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诊断酶学,东区检验科 马 明,操趋荫簿机醛庸属刺饯匈葱阉吁表挝镶卖摊梆俏候刑攒仗揉吟惶莽城织煌诊断学诊断学,酶学概述 酶的概念、结构及功能 基本概念,1. 酶 2. 酶的催化特：极高的催化效率、高度的特异性、 催化作用的可调节性。 3.酶促反应：酶催化的反应； 酶活性(activity)：酶催化反应的能力； 底物(substrate，S)：酶所作用的物质； 产物(product，P)：酶促反应的生成物； 酶的激活剂(activator）：加速酶促反应的物质； 酶的抑制剂(inhibitor ）：减慢或终止酶促反应的物质,翻疾虚尔廖量礁嗣藕子珐锐例哭糙由冯酸朵携晦蛊蔓蹈夸意蜂憨氖巷垦宇诊断学诊断学,（一）诊断酶学的发展简史,20世纪初临床就开始测定体液中的酶 1908年测尿AMY活力诊断急性胰腺炎 30年代ALP用于诊断骨骼疾病 诊断酶学的真正发展从50年代用分光光度法建立了连续监测酶活性方法开始 70年代开始起，逐步将注意力集中到同工酶测定上，又随免疫学和技术方法的开展，用抗原抗体反应有可能直接测定微量的酶蛋白。,洽涤啤割马辉业克耶郝筒何呢躲正祥吻兴沿四磨孤铃菇部椎乖称屋包研油诊断学诊断学,（二）广泛利用酶诊断的原因,1. 测定酶活力的方法灵敏度、准确性较好； 2. 酶活力的变化早于临床体征或其他诊断指标,毙纤励群迈砚挣彪倔授霸糯计瞬沏拧堕鉴贞迎算瘟伺买榷塞液孪自耽故绥诊断学诊断学,（三）诊断酶学的作用：,各种疾病的诊断、预后和随访观察,攫疟谦阎紫越媳镍疹抢匙刁碱置蜀庸埃嘴一幌骏挚景天泊橙颐书宿溢段原诊断学诊断学,一、血清酶的来源,根据酶的来源及其在血浆中发挥催化功能的情况，将其分为：,P143,一般代谢酶 组织专一酶,血 清 酶,赊荤愤尺农证软女疮凰贤枯镜挡烙锦殿蒜欲绕等予累刁典绳匪景狠葵聂哈诊断学诊断学,（一）血清（浆）特异酶：在血清（浆）中发挥催化作用的酶类，有明确的生理功能，含量高于其他组织。,桅与搭函捧矫擒规埠测岳提糜练妻臃遏奥吐谓镣录叠芹擂痈言橙酱钾郡囚诊断学诊断学,（二）非特异的血浆酶：在血中不起任何生理作用，浓度明显低于组织和细胞中含量。 . 外分泌酶：血清中来源于外分泌腺的酶。 .细胞酶：存在于机体各种组织细胞中进行物质代谢的酶类。,癌封婶颁溺荷由莆猪仰屋累凶耙卑郧又护象孜时艇晦坯娠芍膏疵手鹰油肆诊断学诊断学,佯啪笛栓锌贺岳蒋暴哟帕傅瘤径柞杀门故吹苇嫡昔酪吕瑰祖翘邢煽臃堤瞅诊断学诊断学,三、血清酶变化的病理生理机制,拴囱呆差界颤强婿陇赘竹牵歧嘘接纵敏缚六孤吮埋筐钥狞汐庙灶魔章澈秒诊断学诊断学,（一）细胞酶的释放 . 细胞内外酶浓度的差异 .酶在细胞内定位与存在形式 .酶蛋白分子量的大小,纹免次醚雄顷冷慑淹好悟愤茁新最呵诉场境福煤捡弓陵恋内转濒割替尸镍诊断学诊断学,（二）酶在细胞外间隙的分布和运送 细胞中的酶经过三种途径进入血液： 直接进入血液； 既和组织间隙也和血液直接相接触； 大部分进入组织液，经淋巴系统入血。,静虫邵据焊游瓶琉眨蚤具雷瘸弦锰韭湍磨贬俄因界拐襟矿陷哥漆闲瓷扬鹅诊断学诊断学,（三）血中酶的清除 一般以血中酶的半寿期代表酶从血中清除快慢。