第十章_第一节_转基因动物

基因工程动物,第一节 实验动物的胚胎工程,胚胎工程是指运用人工方法对动物的胚胎及配子进行操作和改造，是改良动物品种品系，保存动物种子资源及转基因动物制备的重要手段。,主要包括四大类技术体系：胚胎移植相关技术；动物克隆技术；胚胎干细胞技术；转基因动物技术等。,一、胚胎移植相关技术,（一）胚胎移植 胚胎移植（embryo transfer）是一项难度较高的显微操作过程，是胚胎工程的重要基础。 根据胚胎发育阶段不同，胚胎移植可分为输卵管移植和子宫移植。原核胚胎到桑葚胚期的胚胎进行输卵管移植，囊胚期后的胚胎进行子宫移植。,按照操作方法,胚胎移植又可分为手术法和非手术法。小型实验动物常采用手术法，大动物常采用非手术法。,（二）排卵控制 排卵控制是通过对雌性动物采用外源激素处理，改变其性周期和排卵数来实现的。 目前常用到的激素有促卵泡激素（FSH），促黄体激素（LH），孕马血清促性腺激素（PMSG），人绒毛膜促性腺激素（HCG）。,其中FSH的生物功能是刺激卵巢中卵泡的成熟并分泌雌激素；LH也称促间质细胞激素（ICSH），其生物功能是激发排卵，促使黄体从萎缩破裂的卵泡中形成并分泌雌激素和孕激素；PMSG可以促进雌性动物卵泡的发育、排卵及黄体的形成；HCG也可促进卵泡发育和排卵。实际应用中，常把FSH和LH，HCG和PMSG配合使用，可取得较好效果。,(三) 体外受精和显微受精 体外受精（in vitro fertilization，IVF）是成熟卵细胞与经过处理的精子在体外结合而发育成合子的过程。体外受精的合子经过体外或者异种动物体内培养，再移到同种动物体内妊娠产子，由此得到的动物称为试管动物。,体外受精所用的精子在大、中型动物可采用人工按摩或电刺激法获得,小型动物需用手术法从附睾获得。卵子来源有两种方法,小型动物系采用超数排卵处理,从输卵管采集体内成熟卵子;或采用手术方法,从卵巢上采集未成熟卵子进行体外成熟。牛、羊等大、中型动物可进行活体采卵或从屠宰后动物的卵巢获得。,制约体外受精技术发展的主要因素有：在体外培养的卵母细胞的细胞质是否真正成熟不仅影响到受精，而且对卵裂及胚胎发育甚至着床和出生后也有较大影响，应在培养条件上进行研究；多精子受精难以控制，导致正常发育率低，可通过调整精子浓度或受精时间来控制；体外受精的胚胎在体外发育至一定阶段时会发生退行性变化，即发育阻滞(block)。,显微受精（microfertilization）技术是通过对动物配子进行显微操作以使其受精的技术。它是在体外受精的基础上，随着显微操作技术和设备的不断发展和完善而出现的。这一技术目前有透明带下注射、透明带钻孔、透明带部分切口和卵细胞质内注射等方法。,（四）胚胎培养 胚胎培养（embryo culture）是指在人工创造的类似于体内条件的环境中，对获取的早期胚胎进行体外培养，以便观察其发育或人工干预某一发育过程的技术。,目前胚胎培养一般有两种方法。一种是共培养系统，这种系统首先要求在培养皿上贴壁培养输卵管上皮细胞、颗粒细胞等，然后将受精卵和贴壁培养的上皮细胞一起培养，直至生产出可用胚胎。另一种是简单化学限定培养法。相对而言，简单化学限定培养法使用方便、培养液配制简单，而且成分明确便于研究特定物质对胚胎发育影响的特点，因此在早期胚胎体外培养中得到广泛使用。,（五）胚胎保存 胚胎保存（embryo preservation）是指应用超低温冷冻技术将胚胎保存起来而不丧失活力。1971年，whittingham首次报道冷冻小鼠胚胎获得成功。随后，对大鼠、兔胚胎的冷冻保存也取得了成功。到目前为止，已有十多种哺乳动物胚胎冷冻获得成功。超低温长期保存胚胎对生命科学的发展具有重要实际意义。,冷冻保存实验动物胚胎的方法有多种，主要有常规冷冻法、玻璃化冷冻法等。一般包括抗冻保护剂的添加、植冰和降温、胚胎解冻、抗冻保护剂的去除等步骤。,常规冷冻法是将经冷冻保护剂处理的胚胎以较慢速度（1/分钟）降温至-7，平衡10分钟后，在此温度诱发结晶，再平衡10分钟，以0.10.3/分钟的速度降温至-36以下，投入液氮中保存。按这种方法冻存的胚胎解冻时需要慢速升温。