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细菌室操作规程细菌室操作规程细菌室操作规程细菌室操作规程细菌室操作规程细菌室操作规程 A AB BC C 四四医医院院检检验验科科 目录目录 第一篇第一篇细菌室操作程序文件细菌室操作程序文件 1. 细菌室人员岗位职责1 2. 标本采集及保存要求3 3. 显微镜检查法操作规程5 4. 细菌室标本操作流程6 5. 细菌的形态检查操作规程8 6. 细菌生化反应鉴定及其它实验操作规程11 7. 细菌的接种与培养方法操作规程17 8. 支原体培养、鉴定及药敏操作规程19 9. 血液感染病原体检验操作规程20 10. 中枢神经系统感染病原体检验操作规程22 11. 下呼吸道感染病原体检验操作规程24 12. 尿路感染病原体检验操作规程26 13. 消化道感染病原体检验操作规程29 14. 脓汁及病灶分泌物细菌学检验操作规程31 15. 生殖系统标本的处理33 16. 抗菌药物敏感试验34 第二篇第二篇医院微生物感染控制检测医院微生物感染控制检测 17. 消毒灭菌效果监测.37 18. 环境卫生学监测.38 19. 采样及检查原则.39 20. 各部位的消毒.43 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 1 细菌室人员岗位职责细菌室人员岗位职责 1、上班后先搞好室内卫生、核查各个培养箱、冰箱的工作温度是否在设定 的范围内，并做好记录。检查各种仪器工作是否正常，做好记录。 2、接收样本：核对各样本号与申请单联号是否一致，如不一致马上与病房 联系以便作出相应的处理，如退单或重送样本等，并做好联系情况的记录。核 查各送检样本是否符合要求。 痰液样本：先看外观、再直接涂片镜检，以白细胞25 个/低倍镜视野， 而上皮细胞10 个/低倍镜视野，为合格痰液。 无菌体液样本：检查各种无菌体液样本的盛放器皿是否符合要求。 容易干燥的样本：对一些容易干燥的样本如大便、咽拭子、脓液拭子、 泌尿生殖道拭子等是否已经干燥。 对不符合要求的样本必需与临床联系，以便作出相应处理，方法如联号不 符的样本，做好记录。对符合的样本进行原始单的登记。 3、样本编号：对符合的样本作出编号，普通细菌培养：痰液、咽拭子、血 液增菌培养、尿液、胸、腹水、脑脊液、胆汁、脓液、泌尿生殖道拭子、大便 致病菌培养。在各种培养基上及申请单上编号的同时均需明确标明接种日期。 4、样本接种： 血液、骨髓、腹水、关节液等：增菌培养瓶； 痰液、咽拭子：血平板、麦康凯平板； 尿液：血平板、麦康凯平板； 大便致病菌：SS 平板； 脑脊液：血平板、巧克力平板； 分泌物的淋球菌培养接种：淋球菌专用平板； 支原体培养+药敏：按说明书接种支原体专用培养基。 对以上接种样本的当前编号应记录于登记本上。此外对痰、脓液、脑脊液 等在接种的同时应对其沉渣进行革兰染色，如有细菌和或何种细菌为主立刻通 知临床，并做好记录。 5、查对昨天移种平板申请单及原始登记本，确定标本移种是否正确。观察 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 2 血液增菌培养瓶，如发现有细菌生长，马上涂片革兰染色，将细菌的染色特性 及形态报告给临床，并做好记录，同时进行移种。 6、观察平板，挑取可疑菌落涂片革兰染色，并做好细菌的鉴定与药敏实验 工作。 7、检查各种培养基及试剂的库存量，做好需配制培养基或购买试剂的交班 工作。 8、定期做好本室所用鉴定和药敏试条的质控，做好记录。 9、每天必须消毒平板、基础培养基等用于常规医院感染监测，另外根据具 体情况即时准备好各种中和剂、无菌瓶等，对 48 小时的空气培养出报告，同时 注意是否有致病菌、菌落数是否超标。 10、工作完成后注意对工作台面进行消毒、室内进行消毒。 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 3 标本采集及保存要求标本采集及保存要求 1、总则：用于细菌培养的标本在收集时应注意严格无菌操作和及时送检， 检测后标本应妥善保存。 2、临床标本的采集 2.1、下呼吸道分泌物(痰液) 令患者早上起床后用清水濑口，不要刷牙，立即从下部呼吸道咳出第一口 痰，吐在无菌塑料痰盒中，及时送检。 2.2、尿液(中段尿) 护理人员协助采取中段尿约 3ml 入无菌塑料盒中，及时送检。 