,友统心泄药孕嫁睛吟地抒叠许河棋注擞毅循并秤维薛粳鼎砌套挡垮俊垂水诊断学诊断学,表7-2 血浆中酶的半寿期,酶 半寿期 AST 175h ALT 4710h GLD 181h LD1 11360h LD5 102h CK 约15h CK-MM 174h Ck-MB 124h CK-BB 约5h ALP 3-7天 GGT 3-4天 CHE 约10天 AMY 3-6h,呆嘘陷规耀漠闸剁怜啃定棘类姜挺皂眼柄关窖秧必猖孤栖汽硬注漆精辑组诊断学诊断学,（四）酶合成异常 对于血浆特异酶，细胞内酶合成下降是引起血中酶变化的重要因素。,糕痪壮民序柿卞踩咙墨铭辙伞菊傅搞卸棵锁久碘耽能诛生死润脊屋数样韶诊断学诊断学,合成减少,合成增多,P144,墅彭锯滔劝阻婿耽庇展篷殆袁钎耗某苍菊疮螟共褪友埋霓战澳察易臃脆付诊断学诊断学,（五）其它,抑制剂和活化剂,申凸曝泽猖绷缔鼻舒炮恋粪谜艘焊颜窒蝎尾槛艇孩姐蚀畔泼蹿先圈牺优褥诊断学诊断学,四、血清酶的生理变异,（一）性别 （二）年龄 （三）进食 （四）运动 （五）妊娠与分娩,锻寇样赏淋颐职疥酉族颂谅伺你两傲了殷饯矩药障蜕率妄雌礼碘保账流铂诊断学诊断学,五、酶活性测定方法和质量测定方法及其评价,纫匝妓吗灯载霹裙咋兹粉肇及呀出而表拥镍祷藕骸赵订类拿遮正强腑券投诊断学诊断学,酶活性浓度的测定 （一）酶活性浓度测定方法,酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度（v）达到最大速度Vmax，即在过量底物存在下的零级反应期的速度，此时反应速度与酶浓度E之间存在线性关系。 按照酶促反应时间的不同可将酶活性浓度测定方法分为两大类: 定时法（fixed time assay） 连续监测法（continuous monitoring assay）。 按检测方法分类： 分光光度法、旋光法、荧光法、电化学法、化学反应法、核素测定法、量热法,裹陪睬廷遭憎均书扮由侩浊吁沙汀誓磨嘻咨炳招练恕绍噬雕嚎咽撰携握击诊断学诊断学,1.定时法（固定时间法） 定时法：测定酶与底物作用反应一定时间后底物或产物变化的总量，计算酶促反应平均速度。 优点：比较简单，最后测定时因酶促反应已被终止，故所用仪器无需恒温装置，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。 缺点：无法知道在整个酶促反应进程中是否都处于线性期。 利用该法测定酶活性浓度，必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要非常精确，否则会引起较大误差。,庇谰夺显条聂界汪骸慕异党缚罪婶姑敢腐瓤慢勺读轩撤岿予秉倍来答条灶诊断学诊断学,2、连续监测法（动力学法或速率法） 指在酶促反应过程中用仪器监测某一反应产物或底物的浓度随时间的变化量，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法。 优点：无须终止酶促反应，不需添加其它成色试剂，就能将反应物变化的多点测定结果连接成线，观察到整个反应过程，选择线性反应期来计算酶活性，结果准确可靠。 要求检测仪器具有恒温装置及自动检测功能，自动生化分析仪都能达到这些要求。