管灸治疗面神经炎的机制研究.ppt

怎样进行机制研究？,管灸作为灸法治疗的一种，主要用于治疗面神经炎、神经性耳聋等疾病。采用人类疾病动物模型进行治疗机制研究是目前国内外最常用的方法。因此我们通过建立家兔面神经损伤模型，采用管灸和电针进行治疗，对其机理进行研究，同时和电针进行对比。,所运用的技术,病理学技术,分子生物学技术,检测内容,拟解决的问题,对损伤面神经是否具有促进修复作用？,修复的机制是什么？,对临床运用管灸有什么指导作用？,操作流程,动物分组,分组,模型组 制作面神经损伤模型，但不做任何治疗,电针组 制作面神经损伤模型，给予电针治疗,假手术组 仅手术暴露面神经，但不损伤面神经,管灸组 制作面神经损伤模型，给予管灸治疗,模型制作方法,家兔麻醉后取耳屏前至下颌角下缘“S”形切口，钝性分离暴露面神经颊支，用同一特定钳于瞳孔下正对神经干处一扣压榨30秒钟、松开30秒钟、再压榨30秒钟后（Sunderland III度损伤的力度），用缝线标记损伤段，缝合皮下及皮肤层。假手术组动物暴露双侧面神经颊支，钝性分离面神经后，不予压榨即缝合皮下及皮肤层。术后常规抗感染治疗5天后开始治疗，每天1次，6天为一疗程，疗程间隔1天。 假手术组：常规饲养，仅做术后常规抗感染治疗。 模型组：常规饲养，仅做术后常规抗感染治疗。 电针组：常规饲养，治疗时用兔台固定，选用双侧翳风，直刺1.0cm；颊车，直刺0.5cm；下关，直刺0.5cm；合谷，约当第2掌骨中点桡侧，直刺1.0cm。其中翳风与颊车采用强度为20100Hz(波型间动频为30次/min)；电压24V，强度由小逐渐增大，电针时间30min；治疗时间每次30分钟。 管灸组：照常饲养，治疗时用兔箱固定，取2g艾绒置入特制的管灸器中，点燃后将软管插入家兔双侧外耳道约2cm，施以熏灸，每次约30分钟。,各组分别于第一、二、四疗程后随机选择7只动物处死，按相应的要求取材进行相关指标检测。实验结束时切取一侧面神经核、标记段的面神及颊肌组织冻于液氮中保存以备RTPCR检测，切取动物另一侧面神经核、部分标记段面神经及颊肌组织，经4%多聚甲醛/0.1molPBS（Ph7.07.6），含有1/1000DEPC中固定4hr，全自动组织脱水机处理，石蜡组织包埋机包埋，石蜡组织切片机连续作4m厚切片。将切片裱贴于原位杂交专用玻片上。 其余面神经分别固定于4%甲醛-钙液及10%甲醛中。损伤近、远点作横断石蜡包埋，损伤处作纵断石蜡包埋，分别作HE染色、水溶性猩红-亮绿双重染色。观察神经纤维结缔组织、雪旺细胞、髓鞘、轴突的病理改变。采用Image-Pro Plus 5.0图像分析系统测量髓鞘厚度、神经束神经纤维总数、神经纤维直径、轴突面积和神经束面积。颊肌组织亦作HE染色，光镜观察肌肉组织病理改变情况。,模型制作流程,压榨面神经,分离面神经,标记损伤部位,模型制作流程,面神经,钳子,丝线,病理检测方法,病理切片,HE染色,猩红-亮绿染色,神经纤维数、纤维直径,髓鞘厚度、轴突面积,神经束面积,髓鞘厚度、轴突面积比较,注：与模型组比较，：p 0.05；p0.01；与电针组比较p 0.05；p0.01,病理检测结果,神经束面积比较,注：与模型组比较，：p 0.05；p0.01；与电针组比较p 0.05；p0.01,病理检测结果,神经纤维数、纤维直径比较,注：与模型组比较，：p 0.05；p0.01；与电针组比较p 0.05；p0.01,病理检测结果,结论,与假手术组相比，模型组神经纤维数、纤维直径、髓鞘厚度、轴突面积、神经束面积随着疗程延长均有增高趋势，但仍小于假手术组，有统计学差异（P0.05或0.01）；与模型组相比，管灸组和电针组第2、3疗程上述指标均增高，有统计学差异（P0.05或0.01）。管灸组与电针组上述指标各疗程无显著性差异。结果提示管灸和电针均可以促进面神经再生，且管灸和电针疗效相当。 病理观察和分析表明，管灸和电针对损伤神经的修复再生具有促进作用，管灸疗效和电针相当。