抗生素类药物的分析详细解释各类抗生素特点.ppt

二、抗生素药物的质量分析,显色反应 光谱法 色谱法 生物学法 检查灭活前后的抑菌能力,（一）鉴别,（二）检查：,异常毒性检查 组分分析 细菌内毒素检查 杂质吸收度 热原检查 聚合物 降压物质检查 悬浮时间与抽针试验 无菌检查,发酵液中含有：无机盐、脂肪、各种蛋白质、色素、热原、毒性物质、微生物、各种降解产物等杂质,注射用普鲁卡因青霉素,悬浮时间与抽针试验：取本品1 瓶，按每40万单位加水1ml 使成混悬液，摇匀，静置2 分钟，不得有颗粒下沉或明显的分层。用装有4号针头的注射器抽取，应能顺利通过，不得阻塞。,1.抗生素活性表示方法 效价单位：每毫升或每毫克中含有某种抗生素的有效成分的多少。 表示方法：单位u 或 g,(三) 含量测定或效价测定,例：1 mg青霉素钠1670单位 1 mg庆大霉素=590单位 1 mg青霉素钾=1670*356.4/372.5=1598单位 标示量表示方法： 例：青霉素V钾片每片含量250 mg(400000单位),2. 微生物检定法 测定抗生素抑菌或杀菌的能力。 方法：管碟法和浊度法,缺点 1、操作繁琐 2、培养时间长 3、测定误差大,优点 1、与临床效果一致 2、灵敏度高 3、干扰物质少,3.化学及物理化学方法 优点：1. 准确度高 2. 简单、快速 缺点 1.易受杂质干扰 2.不一定代表生物效价,只有当用物理化学法测定的结果与用 生物学法测定的效价相一致时，才能 用物理化学法测定,分类（按结构与性质）： 内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、多烯大环类、多肽类、苯烃胺类、蒽环类、其他抗生素类,三、抗生素的分类,分类 青霉素族 头孢菌素族,第二节 内酰胺类抗生素,青霉素类,母核：6-氨基青霉烷酸 6-APA,一、结构与性质,1,2,5,4,3,6,7,青霉素,（青霉素G、苄青霉素）,氨苄西林 （氨苄青霉素）,阿莫西林 （羟氨苄青霉素）,普鲁卡因青霉素,头孢菌素类,7-ACA,8,7,6,1,2,3,4,5,N,O,N,H,S,C,H,2,R,1,C,O,O,H,母核（7-氨基头孢菌烷酸）,R,C,O,头孢氨苄,头孢拉定,头孢羟氨苄,头孢噻吩钠,（一）羧基 酸性：pKa值在2.52.8之间 与碱金属(Na+、K+)成盐后，易溶于水,与有机碱(普鲁卡因)成盐，难溶于水,普鲁卡因青霉素,（二）旋光性,青霉素类,头孢菌素类,*,*,*,*,*,8,7,6,1,2,3,4,5,N,O,S,N,S,O,4,3,2,1,5,6,7,（三）共轭体系,母核无明显UV 多数有苯环取代基 水解产物(青酶烯酸)有UV,青霉素类,COOH,头孢菌素类,COOH,母核有共轭体系,（四）内酰胺环的不稳定性,水溶液：不稳定（pH66.8时较稳定）,干燥条件下： 稳定,不稳定因素,四元环张力大,酰胺键易水解,某些金属离子 高温,氧化剂,青霉素水溶液在pH 66.8时较稳定,例,青霉素的降解反应,青霉素,青霉噻唑酸,H2O/OH,青霉素酶,青霉酸,H2O,pH2,100,青霉噻唑酰基羟胺酸,NH2OH,青霉烯酸,pH4,青霉胺,CO2,青霉醛,HgCl2,(头孢噻吩钠水溶液2524h失活8%),NaOH,呈色,二、鉴 别 （一）呈色反应 1. 羟肟酸铁反应,（红、棕、褐）,NaOH,C2H5OH,哌拉西林,取本品10mg，加水2ml与盐酸羟胺溶液3ml ，振摇溶解后，放置5分钟，加酸性硫酸铁铵试液1ml，摇匀，显红棕色。,2. 茚三酮反应,烯醇式,茚三酮,+,H,2,O,C,N,C,H,2,R,C=,O,R,C,H,H,2,N,C,O,O,H,O,C=,C,O,C,O,C,O,H,N,H,2,C,C,O,C,O,C,O,C,O,H,C,N,C,C,O,C,O,C,O,C,O,H,C,H,R,N,C,C,O,C,O,C,O,（开环分解）,3. 