脱去冷冻保护剂的浓度方向与冷冻时相反，按相同浓度梯度，从高浓度向低浓度进行。 常规冷冻法的优点是细胞脱水完全，细胞内不易形成冰晶；缺点是很费时，冷冻保护剂处理胚胎的时间过长，同时设备昂贵，花费高。,玻璃化冷冻法（vitrification）是Rall和Fahy于1985年建立的一种快速，简捷有效的超低温冷冻方法。这种方法采用的高浓度冷冻保护剂组成的玻璃化液(渗透和非渗透性保护剂相结合)，在低温下变粘稠，不发生结晶即可固化，此固体物质能保持分子和离子正常的液态分布，是一种超快速冷冻模式。,玻璃化液中主要的冷冻保护剂是二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）和乙二醇（ethylene glycol,EG）。将胚胎在这种玻璃化液中处理以后，可直接投入液氮中保存。玻璃化冷冻保存的胚胎，解冻时需要快速复温。 玻璃化冷冻法简化了冷冻过程，冻存效果好，而且这种方法不需要冷冻仪器，设备简单，费用少。,二、动物克隆技术 三、胚胎干细胞技术 干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，其发育受多种内在机制和微环境因素的影响。根据其发育阶段，干细胞分为胚胎干细胞（embryonic stem cell）和成体干细胞（Adult Stem Cell）。,胚胎干细胞是一种存在于早期胚胎的具有发育全能性的细胞，它可以自我更新并分化为体内所有类型的组织细胞，包括生殖细胞。胚胎干细胞的分化和增殖是动物发育的基础。目前，胚胎干细胞的来源主要有两个，胚胎内细胞团细胞（inner cell mass）和胚胎原始生殖嵴细胞。,第二节 转基因动物,转基因动物是当今生物医学研究的一个热点，也是实验动物科学史上又一突破性进展。转基因技术是本世纪80年代初发展起来的，是在动物整体水平研究目的基因的生物技术，具有“分子及细胞水平操作，组织及动物整体水平表达”的特点，是常规分子生物学的拓展和延伸。它克服了物种之间的生殖隔离状态，实现了动物种与种之间的遗传物质交换和重组，不仅为遗传物质的研究提供了新的手段，也扩大了生命科学研究的视野。,转基因动物是动物基因工程在医学生物学研究中的突出成果。 近十年来，为分子遗传学、发育生物学、医学遗传学、肿瘤研究及优良经济动物的开发研究等多方面做出了很大的贡献。,Gordon 等人首次成功地将含有HSV 和SV40DNA 片段的重组质粒DNA 以显微注射法导入小鼠受精卵的雄原核内，得到了带有这种外源DNA 顺序的TGM 。 1982 年Palmiter 等运用此法得到的所谓 “超级巨鼠”,曾引起整个生物学界的轰动。,到目前为止，人类已获得转基因鱼、鼠、羊、猪、兔、牛等大小动物。 从转基因动物所获得的资料几乎涉及医学遗传学、肿瘤学、免疫学等的基因研究，还涉及生物药物的研究，基因治疗的开发研究等。,转基因动物研究在我国开展得并不算太迟，我国1984年就有报道，与世界上第一批转基因动物的诞生仅两年之差。我国也是从转基因小鼠做起，主要是建立疾病的转基因小鼠模型和进行一些基础研究。选用最多的动物是小鼠、大鼠、兔等。疾病模型的种类主要有传染病、遗传病、和肿瘤三大类。迄今真正获得成功并通过鉴定的只有乙肝小鼠模型。在目的基因的选择上，除了选用建立动物疾病模型的基因外，使用最多的是生长激素基因。在育种方面，多是通过转入生长素基因来提高畜禽生长速度。在转基因鱼研究方面我国处于领先水平。利用转基因动物技术还可能生产出适于人类器官移植所需的器官。我国已有学者开始这一领域的探索。,一、转基因动物的概念 转基因动物(transgenic animal)是指染色体基因组中整合有外源基因并能遗传给后代的一类动物。 整合到动物染色体基因组的基因称为转基因。,只有部分组织细胞的基因组中整合有外源基因的动物称为嵌合体动物(chimera animal)。 逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法制备的 动物第一代为嵌合体动物。,转基因动物与嵌合体动物的区别: 相同点：它们染色体基因组内都整合有外源基因。 