GB-T18626-2002肉中有机磷及氨基甲酸酯农药残留量的简易检验方法酶抑制法.pdf

t c s 6 7 . 0 4 0C 5 3中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B / T 1 8 6 2 6 -2 0 0 2肉中有机磷及氨基甲酸醋农药残留量的简易检验方法酶抑制法Me t h o d f o r s i mp l e d e t e r mi n a t i o n o f o r g a n o p h o s p h o r u s a n d c a r b a ma t e p e s t i c i d e r e s i d u e s i n me a t -E n z y me i n h i b i t i o n me t h o d2 0 0 2 一 0 1 一 2 8发布2 0 0 2 一 0 6 一 0 1实施 人民共和国量 监 督 检 验 检 疫 总 局发 布i f ; 几C B / T 1 8 6 2 6 - - 2 0 0 2前言 本标准在制定过程中主要参考了以下标准: 美国公职分析化学师协会A O A C 1 2 2 9 . 0 4 9 - 2 9 . 0 5 5 食品中有机磷农药残留测定胆碱酷酶抑制法 本标准的附录A是规范性附录。 本标准由辽宁省质量技术监督局提出。 本标准由沈阳农业大学、 沈阳市质t技术监督局苏家屯分局负责起草。 本标准主要起草人: 周艳明、 高淑英、 张会娟、 王晓光、 李亮亮、 昊小琳、 牛森.G s / r 1 8 6 2 6 -2 0 0 2肉中有机磷及氨基甲酸醋农药残留，的简易检验方法酶抑制法范围本标准规定了用酶抑制法测定肉中有机磷农药及氨基甲酸醋农药残留总量的简易检验方法。本标准适用于肉中有机磷农药及氨基甲酸醋农药残留的测定。2 原理 有机磷农药及氨基甲酸醋类农药对胆碱醋酶的活性有抑制作用， 在一定条件下， 其抑制率取决于农药种类及其含量。 在p H 8 的溶液中， 碘化硫代乙酞胆碱被胆碱酷酶水解， 生成硫代胆碱。硫代胆碱具有还原性， 能使蓝色的2 , 6 一 二抓靛酚褪色， 褪色程度与胆碱酸酶活性正相关， 可在 6 0 0 n m比色测定， 酶活性愈高时， 吸光度值愈低。当样品提取液中有一定量的有机磷农药或氮基甲酸醋类农药存在时， 酶活性受到抑制， 吸光度值则较高。 据此， 可判断样品中有机磷农药或氨基甲酸醋类农药的残留情况。 样品提取液用氧化剂氧化， 可提高某些有机磷农药的抑制率， 因而可提高其测定灵敏度， 过量的氧化剂再用还原剂还原， 以免干扰测定 。3 试剂3 . 1 底物溶液 2 %碘化硫代乙酷胆碱水溶液, 1 g 碘化硫代乙酞胆碱， 加缓冲液溶解并定容至5 0 m L ,3 . 2 缓冲液 p H8 三经甲基氨基甲烷( T r i s ) - 盐酸缓冲液: 5 0 m L 0 . 1 m o l / L T r i s 加 2 9 . 2 m L 0 . 1 m o l / I盐酸加水定容至1 0 0 m l 。3 . 3 显色剂: 0 . 0 4 % 2 , 6 一 二抓靛酚水溶液。3 . 4 氧化剂: o . 5 %次抓酸钙水溶液。15 还原剂: 1 0 %亚硝酸钠水溶液。3 . 6 胆碱醋酶液， 0 . 2 g 酶粉( 其制备方法见附录A) 加 1 0 m l - 缓冲液溶解。3 . 7 脱色剂: 活性炭。I8 丙酮: 分析纯。I9 碳酸钙: 分析纯。4 仪 器分光光度计 。5 分析步骤 以下操作可在 1 5 C-3 5 c温度下进行5 . 1 样品提取 取。 . 5 g肉置于1 0 m l烧杯中， 加5 m l丙酮浸泡5 m m. 不时振摇， 再加。 . 2 g 碳酸钙。G B / T 1 8 6 2 6 - - - 2 0 0 25 . 2 级化 取 。 . 5 ml丙酮液于 5 ml烧杯中， 吹干丙酮后， 加 0 . 3 ml - 缓冲液溶解 。 加人氧化剂 0 . 1 m 工 _ ， 摇匀后放置 1 0 mi n ， 再加人还原剂 0 . 3 ml , , 摇匀5 . 3 酶解 加人酶液 。 . 2 ml , , 摇匀， 放置 1 0 mi n ， 再加人底物溶液 0 . 2 mL， 显色剂 0 . 1 m工 _ ， 放置 5 mi n后测 定 。5 . 4 测定 分光光度计波长调至 6 0 0 n m， 其他按常规操作 ， 读取测定值。6结果测定结果的使用当测定值在 1 . 0以下时， 为未检出。当测定值在 1 . 0 -1 . 3 之间时， 为可能检出， 但残留量较低。当测定值为 1 . 3 以上时， 为检出。