双缩脲反应-内酰胺类,似肽键,紫红色,（分解）,变色酸,显色,4. 与变色酸-硫酸反应,（缩合）,变色酸,硫酸,（偶合）,酚羟基,5. 与重氮苯磺酸反应,（偶合）,头孢哌酮,橙黄色,（二）各种盐的反应,K+、Na+的火焰反应,（三）色谱法 对照品对照法 1. TLC法,2.HPLC法,-内酰胺环,酰胺,（四）光谱法 1、 IR法,羧酸离子 1600cm-1，1410cm-1,2. UV法 样品、分解产物的最大吸收波长,青霉素V钠 A280nm/A264nm = 1.301.50,pH3.8,三、杂质检查,药物 检查项目 检查方法 头孢他啶 聚合物 HPLC法 头孢曲松钠 结晶性，有关物质， HPLC法 聚合物 头孢噻肟钠 聚合物 HPLC 头孢呋辛酯 结晶性，有关物质， HPLC法 聚合物 头孢氨苄 有关物质 HPLC法 青霉素钾 吸光度，结晶性 紫外分光光度法 聚合物,1. 聚合物 体积排阻色谱法葡聚糖凝胶色谱法,2.头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查,异构体,异构体A,异构体B,3-异构体,E异构体,控制比例,有关物质,异构体： 异构体 相对保留时间 判断 B异构体 0.9 A异构体 1.0 与A、B异构体峰面积 和之比应为0.480.55,有关物质 高低浓度自身对照法（1%）,有关物质 相对保留时间 判断 3-异构体 1.2 不得大于对照液主峰面积之和的1.5倍（1.5%） E异构体 1.7和2.1 不得大于对照液主峰面积之和（1.0%） 其他杂质 不得大于对照液主峰面积之和的1/2（0.5%） 所有杂质 不得大于对照液主峰面积之和的3倍（3.0%）,（三）青霉素钠（钾）的吸收度检查 供试液 1.80 mg/ml， 结果判断：A280不得大于0.10，在264nm处有最大吸收，吸光度应为0.80-0.88.,（四）有机溶剂,例： 氨苄西林钠需检查二氯甲烷 头孢哌酮钠需检查丙酮 头孢他啶需检查吡啶,（五）结晶性 固态物质分为结晶质和非结晶质两大类。 检查结晶性的方法： 第一法：偏光显微镜法，应呈现双折射和消光位等晶体光学性质。 第二法：X射线粉末衍射法。结晶质呈现特征的衍射图，非晶质的衍射图呈弥散状。,四、含量测定,（一）HPLC法,方法：离子色谱法 流动相：缓冲液/甲醇（乙腈）,（五）生物样品的分析,第三节 氨基糖苷类抗生素,链霉素 庆大霉素 巴龙霉素 卡那霉素 新霉素 等,链霉素,链霉胍 + 链霉糖 + N-甲基-L-葡萄糖胺,苷元,链霉双糖胺,一、结构与性质,链霉胍,链霉糖,N-甲基-L- 葡萄糖胺,链霉素,链霉胍,链霉糖,N-甲基-L- 葡萄糖胺,碱性 水溶性 旋光性,有紫外吸收 230nm 稳定性,巴龙霉素（，）,D-葡萄糖胺 脱氧链霉胺 巴龙胺,D-核糖 巴龙霉糖 巴龙二糖胺,R1、R2：-CH2NH2,绛红糖胺 + 脱氧链霉胺 + 加洛糖胺,绛红糖胺,紫素胺,2-脱氧链霉胺,加洛糖胺,复合物 碱性,水溶性 旋光性,性质稳定 无紫外吸收,R2,O,C,R,3,R,1,HN,N,H,2,O,O,H,H,2,N,N,H,2,O,O,O,H,N,H,C,H,3,O,H,C,H,3,2,二、鉴别,（一）茚三酮反应 原理：具有羟基胺和-氨基酸的性质,+,蓝紫色,（二）Molisch试验,具有五碳糖或六碳糖结构,H+,糠 醛 羟甲基糠醛,-萘酚,红紫色,蒽酮,蓝紫色,糠醛与-萘酚呈色原理,红紫色,羟甲基糠醛,糠醛与蒽酮的呈色原理,羟甲基糠醛,蓝紫色,例：阿米卡星的鉴别反应：取本品约 10mg，加水1ml溶解后，加0.1%蒽酮的硫酸溶液4ml，即显蓝紫色。