不同点：1.转基因动物所有组织细胞基因组中均整合有外源基因，嵌合体只是部分组织细胞有。 2.转基因动物能将外源基因遗传给子代，嵌合体只有当外源基因整合入生殖细胞时才能遗传。 3.外源基因的整合发生在第一次卵裂以前则动物所有组织细胞中都整合有外源基因，若发生在第一次卵裂后则得到嵌合体动物。,二 转基因动物的基本原理 转基因动物构建的基本原理是将改建后的目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注入实验动物的受精卵（或着床前胚胎细胞），然后将此受精卵或（着床前胚胎细胞）再植入受体动物的输卵管（或子宫）中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物。人们可以通过分析转基因和动物表型的关系，从而揭示外源基因的功能，也可以通过转入目的基因培育品种优良的工程动物。,三、转基因动物的构建,（一）、供体DNA的准备 待转移的外源基因可以是 1、预先分离的某一基因； 2、逆转录法得到的cDNA； 3、人工合成的DNA片段； 4、含有目的基因的供体细胞基因组DNA。 通常将拟导入的目的基因在载体质粒上制成克隆，然后转化至大肠杆菌，扩增质粒；分离纯化重组质粒，用适当的限制性内切酶消化，制备成线状基因片段，最后将线状或环状重组DNA分别溶入无菌生理盐水，浓度为50100g/ml C贮存备用。,（二）实验动物的准备（以小鼠为例）,1、供体动物:转基因研究中提供受精卵的母鼠。 由超排处理的母鼠和正常雄鼠交配后得到。 若无遗传背景的特殊要求，可选用F1动物，46周龄的雌鼠用孕马血清（PMS）和人绒毛膜促性腺激素（hCG）作超排卵处理。PMS与hCG注射间隔为4248小时，第二次注射后让雌鼠与68周龄的雄鼠合笼。次日选择有阴道栓的雌鼠，颈椎脱臼法处死，取输卵管，解剖镜下用注射器冲出受精卵，待用。,2、受体动物（假孕雌鼠）：转基因研究中接受受精卵的假孕雌鼠。 由健康雌鼠（6周龄-5月龄）与结扎雄鼠交配（时间应于供体动物同时进行），次日选择有阴栓的动物待用。 3、不育雄性动物（结扎雄鼠）：结扎输精管的雄鼠，其具有正常的交配能力，但精液中无精子，和母鼠交配后，母鼠呈假孕态。 4、种鼠：有生殖能力的正常雄鼠。,（三）、基因导入方法 1、受精卵雄原核显微注射法 2、胚胎干细胞（ES细胞）法 3、逆转录病毒感染法 4、体细胞核移植法 5、精子载体法 6、YAC法,1、显微注射法 以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术将构建好的载体DNA直接注射入受精卵的原核，再将接受注射的受精卵移入受体输卵管继续发育获得转基因动物个体。 目前应用较广泛, 最早最经典的方法。,这一方法的实验程序如下： 准备假孕母鼠（养母） 受精卵的准备 基因导入 胚胎移植 对幼鼠的鉴定,原核显微注射的方法建立转基因小鼠流程示意图,纤维原核显微注射的方法建立转基因小鼠流程示意图,图a 原核显微注射的方法建立转基因小鼠流程示意图,图a 原核显微注射的方法建立转基因小鼠流程示意图,雄原核显微注射,Oviduct Transfers,其成功率的高低主要取决于受精卵和胚胎发育的时间。 基因的整合是随机的，多数插入单一染色体位点中。外源基因的插入会引起宿主基因的DNA序列重排，缺失，重复或易位。,优点： 外源DNA大小基本不受限制(1-50kb) 导入过程直观 整合率高,缺点： 设备昂贵、环节较多 对操作人员有较高的技术要求 低效率（尤其是大家畜） 对卵子伤害大，胚胎存活率低 基因整合随机性 转基因沉默,2、胚胎干细胞（ES细胞）法 ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜能细胞系。 将携带有外源基因的ES细胞注入到动物的早期胚胎内，可产生嵌合体及转基因动物。,它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。,在ES细胞上的基因操作： 可以通过逆转录病毒感染、脂质体介导、电 穿孔、磷酸钙共沉淀等方法将外源基因导入 ES细胞。