结缔组织病 SIE肾损害、冷球蛋白肾损害、狼疮性肾炎、干燥综合征肾损害 单克隆性增高 浆细胞病肾损害，如多发性骨髓瘤肾损害 减低 NS时常出现IgG降低，尿中丢失过多,补 体,由三组球蛋白组成 第一组：由9种补体成分组成，C1C9 第二组：B因子、D因子和P因子，参与补体的旁路活化途径； 第三组：C1抑制物、I因子、H因子、C4