2.3、粪便 取有粘液、脓血部分的粪便置无菌塑料盒中及时送检。 2.4、眼、耳、鼻、喉拭子 将棉拭子沾取少许无菌生理盐水(如沾取的太多，可在无菌生理盐水瓶壁上 挤去多余的水份)，然后采取可疑部位的分泌物，倒悬于无菌塑料盒中，及时送 检。 2.5、脓液 用沾有生理盐水的棉拭子沾取脓液，要尽量多取一些，然后将棉拭置于无 菌塑料盒中，及时送检。 2.6、血液 2.6.1、凡怀疑菌血症和败血病的患者，采血培养时，应尽量在未使用抗菌 素前采血，如已使用抗菌素，应尽量选择抗菌素在体内浓度最低时采血，应在 病人第二次使用抗菌素之前采集血培养标本。当然在病人发热或寒颤时采集也 可。 2.6.2、成人每次采血 510m1，小儿采血 35ml。 2.6.3、严格消毒病人采血部位和血培养瓶口，抽一定量血液后，无菌注入 血培养瓶内，轻轻摇匀。 2.6.4、从抽血到接种入瓶，动作要快，防止血液凝固，同时要及时送检。 2.7、穿刺液 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 4 胸腹水、心包液、关节腔液、鞘膜积液，严格无菌抽取后，注入含肝素抗 凝的无菌试管中，轻轻颠倒试管 10 余次，使肝素与穿刺液混匀达到抗凝的目的， 或直接无菌注入血培养瓶内及时送检。 2.8、胆汁 由专科医生以无菌方法取引流液 10m1 注入无菌塑料盒内。 2.9、脑脊液 以无菌方法取脑脊液 35ml，置无菌试管内，常温保存送检，如只做培养 可直接无菌注入血培养瓶内，及时送检。 2.10、生殖器官标本 阴道、子宫颈及前列腺等分泌物应由医师采集，收集于无菌塑料盒内送检。 如疑为淋病奈瑟菌感染，做培养检查时，采集的标本应床旁接种并及时放 入孵箱培养。 2.11、烧伤标本 以无菌棉拭子直接采取多个部位创面的脓汁分泌物放入无菌塑料盒中。 2.12、支原体（解脲、人型）培养+药敏的标本采集 2.12.1、支原体对干、热抵抗力差，标本采集后应尽快接种支原体运送培养 基送检。 2.12.2、男性：用细的无菌棉拭子沾取无菌盐水少许深入尿道口内 22.5cm。 3、临床标本的保存 细菌室标本原则上要求及时送检、及时处理，不得保存。 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 5 显微镜检查法操作规程显微镜检查法操作规程 显微镜检查是细菌鉴定工作中的一重要手段，有助于细菌的初步鉴别，同 时对下一步鉴定工作起着重要的指导作用。有时通过形态学检查可得到初步诊 断，如痰中的抗酸杆菌和泌尿生殖道分泌物中的淋病奈瑟菌等。显微镜检查有 不染色标本检查法和染色标本检查法两种。 1、不染色标本的检查：不染色标本主要用于检查细菌的动力及运动状况。 1.1、压滴法：用接种环取细菌悬液 2 环，置于清洁载玻片中央，覆上盖玻 片，于高倍镜下观察。制片时菌液要适量，不可有气泡，不可外溢。 1.2、悬滴法：取洁净的凹窝载玻片及盖玻片各 1 块，将凹孔四周的平面上 涂上一层凡士林，取一环菌液置盖玻片中央，将凹窝载玻片的凹面向下，对准 于盖玻片的液滴上，然后迅速翻转玻片，用小镊子轻压盖玻片使之与凹孔边缘 粘紧。镜下观察时先低倍后高倍，不可压碎盖玻片。有动力的细菌可见细菌从 一处移到另一处，无动力的细菌呈布朗运动而无位置的改变。螺旋体由于菌体 纤细、透明，需用暗视野显微镜观察其形态、活动。 2、染色标本检查法：通过对标本的制片及染色，能观察细菌的形态、大小、 排列、染色特性以及荚膜、芽胞、异染颗粒等结构，有助于细菌的初步鉴定。 2.1、快速革兰染色法 2.1.1、操作见试剂说明书 2.1.2、结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 2.1.3、注意事项：染色关健在于涂片和脱色，涂片不宜过厚，固定不宜过 热，脱色不宜过度，菌龄为 1824 小时为佳。 2.2、抗酸染色法 2.2.1、操作见试剂说明书 2.2.2、结果：抗酸杆菌呈红色。 2.2.3、注意事项：每一张玻片只能涂一份标本且不能在染色缸中染色，以 免造成不同标本间的交互污染从而导致阴阳性结果混淆，至无红色液体流下。 3、墨汁负染镜检：背景着色而菌体不着色的染色法，用以观察新型隐球菌 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 6 的宽厚荚膜等。 