分子医学技能02电泳.ppt

实验二 PCR检测乙肝病毒 & PCR-SSCP检测 人HLA-DRB基因多态性,乙肝病毒PCR实验操作,HLA基因PCR实验操作,血清样本处理 （模板的制备）,PCR检测乙肝病毒实验,PCR反应上机,口腔细胞DNA电泳 （模板的检测）,HLA基因PCR实验操作,PCR反应上机,琼脂糖凝胶板的制备 （封板、梳子位置与高度、凝固后拔梳） 倒缓冲液 （样品中加入1/5体积的上样buffer） 加样，电泳（方向、电压、时间） 染色与检测 （EB浸泡10 min，紫外下检测）,电泳实验的步骤及注意事项,电泳基本原理及相关知识,DNA琼脂糖凝胶电泳, 电泳的概念,带电粒子（胶体颗粒、离子等）在电场的作用下在特定的介质中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。 广泛应用于生物大分子的分离和鉴定, 实验室中常用到的电泳方法 （以介质分类）, 纸电泳 醋酸纤维膜电泳 凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳, 电泳的基本原理,利用物质的差异特性来分离物质,电荷差异 电荷性质 电荷数量,分子差异 分子大小 分子形状, 电泳的影响因素, 带电粒子的性质 电场强度 溶液的pH, 溶液的离子强度 电渗现象 环境因素,在pH8.0（碱性）的环境中DNA的磷酸基团解离，使DNA在该环境中带上负电荷，在电场中向正极方向泳动 因为各种DNA分子的电荷数、构象、分子量不同，它们在通过凝胶立体网络是所受的动力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，达到分离的目的 DNA显色剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合，在波长为254nm365nm的紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光,DNA琼脂糖基本原理,/hbooks/genetics/biotech/gels/agardna.html,实验结果的分析,PCR基本原理及相关知识,The Polymerase Chain Reaction,Sometimes called “molecular photocopying,“ the polymerase chain reaction (PCR) is a fast and inexpensive technique used to amplify, or make many copies of, small segments of DNA. the technology empowers scientists to undergo a number of processes, from DNA fingerprinting to mapping the human genome. In 1983, Kary Mullis invented the PCR. The process is an invaluable tool to todays molecular biologists and biotechnology corporations.,Kary B. Mullis,As he wrote later in Scientific American: “Beginning with a single molecule of the genetic material DNA, the PCR can generate 100 billion similar molecules in an afternoon. The reaction is easy to execute. It requires no more than a test tube, a few simple reagents and a source of heat.“,(1944 - ),The Nobel Prize in Chemistry 1993 for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method（1/2 of the prize ）,3 step and 30 cycles for PCR,Step 1. Denaturation,Step 2. Anneal,Step 3. Extend,30 cycles,create over a billion copies of the sequence,Step 1. Denaturation,The reaction is first heated to denature (separate) the sides of the double- stranded DNA,Temperature: 95 degrees Celsius,Step 2. Anneal,then cooled to allow the primers to find and bind to their complementary sequences on the separated strands.,Temperature: 55 degrees Celsius,Step 3. Extend,the polymerase to extend the primers into new complementary strands.,Temperature: 75 degrees Celsius,Repeat the Cycles,Repeated heating and cooling cycles multiply the target DNA exponentially, since each new double strand separates to become two templates for further synthesis.,This process can then be repeated up to 30 times to create over a billion copies of the sequence.,What is in the PCR Mix?,Template (dsDNA) Primers (TWO short DNA: 15-30 nucleotides in length. Longer primers provide higher specificity ) P22 Taq polymerase （ Thermus aquaticus ） dNTP Mix (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) Reaction Buffer (including Mg2+),10PCR反应buffer： 已作成商品化的产品，它包括： 250500mmol/L KCl； 100500mmol/LTris-HAC（pH8.4）；1520mmol/L MgCl2（对Taq酶的活性影响很大，一般浓度为1.52.0mmol/L，实际应用时根据反应体系的情况进行调整）； 0.1%明胶或牛血清白蛋白, 影响PCR的主要因素 PCR反应体系的各个组分 PCR循环的温度（预变性、变性、退火、延伸） PCR循环的次数和平台效应 操作环境,一般PCR实验设计：,样品反应 不同的退火温度梯度 不同的Mg 2浓度 不同的模板浓度 阴性对照反应 阳性对照反应,相对DNA克隆而言，这种方法的特点：操作简便、时间短、特异性高、灵敏度高、实用性强； 广泛的应用于医学诊断、分子生物学、分子克隆、基因诊断、法医学、考古学等各个领域。,二、 PCR试剂盒检测HBV DNA 实验操作及注意事项,HBV检测试剂盒介绍,构成： DNA提取液 检测反应管（PCR反应体系，上样buffer，石蜡油） 阳性模板 设计： 反应管中有针对HBV的特异性引物，若出现与阳性对照相同的结果，则说明待测样品中含有HBV,PCR实验具体操作,1、待测样本的制备：提取血清中DNA,待测血清40l + 40l DNA 提取液，混匀 沸水浴10min，10000rpm5min 上清,样品模板,TE 40l + 40l DNA 提取液，混匀 沸水浴10min，10000rpm5min 上清,空白模板,待测样品的制备,空白对照的制备,实验分组（每2人做一管PCR反应） 分10个平行的实验小组，每组包括：,阳性反应1个,空白对照1个,样品检测反应n个,阳性模板2l,空白模板2l,样品模板2l,混匀， 6000rpm5s，上PCR仪,933min 预变性 94，30s 55，30s 72，30s 72保温5min,30个循环,PCR反应程序：,三、PCR-SSCP检测 人HLA-DRB 基因多态性 PCR实验操作及注意事项,实验目的及预期结果,目的： 检测来自不同样本的基因多样性 检测技术：HLA-DR基因的PCR-SSCP 预期结