,（三） N-甲基葡萄糖胺反应,乙酰丙酮,OH-,吡咯衍生物,对二甲氨基苯甲醛,H+,樱桃红色,（Elson-Morgan反应）,新霉素 巴龙霉素,樱桃红色,对二甲氨基苯甲醛,H+,硫酸巴龙霉素 鉴别,取本品约10mg，加水1ml 溶解后，加盐酸溶液(9100)2ml ，在水 浴中加热10分钟，加8 氢氧化钠溶液2ml 与2 乙酰丙酮溶液1ml ，再在水浴中加热 5 分钟，冷却后，加对二甲氨基苯甲醛试液1ml ，即显樱桃红色。,（四）麦芽酚反应,链霉素特有反应,紫红,麦芽酚,硫酸链霉素的鉴别方法： 取本品约20mg，加水5ml溶解后，加氢氧化钠试液0.3ml，置水浴上加热5分钟，加硫酸铁铵溶液0.5ml，即呈紫红色。,链霉素特有反应,（或-萘酚）,8-羟基喹啉,（五）坂口反应,-萘酚,橙红色,8羟基喹啉,链霉胍,硫酸链霉素的鉴别方法： 取本品约0.5mg，加水4ml溶解后，加氢氧化钠试液2.5ml与0.1%8-羟基喹啉的乙醇溶液1ml，放冷至约15，加次溴酸钠试液3滴，即显橙红色。,（六）硫酸盐反应,H+,盐酸or硝酸,不溶,（七）色谱法： 1.TLC 多以硅胶为薄层板，三氯甲烷-甲醇-浓氨水为展开剂，茚三酮或碘蒸汽为显色剂。 2.HPLC,（八） UV法 庆大霉素无UV吸收 BP2005: 240330nm无吸收,（九） IR法,三、检查,（一）链霉素杂质,链霉素B（甘露糖链霉素）,1. 来源 反应中间体 菌种 链霉素B 链霉素,2 方法 TLC 对照品法 硫酸甲醇 加热回流 羟甲基糠醛 显色剂：1,3-萘二酚乙醇溶液与20%硫酸,样 品 甘露糖,样品溶液与对照溶液相对应的斑点相比较 不得更深,对微生物的活性无明显差异 毒副作用和耐药性不同,发酵菌种不同 工艺差别,C组分比例 不一致,规定控制各组分的相对百分含量,（二）庆大霉素C组分的测定,max = 330nm,衍生化法,OPA,1.USP RPHPLC,异吲哚衍生物,离子对色谱法 离子对试剂： 0.02 mol/L庚烷磺酸钠 面积归一化法： 各组分的含量%=rf/rs*100%,规定 C1 2550% C1a 1035% C2a +C2 2555%,2.电化学检测器检测庆大霉素C组分（BP 2005）,3. 蒸发光散射检测器测定庆大霉素C组分（Ch.P 2005）,任何挥发性低于流动相的样品均能被检测 ELSD检测分为三个步骤：（1）用惰性气体雾化脱洗液（2） 流动相在加热管（漂移管）中蒸发（3）样品颗粒散射光后得到检测。 溶液浓度的对数值与相应的主峰面积对数值成正比,流动相：0.2mol/l三氟醋酸-甲醇（92：8） 流速：每分钟0.6ml 定量方法：标准曲线法，3个浓度，相关系数应不小于0.99,规定 C1 2550% C1a 1540% C2a +C2 2050%,（四）硫酸盐测定（组分分析）,硫酸萘替米星：取本品约0.12g，精密称定，加水100ml使溶解，用浓氨溶液调节pH值至11后，精密加氯化钡滴定液(0.1mol/L)10ml、酞紫指示液5滴，用乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05mol/L)滴定，注意保持滴定过程中的pH值为11，滴定至紫色开始消褪，加入乙醇50ml，继续滴定，至蓝紫色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。本品含硫酸盐按无水物计算应为31.535.0。,三、含量测定,HPLC法： 蒸发光散射法：依替米星、卡那霉素 衍生化法：阿米卡星,微生物检定法：链霉素、庆大霉素、 萘替米星,第四节 四环素类抗生素,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,4a,5a,D,C,B,A,基 本 结 构,四环素（TC）tetracycline,6,金霉素 (CTC) chlortetracycline,氯四环素,土霉素 (OTC) oxytetracycline,氧四环素,5,多西环素 (DOTC) doxycycline,脱氧土霉素,6,美他环素（METC） metacycline,一、结构与性质,二甲胺基 弱碱性,（一）酸碱性与溶解度,1.