免疫细胞的分离与功能测定.ppt

第一节免疫细胞的分离 一 外周血单个核细胞的分离,原理: 密度梯度离心， 利用密度为1.0770.001g/L 淋巴细胞分层液（聚蔗糖-泛影葡胺）,主要步骤 1 无菌采集静脉血，抗凝（每1ml全血加0.1ml 125250U /ml 肝素溶液） 2 用等体积Hanks平衡盐溶液(HBSS)或pH7.27.4 PBS 稀释 3 按每10ml稀释血用35ml淋巴细胞分层液的比例先将淋巴细胞分层液加入离心管中，再小心沿管壁缓慢加入稀释血，注意切勿使血液混入分层液 4 2000r/min 水平离心30min， 5 吸取分层液与血浆交界部位的单个核细胞，用5倍体积的HBSS或RPMI-1640洗涤2次依次以2000 r/min，1500 r/min离心10min 6 用完全RPMI-1640定容，计数。一般每ml健康成人血可分离出11062106单个核细胞 7 台盼蓝染色，检查细胞活性，活细胞应95。,注意事项,1 严格无菌操作 2 操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀 3 淋巴细胞分层液应4避光保存，取出后待温度升至室温使用 4 如须保存血浆作他用，则不能稀释血液 5 离心最适温度1820 6 分离组织中的单个核细胞也可采用上法,二 淋巴细胞的纯化,红细胞的去除 1 低渗裂解法 1ml蒸溜水加入沉淀的PBMC中，轻摇（1min） 立即加入1.8NaCl, 洗涤 2 氯化铵处理法 沉淀的PBMC中加入1ml 0.83氯化铵溶液，轻摇2 min，洗涤,血小板的去除 1 .PBMC经洗涤23次可去除大部分血小板 2 .胎牛血清(FCS)梯度离心 1ml PBMC悬液（11072107/ml）用3ml FCS 800r/min 水平离心15min，1820,单核细胞的去除,1 .粘附去除法,原理 单核细胞可粘附在玻璃或塑料表面 PBMC用完全RPMI-1640调整浓度至2106/ml 将50ml细胞悬液移入150cm2培养瓶，37 5CO2 95湿度培养1h 收集非粘附细胞，再用预温至37的RPMI-1640 ,轻轻荡洗培养瓶并收集荡洗液 1300r/min 离心10 min，1820 弃上清，用510ml完全RPMI-1640悬浮细胞计数，用台盼蓝染色检查细胞活性,2. L-亮氨酸甲酯去除法 溶酶体酶L-亮氨酸甲酯 L-亮氨酸-L-亮氨酸甲酯 此法也可清楚NK细胞和细胞毒性T细胞 本法只适用于分离新鲜细胞,用PBS调整细胞浓度至31065106/ml，用无血清RPMI-1640配制10mmol/L的L-亮氨酸甲酯溶液（临用时配），两液按11比例混合，室温40min 1300r/min 离心10 min，用HBSS或PBS洗涤沉淀共3次 用完全RPMI-1640悬浮细胞，用无菌尼龙网过滤，离心并计数，调整细胞至所需浓度,3. 羰基铁吞噬离心法,在抗凝血中加入一定量羰基铁粉，37搅拌15 min，然后用淋巴细胞分层液离心分离 亦可先分离PBMC，再加羰基铁粉分离去除单核细胞 粘附法去除单核细胞后，大约95为淋巴细胞，活性95 L-亮氨酸甲酯法，99为淋巴细胞，活性95,三 外周血淋巴细胞选择性分离, T细胞的分离 1 .尼龙棉柱法 原理 B细胞易粘附于尼龙棉纤维，而T细胞则否,尼龙棉（聚酰胺纤维）预处理 尼龙棉（聚酰胺纤维）50mg在0.2mol/L HCl浸泡过夜，用大量蒸溜水漂洗，晾干。 尼龙棉柱制备 塑料软管 长1216cm 内经56mm 壁厚0.2 mm高6cm的尼龙棉柱可有效地滤过2010630106个细胞.此法分离的T细胞纯度可达90以上,2 .花环形成分离法 原理 T细胞表面有绵羊红细胞受体，可与绵羊红细 胞结合形成花环. 