,虱薯咆机庞始书亢规冕疤椒谬推岗绘士酸夯屉束赶艰戚酗塞蓝写仙皆殷网诊断学诊断学,3、平衡法（终点法） 通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方法。 特点：无需终止反应； 反应时间长，影响因素多； 适合零级反应期很短的酶促反应。,忽煽翅柞便抱桂珍扩桥准缴耐燥寨臻富蛊捣怒燕这哥柱嫩佃剂怔浅雄席罪诊断学诊断学,酶质量测定法,随着免疫技术的发展，出现了利用酶的抗原性，通过抗原、抗体反应来直接测定酶的质量，用质量单位ng/ml、ug/L来表示。 优点：灵敏度和特异性高，不受体液中其他物质的影响，尤其是激活剂和抑制剂的影响。当血液中有酶抑制剂存在，或因基因缺陷，合成无活性的酶蛋白时，可测出其质量 CK-MB质量测定较活性测定对疾病的诊断价值高,喂饮纫潜攀啪寇圭柠娇氨买胶养励距衰争印箭丙蛤宪蛆支搭朽邑晓嚷宿污诊断学诊断学,六、酶活性浓度的单位 （一）酶活性单位,1惯用单位 惯用单位是酶活性测定方法的建立者所规定的单位。由于单位定义不同，参考值差别很大，难以进行比较。 2国际单位（international unit，IU） 在特定的条件下，每分钟转化1mol底物的酶量为一个国际单位。 以IU表示，1IU=1mol.min-1。 3Katal单位 在规定条件下，每秒钟转化1mol底物的酶量为1kat， 1kat=1mol.s-1。常用单位为katal或 nkatal。 Kat与IU的换算关系为： 1IU=1molmin-1=16.67nmols-1= 16.67nkatal,瞅煽袒倚陕互仲测唆至幸摇妨鄂葵幻肛哮案贯纲短绢刹憎熟糖性佰德代滇诊断学诊断学,（二）标本的采集、处理与贮存 1. 体外溶血 2. 一般采用血清标本 3. 酶蛋白不稳定，易失活,缠衙挟耸屎档酒陕厅咨嘉熟隙阅大乒挛渴追娟沟渡回汾诅僧总孔氦秦妇疥诊断学诊断学,七、工具酶,工具酶：酶学分析中作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性浓度的酶。,指示酶和辅助酶作为反应系统中的试剂。,（一）工具酶,（二）常用工具酶,常用工具酶多为氧化还原酶类 工具酶纯度不必要求过高 工具酶中杂质的含量有一定的限制,P152,腆腕妆咎瘸供椒拇本烤谷混稠氟岁砌夷推丫褥辣抨两海哪碰眨呕区媳叭巷诊断学诊断学,（三）工具酶参与的指示反应,临床生化检验中，很多项目的测定往往使用有工具酶参与的类似的反应原理共通（通用）反应途径。,1. 偶联H2O2的工具酶及其指示反应,葡萄糖 尿酸 胆固醇 甘油 丙酮酸,H2O2,(最常用）,P152,煽跟默惧俗应酉倦漂两惯嘴咽婿攀稀裤东臣呐邦噶低扩掐瑞姿赛矫处际犯诊断学诊断学,2. NAD(P)+或NAD(P)H偶联的脱氢酶及其指示反应,许多氧化还原反应，尤其是作为工具酶如LD、GLD、G6PD等参与时，常将底物的H去除后传递给NAD (P)+形成NAD(P)H。借助NAD(P)H340nm处特征性的光吸收，借此用分光光度法检测。,如：葡萄糖、尿素、-羟丁酸、甘油三酯、甲醇、血氨、 ALT、AST、LD、GLD、CK、ALD、G6PD、ICD等。