菌室标本操作流程菌室标本操作流程 1、标本的接受 1.1、标本接受的时间：原则上全天任何时间均可。 1.2、标本的接受：接受标本者要认真核对标本的数量、标本与检验单要求 是否相符以及标本的质量等。 1.3、把接受的标本编号。 2、临床标本的接种 2.1、检验目的是细菌培养+药敏试验。各临床标本的培养基选择如下： 2.1.1 培养基的选择 标本类型培养基 血 中段尿 脑脊液 穿刺液 胆汁 呼吸道标本 粪便标本 病灶分泌物 血培养瓶 血平板、麦康凯平板 血平板、巧克力平板 血平板、麦康凯平板 血平板、麦康凯平板 血平板、麦康凯平板 SS 平板 血平板、麦康凯平板 2.1.2、生殖器标本根据临床医生所写的检验项目接种相应的平板，操作如 下：淋球菌培养接种淋球菌平板；念珠菌培养接种沙保罗培养基；支原体培养 则按支原体培养的操作规程操作；作普通细菌培养，则接种血平板和巧克 力平板；衣原体抗原检测的按衣原体抗原检测的操作规程进行检验。 2.2、接种的方法：标本做分区划线。 2.3、检验目的为找抗酸杆菌的按找抗酸杆菌的操作规程进行检验。 3、所接种的平板必须写上标本的编号和接种的日期，然后根据要求进行培 养。 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 7 4、标本的培养条件、温度、时间 平板培养条件、温度、时间 血平板 巧克力平板 淋球菌平板 沙保罗平板 其他的平板 孵箱、3537、1824 小时 孵箱、3537、1824 小时 孵箱、3537、1824 小时 孵箱、2831、2436 小时 孵箱、3537、1824 小时 5、根据生长在平板上的细菌菌落形态、菌落涂片、染色、镜检等来综合判 断细菌形态和染色性质，按各属鉴定的作业指导书进行各菌属的常规鉴定及药 敏试验。 6、结果的报告 确认细菌鉴定及药敏试验结果后，进行检验验单结果报告的存盘、打印。 7、对各类细菌培养标本除特殊要求外，我室一般操作完后按要求进行无害 化处理。 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 8 细菌的形态检查操作规程细菌的形态检查操作规程 1、不染色标本的检查 压滴法和悬滴法。主要用于检查生活状态下的细菌的动力及运动状况。将 特制好的标本置于显微镜载物台中央，先以低倍镜观察，再用高倍镜观察。 结果：有鞭毛的细菌呈穿梭似流星状运动(有明显的方向性)；无鞭毛的细 菌呈布朗运动(只在原地颤动而无位置的改变)。 2、细菌染色标本的检查 染色的第一步是制作涂片。菌落涂片时，先取生理盐水 l 滴，置玻片上， 用接种针挑取菌落，在盐水中涂布。涂片时必须注意应轻轻操作。猛烈的动作 会改变菌细胞原有的排列形式，或造成细菌鞭毛脱落，影响结果的准确性。制 备的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定温度不宜过高，以玻片背面接触手 背不烫为准，否则可能使细胞形态改变。将固定后的涂片进行染色。 2.1、革兰染色 本染色是最基本的染色法，可用于标本涂片或菌落涂片。染色结果将细菌 分为革兰阳性(紫色)和革兰阴性(红色)两类。 2.1.1、试剂 (1) 结晶紫溶液 A 液： 结晶紫 2g 95乙醇 20ml B 液： 草酸铵 0.8g 蒸馏水 80ml 需在用前 24h 将 A 液、B 液混合，过滤后装入试剂瓶内备用。 (2) 碘液 碘 lg 碘化钾 2g 蒸馏水 300ml 碘与碘化钾混合并研磨，加入几毫升水，使其逐渐溶解，然后研磨，继续 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 9 加入少量蒸馏水至完全溶解。最后补足水量。 也可用少量蒸馏水，先将碘化钾完全溶解，再加入碘片，待完全溶解后， 加水至 300ml。 (3) 脱色液：95乙醇。 (4) 复染液 A 贮存液：沙黄 2.5g 95%乙醇 100ml B 应用液： A 液 10ml 蒸馏水 90ml 染色方法： (1)涂片经火焰固定，加结晶紫液染 1 min，清水冲去染液。 (2)加碘液染 1 min，水洗。 (3)加脱色液，不时摇动约 1030s，至无紫色脱落为止，水洗。 (4)加复染液，染 30s，水洗。 (5)干后镜检。 2.2、抗酸染色 抗酸染色直接用于痰标本时，可以适当增加标本涂片的厚度，以提高检出 率。染厚涂片时，须掌握复染色时间。