绵羊红细胞用2-氨基乙基异硫脲溴化物（AET）或神经氨酸酶（NM）可提高花环形成的效果和稳定性,1ml PBMC悬液(1107/ml)、2ml NCS和 1ml 4AET-SRBC悬液混匀，37水浴10 min 800r/min 4离心5 min，冰浴1h 或 800r/min 室温离心10 min，42h 置淋巴细胞分层液（35ml分层液可分离10mlPBMC/NCS/AET-SRBC混合液） 1300r/min 离心25 min，1820 或 2000r/min 离心35 min，4 位于界面的是非花环形成细胞，沉淀的是花环形成细胞,1ml PBMC悬液(1107/ml)、2ml NCS和 2ml 2NM-SRBC悬液混匀，37水浴10 min 以下步骤同 经1次花环形成试验所得到的花环形成细胞中，T细胞95，B细胞1，单核细胞约为2。经2次花环形成试验后，非花环形成细胞中T细胞2 用此法时，因SRBC与受体结合可激活某些T细胞，导致功能增强, T细胞亚群的分离 1. 间接免疫吸附分离法 原理 T细胞 + 抗某种T细胞分化抗原的抗体 加入包被有羊抗鼠Ig的平皿,2 .抗体/补体介导的细胞毒作用分离法 原理 是一种负性分离法 T细胞 + 抗某种需去除T细胞分化抗原的抗体+补体该亚群T细胞裂解 如 T细胞 + 抗CD4抗体 + 补体CD4+细胞裂解 T细胞 + 抗CD8抗体 + 补体CD8+细胞裂解,3.免疫磁性微珠分离法 原理 羊抗鼠Ig + 磁性微珠免疫磁性微珠 T细胞 + 抗某种亚群分化抗原的抗体 加免疫磁性微珠 在外加磁场作用下，该亚群T细胞连同免疫磁性微珠一起沉降,如 T细胞 + 抗CD4抗体 加免疫磁性微珠 在外加磁场作用下，CD4+T细胞连同免疫磁性微珠一起沉降，CD8+T细胞则留在悬液中 优点 细胞纯度高，产量大，操作简单, B细胞的分离 1 .负性B细胞分离法 用密度梯度离心法分离PBMC 用L-亮氨酸甲酯法去除单核细胞、NK细胞、细胞毒性T细胞 用花环形成法去除T细胞 用此法分离B细胞，240ml 全血中可得11072107个B细胞，纯度90，23的单核细胞，1的其他细胞,2 .直接免疫吸附法 兔抗人Ig包被平皿 淋巴细胞悬液 洗去未吸附细胞，收集吸附细胞,3.间接免疫吸附法 淋巴细胞悬液 + 抗CD19、抗CD20抗体 羊抗鼠Ig包被的平皿 洗去未吸附细胞，收集吸附细胞 4.免疫磁性微珠分离法, NK细胞的分离 1.负性NK细胞分离法 用密度梯度离心法分离PBMC 用粘附法去除单核细胞 用尼龙棉柱法去除B细胞 用花环形成法去除T细胞 2 .免疫磁性微珠分离法，抗CD16抗体,四 淋巴细胞亚群的检测, 免疫荧光技术 直接法 FITC-抗CD4抗体 FITC-抗CD8抗体 间接法 FITC-羊抗鼠Ig 抗CD4抗体 抗CD8抗体, 微量细胞毒试验 PBMC + 抗某亚群T细胞分化抗原的抗体+补体 加染料，该某亚群T细胞着色 如 T细胞 +抗CD4抗体+补体 加伊红染料，呈红色的为CD4+细胞,花环技术 1葡萄球菌花环法 原理 SPA可与IgGFc段结合 直接SPA菌花环法 SPA菌-抗CD3、SPA菌-抗CD4、SPA菌-抗CD8 间接SPA菌花环法 SPA菌-兔抗鼠Ig（IgG类） 抗CD3、抗CD4、抗CD8,2 红细胞花环法 原理 将SRBC与mAb或兔抗鼠IgG偶联 直接红细胞花环法 SRBC-抗CD3、SRBC-抗CD4、SRBC-抗CD8分别与去除粘附细胞的PBMC作用，染色后镜检200个淋巴细胞，计算花环形成细胞百分率,间接红细胞花环法 抗CD3、抗CD4、抗CD8分别与去除粘附细胞的PBMC作用，加入SRBC-兔抗鼠IgG偶联物作用，染色后镜检200个淋巴细胞，计算花环形成细胞百分率,五 淋巴细胞功能测定, 淋巴细胞增殖试验 非特异性刺激物 PHA、ConA、PWM、SPA、LPS，胃蛋白酶、胰蛋白酶等蛋白质，抗CD2、抗CD3、抗IgM等细胞表面标志的抗体，及某些细胞因子 特异性刺激物 特异性抗原,1 .