,表情肌,面神经核、面神经,NGF NT-3,多点标记DIG（地高辛）探针原位杂交过氧化物酶显色法,RT-PCR方法（逆转录PCR法）,NGF NT-3检测,NGF原位杂交检测结果,管灸对面神经损伤模型家兔面神经核中NGFmRNA积分光密度的影响,注：与模型组比较，：p 0.05；p0.01；与电针组比较p 0.05；p0.01,管灸对面神经损伤模型家兔面神经中NGFmRNA积分光密度的影响,注：与模型组比较，：p 0.05；p0.01；与电针组比较p 0.05；p0.01,NGF原位杂交检测结果,NGF原位杂交检测结果,管灸对面神经损伤模型家兔表情肌中NGFmRNA积分光密度的影响,注：与模型组比较，：p 0.05；p0.01；与电针组比较p 0.05；p0.01,NGF原位杂交检测结果,NGF RT-PCR检测结果,管灸对面神经损伤模型家兔面神经核中NGFmRNA的影响,注：与模型组比较，：p 0.05；p0.01；与电针组比较p 0.05；p0.01,管灸对面神经损伤模型家兔面神经中NGFmRNA的影响,注：与模型组比较，：p 0.05；p0.01；与电针组比较p 0.05；p0.01,NGF RT-PCR检测结果,管灸对面神经损伤模型家兔表情肌中NGFmRNA的影响,注：与模型组比较，：p 0.05；p0.01；与电针组比较p 0.05；p0.01,NGF RT-PCR检测结果,管灸和电针对NGF表达的影响,结论: 1.管灸和电针均可以提高面神经核、面神经及表 情肌中NGF表达。 2.部分指标显示管灸较电针为优。,NT-3原位杂交检测结果,管灸对面神经损伤模型家兔面神经核中NT-3mRNA积分光密度的影响,注：与模型组比较，：p 0.05；p0.01；与电针组比较p 0.05；p0.01,NT-3原位杂交检测结果,管灸对面神经损伤模型家兔面神经中NT-3mRNA积分光密度的影响,注：与模型组比较，：p 0.05；p0.01；与电针组比较p 0.05；p0.01,NT-3原位杂交检测结果,管灸对面神经损伤模型家兔表情肌中NT-3mRNA积分光密度的影响,注：与模型组比较，：p 0.05；p0.01；与电针组比较p 0.05；p0.01,NT-3 RT-PCR检测结果,管灸对面神经损伤模型家兔面神经核中NT3mRNA的影响,注：与模型组比较，：p 0.05；p0.01；与电针组比较p 0.05；p0.01,NT-3 RT-PCR检测结果,管灸对面神经损伤模型家兔面神经中NT3mRNA的影响,注：与模型组比较，：p 0.05；p0.01；与电针组比较p 0.05；p0.01,管灸对面神经损伤模型家兔表情肌中NT3mRNA的影响,注：与模型组比较，：p 0.05；p0.01；与电针组比较p 0.05；p0.01,NT-3 RT-PCR检测结果,结论: 1.管灸和电针均可以提高面神经核、面神经及表 情肌中NT-3表达。 2.部分指标显示管灸较电针为优。,管灸和电针对NT-3表达的影响,结论,1.病理观察及分析表明，管灸治疗对损伤面神经的修复再生具有促进作用。 2.原位杂交及RTPCR实验结果均表明管灸治疗可以增强面神经核、面神经、面部表情肌NGFmRNA、NT-3mRNA的表达。 3.管灸治疗增强面神经核、面神经、面部表情肌NGFmRNA、NT-3mRNA的表达以治疗两疗程时达高峰，继续治疗虽有增高，但增高幅度不大。 4.管灸治疗增强面神经核、面神经、面部表情肌NGFmRNA、NT-3mRNA的表达与电针总体疗效相当，部分指标优于电针。,结果,以上结论提示，管灸治疗对损伤面神经纤维的修复再生具有促进作用，能增加面神经核、面神经、表情肌中NGF与NT-3mRNA的表达，即在中枢、外周及效应器等不同层面均能提高NGF与NT-3mRNA的表达，这可能是其在治疗面神经炎过程中促进面神经再生，恢复神经机能的分子作用机制之一，从神经营养因子的角度部分阐明了临床上管灸治疗面神经损伤的机理。