,Generating ES Cells,Retrieval of Blastocysts,Injection of ES cells into blastocysts,优点： 外源基因整合情况的可控性高。 可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、 定位、表达的水平及插入的稳定性。 外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定 及筛选方便。,缺点： ES细胞系建立及培养困难 维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易 所得个体为嵌合体,目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。,将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高滴度病毒颗粒，人为感染着床前后的胚胎（也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共同培养以达到感染目的), 获得转基因动物的方法。,3、逆转录病毒感染法,优点： 受精卵携带外源基因的阳性率高 外源基因多单拷贝整合 操作简单，避免注射法对卵子的损害 宿主范围广 可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高,缺点： 容纳大小有限 重组逆转录病毒的长末端容易甲基化，影响 外源基因的表达,方式 显微注射法 逆转录病毒法 DNA长度 50kb, 10-15kb, 与时相 单细胞卵 4-6细胞卵 移卵部位 输卵管 子宫 整合方式 随机，多拷贝 随机，单拷贝 表达 受宿主旁侧 受LTR影响 的DNA影响 易缺失 传代 可以 有时不可以 子代嵌合体机率高,4、体细胞核移植法 将外源基因导入到体细胞中，再将该细胞进行培养，选择其中带有外源基因的细胞进行扩增，用这种细胞的细胞核进行核移植（把体细胞核植入一个去了核的卵母细胞中，融合并激活），将重组胚进行体外培养或者植入同步化的假孕动物的输卵管。,在理论上应该全部为阳性转基因动物，而且外源基因的整合率可达100%。,1997年，英国：克隆羊Dolly 1999年, 中国：陈大元 利用兔的卵母细胞获得种间核移植的大熊猫胚胎 2000年，美国：转基因牛,优点： 对体细胞进行基因改造后，用于核移植可以 提高转基因的效率，不仅具有“ES细胞途径” 的全部优点，且物种适用面广，无需经过嵌合 体育种就可获得纯合个体，周期短，效率高。,缺点： 技术上难度大， 成功率极低， 胚胎死亡率高， 非一般实验室可以开展。,5、精子载体法 直接以精子为载体的转基因方法。 将成熟精子与外源共培养，成熟精子 与外源DNA预培养之后，使精子有能力携带 外源DNA进入卵子中，使之受精，并使外源DNA 整合到染色体中。,目前国际上只有1例成功模型，国内 也很少有相关报道，精子载体法很少被应用。,6、法 利用酵母人工染色体()作为载体 制作转基因动物的方法。 酵母人工染色体（）载体是近年来 发展起来的新型载体, 能克隆百万对碱基 的大片段。,优点： 保证大片段的完整性 。 保证较长外源片段在转基因动物研究中的 整合率提高 。 保证了目的基因上下游的侧翼序列的完整性， 因而可以消除或减弱基因整合后的位置效应。,因此介导法制备转基因动物具有广阔的应用前景。 除上述几种常用的转基因方法外，人们为了适应于一些特殊需要也探索了一些其他的方法。例如诱变技术(P265)等，这些方法都不太成熟，其应用也正被人们验证。,（四）、 注射后卵（胚胎)的移植,注射后单细胞至桑椹胚的卵移植到受孕后05天的假孕鼠输卵管内，输卵管移植要求用透明带包裹的卵。注射后35天的囊胚，移植到假孕25天的雌鼠子宫内，子宫移植不需要有透明带。,（五）、转基因动物的鉴定,假孕鼠经过胚胎移植后精心饲养，分娩后，取仔鼠尾，剪碎，消化，提取DNA，用PCR、Dot blot等方法鉴定是否含有外源基因，确定转基因动物。