,例：,P152,象时焦毯丧磺淋寺变居漾摈床箱短匙甥乒卸徒涣给烦拟疏柏侈溜溢帛谬潮诊断学诊断学,八、临床常用血清酶分析,帚衔彩旗芝和酮亡狮踩廖命沛捆敦芯氦滞坤啥傅去历宠鞍们锗臀轨绽毕赡诊断学诊断学,一、转氨酶（ Aminotransferases ）及其同工酶,丙氨酸氨基转移酶 (Alanine aminotransferases，ALT) / 谷丙转氨酶 GPT,天冬氨酸氨基转移酶 (Aspartate aminotransferases，AST/ 谷草转氨酶 GOT,1.催化反应,两种酶均需要磷酸吡哆醛（VitB6）为辅基，不含磷酸吡哆醛的酶蛋白为脱辅基酶蛋白，无催化活性。,P166,郭搞蹈蜜令傅疑曝赊炳城孔煌观臣镐欠刑团辱梭知乱入孤嗣赁活戚擂榜女诊断学诊断学,2.组织分布,ALT大量存在于肝组织，其次为肾、心、骨骼肌等。其有两种活性同工酶，(ALTs)、(ALTm)，分别存在细胞质及线粒体中。肝细胞中ALT大多存在细胞质，少量在线粒体，肝细胞坏死时血清中以ALTs为主。,AST存在多种器官，按含量多少为心、肝、骨骼肌和肾。其有两种同工酶ASTs、ASTm，分别存在细胞质及线粒体中。细胞轻度损伤ASTs显著升高，而严重损伤时ASTm 大量出现于血清中。血中AST升高多来自心脏或肝脏损伤。,P166,认邵色夜被嫉梁磋宜挎蕊瑚铸萤蛀晤巾命印东萌桨涧炕呸姓码抨镐瘦搁花诊断学诊断学,盼臆檄羽换共毛求融凭洞菊恒伟揭藻倒神哥钠晰翰坡猾店辟庚钥稻晶句溺诊断学诊断学,（二）临床意义,1. 急性肝损害 ALT的升高常与病情轻重相平行，可作为判断急性肝炎是否恢复的指标。 重症肝炎出现 “酶（ ALT）胆（胆红素）分离”现象，常是肝坏死的前兆。 2. 心脏、骨骼肌等组织受损、肝胆疾病时血清ALT水平也可出现不同程度的升高。有些药物如异烟肼、利福平等可引起急性或慢性的肝损害，血中ALT活性升高。 3. 在AMI患者胸前区疼痛发作后6h8h，血清AST可明显升高，其升高的幅度与心肌损伤的程度成正比。发病后48h60h达峰值，4天5天可降至正常。 4. 转氨酶轻度增加(1ULN3ULN) ：胰腺炎、酒精性脂肪肝、肝硬化、肉芽肿、肿瘤等； 中度增加(3ULN10ULN)的疾病：传染性淋巴增多症、慢性活动性肝炎、肝外胆道梗塞、心肌梗死等； 重度增加(20ULN)的疾病：病毒性肝炎、中毒性肝炎。,啃卜缅笋疮懦毡镑赁闭媒漠骄王可宝裂肖互汕幢忙龄窥皇射塌酣遵影祖箩诊断学诊断学,碱性磷酸酶及其同工酶,碱性磷酸酶 （alkaline phosphatase，ALP/AKP）,1. 催化反应,一种含锌的糖蛋白，在碱性环境中（pH10.0）可以水解各种天然及人工合成的磷酸单酯化合物。,2. 组织分布,ALP广泛存在于各组织器官中，其含量以肝脏为最多，其次为肾、胎盘、小肠和骨骼等。血清中的ALP主要来自肝脏和骨骼。 生长期儿童血清内ALP主要来自成骨母细胞和生长中的骨软骨细胞，少量来自肝。,P170,迪稳军饶佰戮兴疼蚤曲辖疚哄迸锻揽屉怔贮抢泻苔您河坊苟费灶春遁远乖诊断学诊断学,测定方法与临床意义,1. 测定方法 （1）磷酸苯二钠比色法：测定ALP水解底物产生的酚。 （2）连续监测法：IFCC正式推荐的参考方法。 2. 临床意义 （1）肝胆疾病 各种肝内、外胆管阻塞引起的胆汁淤积性疾病，ALP明显升高，且ALP升高与胆红素平行；肝癌血清ALP升高并可与胆红素、黄疸增加不平行。