测定值与农药残留量正相关， 测定值越高时， 说明农药残留量越高。方法最低检出浓度本方法最低检出浓度见表 1 。 衰 1 最低检出浓度单位为毫克每千克序号农 药最低检出浓度一序 号农药最低检出浓度!敌 敌 畏2 . 0一伏杀礴2 . 0 lz飞又 寸 硫确8 . 01内吸磷3 . 03甲基对硫磷3 . 0一甲胺磷2 0 一，敌百虫2 . 0乙欧 甲胺磷2 .05甲拌碑3 . 0二嗦礴5 . 06一 乐果3 . 0峡喃丹4 . 07氧化乐果1 . 0一西维因2 . 08辛硫磷3 . 0一抗蚜碑1 . 0G B / T 1 8 6 2 6 -2 0 0 2 附录A ( 规范性附录)胆碱丽醉粉的制备A. 1 试剂A . 1 . 1 0 . 1 m o l / L p H 6 . 0 确酸级冲液 0 . 1 m o l / L磷酸氢二钠溶液: 1 7 . 5 6 g磷酸氢二钠( N a , H P O , 2 H , O ) 溶于1 0 0 0 m L水。 0 . 1 m o l / L磷酸二氢钠溶液: 1 3 . 8 0 g 磷酸二氢钠( N a H , P O , 2 H , O ) 溶于1 0 0 0 m L水。 将 1 2 . 3 m l . 0 . 1 m o l / L磷酸氢二钠溶液与 8 7 . 7 m L 0 . 1 m o l / L磷酸二氢钠溶液混合， 即为0 . 1 m o l / L p H 6 . 0 磷酸舞冲液。A - 1 . 2 0 . 0 0 5 m o l / L p H 6 . 0 礴酸级冲液 取5 0 m L 0 . 1 m o l / L p H 6 . 0 磷酸缓冲液( A . 1 . 1 ) 加水稀释至1 0 0 0 m L ,A . 1 . 3 0 . 5 m o l / L红妞化钠一 0 . 5 m o l / L姐化钠溶液 1 . 0 m o l / I氢氧化钠溶液: 取4 0 g 氢氧化钠溶于1 0 0 0 m L水中。 1 . 0 m o l / L抓化钠溶液: 取5 8 . 5 g 抓化钠溶于1 0 0 0 m L水中。 将上两液1 : 1 混合， 即得。 . 5 m o l / L氢氧化钠一 0 . 5 m o l / L抓化钠溶液。A . 1 . 4 0 . 5 m o l / L盐酸一 0 . 5 mo l / L级化钠溶液 1 . 0 mo l / L盐酸溶液 : 取 8 3 . 3 3 mL浓盐酸溶于 1 0 0 0 mL水中。 将 1 . 0 m o l / L盐酸溶液与1 . 0 mo l / L抓化钠溶液1 : 1 混合， 即得 0 . 5 m o l / L盐酸- 0 . 5 mo l / I抓化钠溶液。A . 1 . 5 竣甲基纤维索( C M一 纤维众) 千粉装tA. 2A . 2 . 1A . 2 . 2A . 2 . 3梯度混合器: 两瓶连通式柱层析系统: 1 . 5 X 4 0 c m冷冻干燥机。， 每瓶容量2 0 0 m L .玻璃层析柱， 流量可达 2 mL / m i n蠕动泵。A. 3A. 3程序. 1 梭甲基纤维幸的处理取1 0 g 版甲基纤维素( C M一 纤维素) 干粉置于烧杯中， 加人1 0 0 M I . 0 . 5 m o l / I氢氧化钠一 。 . 5 m o l /I抓化钠溶液， 混匀， 静置 1 5 m i n后， 用布氏漏斗抽滤， 水洗滤饼至中性。将此滤饼再悬浮于 1 0 0 m工 _1 mo l / I 盐酸溶液中， 混匀， 静置 1 0 mi n后再用布氏漏斗抽滤， 水洗滤饼至中性。再将滤饼悬浮于1 0 0 ml . 0 . 5 m o l / I盐酸一 0 . 5 m o l / I . 抓化钠溶液中， 混匀， 静置 1 5 mi n后用布氏漏斗抽滤， 水洗滤饼至中性。将滤饼悬浮于0 . 0 0 5 m o l / L p H 6 . 0 磷酸缓冲液( A . 1 . 2 ) 中。A . 3 . 2 胆碱酸醉的提取 取 5 0 g新鲜食用面粉置三角瓶中， 加2 5 0 mL蒸馏水， 振荡3 0 m i n , 静置 3 0 m i n以上， 取上清液经 5 0 0 0 r / mi n离心 2 0 mi n . 收集上清液用冷冻干燥机浓缩至 2 0 m l左右， 为胆碱醋酶粗提掖 保存于冰箱中待纯化A . 3 . 3 胆碱酷醉粗提掖的纯化 将处理好的li t 甲基纤维素悬浮液加人层析柱中， 加 1 5 0 m工 ，0 . 0 0 5 m o l / l , p H6 . 0磷酸缓冲液G B / T 1 8 6 2 6 - - 2 0 0 2( A. 1 . 2 ) 于梯度混合器的初始液瓶中，