,（六）、建立转基因鼠系,首建转基因动物确定后，即用之交配繁殖，以建立转基因鼠系，大部分首建者的下一代50%含外源基因，20%为嵌合体，还有一部分不育。 若首建者为近交系产生，可用相同种系交配，以维持其遗传背景，首建者来源于非近交系，则可用F1动物与首建者交配繁殖。,四、转基因动物的命名,转基因动物的名称一般包括：构建转基因动物的方法、外源基因的特性、及构建实验室等信息。 形式如下：TgX(YYYY) Z z z Tg 是Transgene 的宿写 X 代表DNA的插入方式（一般用N表示非同源插入；H代表同源重组；R代表逆转录病毒感染。） YYYY 是插入序列指示，一般由8个以内字符表示，（如Ins1 鼠胰岛素基因）已命名的基因序列要采用标准基因符号（命名时可查基因数据库） 实验室指定的序号，转基因动物被证实后，实验室指定的独特号码，至多可用5个字符（数字）,Z z z 实验室密码 指定给每个制备转基因动物实验室的代号。 转基因动物遗传背景为单一品系的，还要在转基因符号前加上动物品系名称。 如：C57BL/6JTgN(GPDH)23Jwg表示GPDH（人甘油磷酸盐脱氢酶）基因非同源插入C57BL/6J小鼠染色体内，由Jon W .Gordon实验室筛选出的第23号动物。,五、转基因动物的特性,整合拷贝数1-100左右，多拷贝常以首尾 相连接的形式存在。 整合是随机的。 整合是稳定的，可以传给子代。 外源基因可以在一种组织或多种组织中表达。 少数外源基因两侧序列有重排现象。 基因表达强弱与拷贝数无关，与“位置效应” 有关。,六、转基因动物的应用,（一）、 在研究病毒性疾病中的应用 1、 乙型肝炎的转基因研究 乙型肝炎是严重危害人类健康的传染性疾病，HBV一般不易感染培养细胞和常用实验动物，在一定程度上限制了对其致病机理的研究，HBV转基因动物的建立为乙肝的研究提供了新的途径。人们将HBV基因组或其部分片段转入小鼠体内，研究其在转基因动物体内的表达调控，肝细胞的损伤，诱癌剂及抗毒剂对转基因鼠的作用等。,2、转基因动物在人嗜T淋巴细胞病毒研究中的应用 目前转基因技术已用于人嗜T淋巴细胞病毒（又称人免疫缺陷病毒HIV）的研究，成为人们了解成年T淋巴细胞白血病和艾滋病的工具。整合有HIV前病毒DNA的转基因小鼠子代中的出现综合症。 3、 在其它病毒性疾病当中的应用 脊髓灰质炎病毒（PVR）受体的转基因鼠， 猴病毒40（SV40）转基因鼠，免疫球旦白启动子调控下的单纯疱疹病毒1型胸苷激酶（HSV-1-tk）转基因鼠等的建立于表达为这些病毒性疾病的研究提供了广阔的前景。,（二）、 在遗传病研究中的应用,转基因动物在遗传学中具有重要作用，被认为是遗传学研究中继连锁分析、体细胞遗传和基因克隆之后的第四代技术。该技术已成功地应用于遗病的研究，主要用于建立遗传病动物模型，以研究单个基因在遗传病发病中的作用，还可以研究药物干预后动物反应机理等。目前这类转基因动物模型主要有：镰刀状细胞贫血、囊性纤维化、家族性高胆固醇血症和高血压等转基因动物模型。,（三）、 在免疫学中的应用,1、对免疫机制的研究 有人将重排的Ig基因和其对应的抗原基因转入小鼠的受精卵产生的转基因小鼠为研究自身抗原免疫耐受性产生的机制提供了模型动物。,2、建立免疫性疾病动物模型 用Ig的重链基因和轻链基因分别制备转基因小鼠，前者品系为H3，后者为L1，以雌性H3与雄性L1杂交产生转双基因的H3L1小鼠，H3小鼠和L1小鼠均无自身免疫溶血性贫血，而H3L1小鼠却发生了严重程度不同和自身免疫溶血性贫血。其严重程度和转基因小鼠体内产生的自身抗体的量成正比。目前建立的一系列自身免疫性疾病动物模型，为进一步研究自身免疫性疾病的病因和发病机制及预防和治疗尊定了基础。,（四）、 基因治疗,基因治疗是通过改变患者遗传物质而达到治疗疾病的一种方法。改变遗传物质的主要途径有：引入功能正常基因、置换致病基因、修饰致病基因。治疗方式包括：体细胞基因治疗和生殖细胞基因治疗。基因治疗目前主要应用于动物，其中包括生殖系统疾病，心血管疾病，肌营养不良等。,（五）、 在基因表达调控中的应用,基因表达的调控研究是当今