丝裂原刺激的淋巴细胞增殖试验 丝裂原淋巴细胞淋巴母细胞 3H-TdR掺入试验 SI试验组cpm/对照组cpm, 形态学方法 结果以淋巴细胞转化率表示 MTT比色法 琥珀酸脱氢酶MTT甲月赞+盐酸异丙醇或二甲基亚砜溶解后测OD值 SI试验组OD均值/对照组OD均值,2 .混合淋巴细胞培养 单向混合淋巴细胞培养 双向混合淋巴细胞培养 可分3H-TdR掺入法、形态学方法及MTT比色法,3 .自身混合淋巴细胞反应 4 .淋巴因子诱导的细胞增殖反应 如 IL-4B细胞，IL-2T细胞,5 .影响细胞增殖反应的因素 细胞应保持高活性， 可溶性抗原刺激淋巴细胞增殖时，常需一定数量的抗原呈递细胞 不同的刺激原有不同的刺激剂量 严格无菌操作,六 NK细胞活性测定,靶细胞 人NK细胞 K562细胞（靶细胞） 鼠NK细胞 YAC-1细胞（靶细胞）, 形态学方法 原理 靶细胞被NK细胞杀伤后细胞膜通透性改变而使台盼蓝染料透入细胞，细胞呈蓝色，无折光性,靶细胞 K562细胞或YAC-1细胞用完全RPMI-1640 调整细胞浓度为2105/ml 效应细胞 人PBMC或小鼠脾细胞用含15NCS的RPMI-1640调整细胞浓度为1107/ml 对照孔 100ul靶细胞100ul完全RPMI-1640 实验孔 100ul靶细胞100ul效应细胞 效/靶细胞比例（E/T ）为501 各设3个平行空，37 5CO2温箱培养过夜 每孔各取30ul细胞悬液，加30ul 0.5台盼蓝室 温染色5min,于白细胞计数板中每孔各计数100个细胞，记录死 细胞及活细胞数，求出各组NK细胞活性的均值 实验组靶细胞死亡数对照组靶细胞死亡数 NK细胞活性% 100 100, 同位素释放法 1 . 51Cr释放试验 2. 125I-UdR释放试验 3. 全血NK细胞活性同位素检测法,七 单核-巨噬细胞的分离与功能测定,人单核细胞的分离方法 单核细胞占外周血白细胞的35,1 Peroll离心沉淀法 Peroll（聚乙烯吡咯酮包被的硅胶混悬液） Peroll连续密度梯度液配制 Peroll 7ml 和2PBS 6ml1500r/min 离心40min 操作步骤 PBMC加到35mlNCS上 800r/min，离心15 min（1820） 沉淀细胞用含10NCS的PBS配制成21075107/ml悬液 加到Peroll连续密度梯度液，4 2400 r/min 离心20 min 出现4个细胞层，吸取第二层细胞（单核细胞占7090），洗涤后计数，配制成所需浓度,2 粘附法 用EDTA抗凝血制备PBMC，用DEME液将PBMC配制成2106/ml悬液，加入培养瓶（75cm2瓶加10 ml细胞悬液） 37 5CO2 温箱 1h 用DEME液洗涤2次，洗去非粘附细胞 用细胞刮片刮下细胞，或加入0.2EDTA/PBS， 10min 后收集细胞， 1500 r/min 离心10 min, 配制细胞悬液，计数并调整至所需浓度,3 Colotta法 用PBS5倍稀释的肝素抗凝血20ml，加在20ml淋巴细胞分层液上 2000 r/min 离心20 min 室温,吸取PBMC用PBS洗涤两次，500 r/min 离心10 min 弃上清，沉淀中加入5ml含10NCS，25mmol/L HEPES的RPMI-1640培养液 加在5ml 46Percoll液中 2200 r/min 离