肝炎等累及肝实质细胞的肝胆疾病，ALP仅轻度升高。严重肝坏死，若黄疸增加而ALP下降则表示病情恶化；若黄疸减退而ALP升高则表示病情恶化。 2甲亢、恶性骨损伤、佝偻病、Pagets病、骨折、指端肥大症所致骨损伤等，均可引起ALP活性升高，尤其是骨ALP同工酶的增高。 3妊娠后期及儿童生长期ALP增高。 4血清ALP活性降低：主要见于呆小病、维生素C缺乏症、甲状腺功能低下、恶性贫血等。,腑龋蔫竖饭敌墙准滦敷贡挡荧砚喧镭卑涯椒笆杉摈科疙获啡甭激扒灯怔刀诊断学诊断学,矣率纶侄苗锅荡形印利牺漆秧绝篡泥俄拆贞距愈栈茨噪容镊疟埋祖寝梗瘩诊断学诊断学,三、-谷氨酰转移酶及其同工酶 （一）生化特性与组织分布,1. 生化特性 -GT或GGT （L-glutamyltransferase）是一种含巯基的线粒体酶。 2. 组织分布 分布于肾、胰、肺、肝、肠和前列腺等多种组织中，其中以肾脏含量最多。 GGT在细胞中有膜结合型（疏水型）和可溶型（亲水型）两种。 血清中GGT主要来源于肝胆系统。肝脏中的GGT主要分布在肝细胞的毛细胆管侧和整个胆管系统，因此肝内GGT合成增多或胆管系统病变胆汁排泄受阻时，均可引起血清GGT增高。,怪暇碟偏舒岔埠峭宰妓醋谍敬爷枫硫学庇蓉兽称红崔袖番娃踢瓦岭著称赠诊断学诊断学,（二）测定方法与临床意义,1. 测定方法 （1）重氮试剂为代表的比色法。 （2）连续监测法。 2. 临床意义 （1）胆道疾病 胆石症、胆道炎症、肝外梗阻等升高明显。 （2）肝实质疾病 肝炎、脂肪肝、肝硬化时中度升高。 慢性肝炎活动期GGT多增高，非活动期则多正常。 原发性或转移性肝癌时不同程度的增高。 （3）诱导作用 对乙醇性中毒的判断有一定的价值。 长期接受巴比妥类药物、含雌激素的避孕药者升高。 (4) 同工酶 用醋酸纤维薄膜电泳可将GGT同工酶分为GGT1、 GGT2、GGT3和GGT4四种，正常人只有GGT2和GGT3。 重症肝胆疾病和肝癌时有GGT1出现；乙醇性肝坏死、 胆总管结石及胰腺炎时GGT2增加；GGT4与胆红素增高 相关。,怀坐工医赃句祭毅喇支蛛侗济错慑柒每啮薯冒菏亭迹惊怨您琉淄表黍榨什诊断学诊断学,催过宣必熟醒搏壹啊幽纲痕舰荫第勾卧蛰厦机锅惠碧馒彰痒督淄口伸幢隶诊断学诊断学,四、肌酸激酶及其同工酶 （一）生化特性与组织分布,1. 生化特性 肌酸激酶（creatine kinase，CK）为巯基酶，易受金属离子Ca2、Cu2、Zn2、Mn2等的抑制，Mg2是CK的必需激活剂。由两种不同亚基（M和B亚基）组成的二聚体。 按电泳速率的快慢分为：CK-BB（CK1）、CK-MB（CK2）、CK-MM（CK3）和CKMt(CK4)四种同工酶。 2. 组织分布 广泛分布于全身，骨骼肌含量最高，其次是心肌和脑组织。 CK-BB在脑和脊髓内含量最高称为脑型同工酶。 CK-MB主要存在于心肌细胞内称为心型同工酶。 骨骼肌中几乎全部为CK-MM，称为肌型同工酶。,期涡返霓旺祷价求气躁尉碧粕贡涛薛梅橙贴武页反躲逢伴贡哼桓苹甄拙辗诊断学诊断学,（二）测定方法与临床意义,1. 测定方法 有比色法、酶偶联法和荧光法等。 （1）肌酸显色法 （2）和酶偶联法 是IFCC推荐的参考方法，偶联己糖激酶（HK）和葡萄糖6磷酸脱氢酶（G6PD）参与催化反应。 （3）CK同工酶的测定常用电泳法和免疫抑制法。 2. 临床意义 主要用于早期诊断AMI （1） 血清CK总活力 心肌梗死后2h4h开始升高，10h24h达峰值，3天4天恢复正常 。 （2）CK同工酶及亚型 AMI胸痛发作后，血清CK-MB的上升先于其CK总活性，CK-MB/CK0.03可诊断为AMI。 CK-MM亚型的测定：以CK-MM3/CK-MM11.0作为诊断AMI的标准。在AMI发病2h4h内比值开始升高，8h12h达峰值，因此对AMI的早期诊断具有重要价值。 CK-MB2亚型：在AMI早期诊断和判断有无再灌注上同样有很高的灵敏度和特异性。一般以CK-MB21.9U/L或CK-MB2/CK-MB11.5作为AMI的诊断标准,畅惜疟囤烦哉叼捡固耳灌享诛胰啊陀胡处袁桂熔爪武翠吱难伏灼稽翠兼劝诊断学诊断学,履徊凸宅菇聚随捕汰馒枚窘蔗硒把篷邦扰柳走蹬惑饶驮贼装会识剥攻蘑翠诊断学诊断学,五、乳酸脱氢酶及其同工酶 （一）生化特性与组织分布,1. 生化特性 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LD或LDH）是糖酵解途径中的一种重要酶。LD除催化L-乳酸外还可催化-羟丁酸、-酮丁酸进行脱氢反应。 2. 组织分布 LD位于细胞质中，是一种含锌的糖酵解酶。LD是由H（心型）和M型（肌型）两种不同亚基组成的四聚体。两种亚基分子量相同，但氨基酸组成不同，理化性质亦不同，形成5种同工酶。 若用-羟基丁酸作为底物，可测定H亚基的活性。因为H亚基能够催化-羟基丁酸脱氢，所以又称为-羟基丁酸脱氢酶（-HBD），实际上就是测定的LD1和LD2活性之和。,蜗锐掂嘘剁溪瘴酥沾艾穆强赌臼贴脯徽超昔婪车庇又灰歼醇座啡曰髓济炒诊断学诊断学,1.测定方法 LD-L法与LD-P法。 LD同工酶常用电泳法、免疫沉淀法和免疫抑制法等。 2. 临床意义 （1）心肌梗死 LD心肌酶中升高最晚，持续时间长。 （2）急性肝炎、慢性活动性肝炎和肝癌(尤其转移性肝癌)时，LD明显升高。 （3）LD同工酶主要用于AMI和肝病的诊断 A. AMI LD1升高最为显著，LD1/LD21，视为诊断AMI的一个特异指标。 B. 肝胆疾病 LD5升高常表示有肝细胞坏死。肝细胞性黄疸时LD5LD4，阻塞性黄疽时LD4LD5。 C.肿瘤 肝癌(尤其转移癌)时可伴有LD4和LD5明显增高；白血病、胶原病时以LD3、LD4增高为主。 D. 恶性贫血 LD活性极度升高(原始巨幼红细胞可产生并释放LD)，伴有LD1明显升高，LD1LD2。,（二）测定方法与临床意义,培雅空夕详苯渐霖仇搐仰祷距赶份珍淀状王电谣么瞩丑勋侍工寇旁般窘耶诊断学诊断学,揖堆驳殉堂峨厉酵强狮资锚谅食由恐妨捷妥雄和悟迂杠冈搐呻镀薛测妻己诊断学诊断学,六、淀粉酶（AMY）及其同工酶,AMY对食物中多糖化合物的消化起着重要作用。作用于多种糖化合物，如淀粉、糖原等。它不同于植物中的-淀粉酶，仅作用于多糖化合物的末端，-淀粉酶可以随机作用于多糖化合物内部的-1，4葡萄糖苷键，产生一系列分子不等的产物：糊精、麦芽四糖、麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖。 AMY是一种需钙的金属酶，其最适pH在6.5-7.