两性化合物 与酸、碱均能成盐 2.强酸或强碱中溶解度 3.吸湿性 多含结晶水,（二）旋光性 （三）UV和荧光 四环素类药物及其降解产物均具有荧光。 如：四环素经碱降解后，呈黄色荧光 土霉素经酸性降解后，呈绿色荧光 金霉素经碱降解后，呈蓝色荧光.,1.差向异构化C4,（四）稳定性 对各种氧化剂、酸、碱都不稳定,差向四环素,ETC,（土霉素、多西环素不易差向异构化）,4,5,2,C,H,3,N,H,O,H,C,O,N,H,2,O,O,H,O,H,O,O,H,R,2,R,1,H,O,（1）酸性降解,2.降解反应,ATC,脱水四环素,C,橙黄色,TC,ETC,ATC,EATC,差向脱水四环素,橙红色,淡黄色,砖红色,淡黄色,（2）碱性降解,无活性,强烈荧光,二、鉴别试验 （一） HPLC法 （二） TLC法 固定相：硅藻土（甘油、EDTA） EDTA 克服痕量金属造成的拖尾现象 检视：365nm波长下观察荧光,（三）IR光谱法 （四）UV光谱法 多以酸性甲醇溶液为溶剂。,（五）显色法 1. H2SO4 反应,（二） FeCl3反应,盐酸四环素的鉴别,取本品约0.5mg ，加硫酸2ml ，即显深紫色，再加三氯化铁试液 1 滴，溶液变为红棕色。,三、检查,土霉素（OTC，1） 4-差向四环素（ETC，1.42） 盐酸金霉素（CTC，1.39） 脱水四环素（ATC，0.48） 差向脱水四环素（EATC，0.62）,盐酸四环素,（一）有关物质HPLC法（2010年版） 方法：自身对照+校正因子,（二）吸收度,取本品，在2025，加0.8%氢氧化钠溶液制成每1ml含10mg的溶液，照紫外-可见分光光度法，置4cm的吸收池中，自加氢氧化钠溶液起5分钟时，在530nm的波长处测定，吸光度不得过0.12（供注射用）。,盐酸四环素杂质吸收度,（三）残留有机溶剂,盐酸多西环素为半乙醇半水合物。 应检查乙醇，含乙醇的量应为4.3%6.0%。,HPLC法（外标法） 如：盐酸四环素 C18柱（PH值适应范围大于8.0）,四、含量测定,第五节 抗生素类药物中高分子 杂质的检查,1.高分子杂质 分子量大于药物本身的杂质总称。分子量一般在1000-5000.,蛋白、多肽、多糖或抗生素与蛋白、多肽、多糖的结合物。主要来自于发酵工艺，致敏，如青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽。 药物的自身聚合物，来自于生产、贮存过程。可引发过敏。,外源性杂质,内源性杂质,2.来源,3.高分子杂质的质控方法,（1）凝胶渗透色谱法,（2）高分子杂质的控制方法-自身对照外标法 原理：特定条件下，药物自身可缔合成与高分子杂质有相似色谱行为的缔合物。 计算方法：按外标法计算，得样品中高分子杂质相当于药物本身的相对含量。,色谱条件 色谱柱：葡聚糖凝胶G-10（40-120m），玻璃柱内径1.01.4cm，柱长45cm。 流动相A：含3.5%硫酸铵的pH7磷酸盐缓冲液 流动相B：水。,头孢他啶聚合物的测定,对照品溶液：头孢他啶的水溶液。 供试品溶液：头孢他啶的碳酸钠溶液。,系统适用性试验：,头孢他啶和蓝色葡聚糖2000的混合碳酸钠溶液，用流动相A测定。高聚体的峰高与单体和高聚体之间的谷高比应大于1.5。 测定法：按外标法以峰面积计算，含头孢他啶聚合物以头孢他啶计，不得过0.3%。,1. 熟悉抗生素类药物分析的特点及其 常规检验项目。熟悉生物学法与物理化学法测定效价的原理及优缺点。 2.掌握内酰胺类抗生素的结构、 性质、鉴别方法。,第十一章 复习内容,3.