如果背景过深，影响镜检。 奴卡菌及放线菌可呈弱抗酸性，取培养菌落涂片染色时，呈现两种现象， 视野中有些菌阳性，另外一些则阴性；有时同一个菌体上，红色的深浅亦有不 同，观察时应予注意。 试 剂 (1)、石炭酸复红溶液 碱性复红乙醇饱和溶液 10ml 5石炭酸溶液 90ml (2)、脱色剂 浓盐酸 3ml 95%乙醇 97ml (3)、复染液(吕弗勒美蓝液) 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 10 美蓝乙醇饱和溶液 30ml 10氢氧化钾 0.1m1 蒸馏水 100ml 染色方法 (1)、涂片经火焰固定，加石炭酸复红溶液，徐徐加热至有蒸汽出现，切不 可沸腾，持续约 5 min（若染色奴卡菌需要加长时间） ，水洗。 (2)、加脱色剂，不时摇动玻片至无红色脱落为止，水洗。 (3)、加复染液，染 0.5l min，水洗。 (4)、干后镜检。分枝杆菌呈红色，背景为蓝色。 注：奴卡菌、放线菌标本染色时，脱色剂改用 2硫酸水溶液。 2.3、墨汁荚膜染色 用于观察菌体有无荚膜结构，借此鉴定某些菌，如新型隐球菌。 传统的方法是用印度墨汁，但目前国内无售。常规工作可以用墨汁或墨水 代替，但应注意颗粒不能太粗，否则影响观察结果。有人用 5黑色素水溶液 做染料，效果较好。 试 剂 印度墨汁或 5黑色素水溶液。 染色方法 将标本与 1 滴染色液在载玻片上混合，加上盖玻片，轻轻压一下，使标本 混合液变薄。在低倍镜下寻找有荚膜的菌细胞。找到后，转换高倍镜确认。 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 11 细菌生化反应鉴定及其它试验操作规程细菌生化反应鉴定及其它试验操作规程 1、氧化-发酵试验(O-F 试验) 原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型。 可以进行无氧降解的，称为发酵型(发酵型细菌在有氧无氧的条件下均能分解葡 萄糖)。不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。 方法：将待检细菌同时穿刺接种两支 Hugh-Leifson 培养基，其中一支培养 基滴加无菌石蜡(或其它矿物油)，高度不少于 lcm。35，24 小时或更长。 结果：培养基变黄表示细菌分解葡萄糖产酸，两支培养基均无变化为产碱 型或不分解糖型；两支培养基均均产酸为发酵型。若仅不加石蜡的培养基产酸 为氧化型。 应用：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵细菌的鉴别，前者均为发酵型，而 后者均为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌问的鉴别。 2、-半乳糖苷酶(ONPG)试验 原理：细菌产生半乳糖苷酶，分解邻-硝基酚 -D-半乳糖苷(无色)生成邻- 硝基酚(黄色)。 结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在 20-30 分钟内显色。 应用：主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。 3、七叶苷水解试验 原理：有的细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中的 枸橼酸铁的二价铁离子反应，生成黑色的化合物。 结果：培养基变黑为阳性，不变色为阴性。 应用：主要用于 D 群链球菌与其它链球菌的鉴别。前者为阳性，后者为阴 性。也可用于革兰阴性菌与厌氧菌的鉴别。 4甲基红试验 原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步 分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基 pH 值降至 4.5 以下，加入甲基红呈 现红色为阳性。若细菌分解葡萄糖产生的酸少，或产生的酸进一步转化为其他 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 12 产物，则培养基 pH 值仍在 6.2 以上，加入甲基红呈现黄色为阴性。 结果：呈现红色为阳性，橘红色为弱阳性。黄色为阴性。 应用：主要用于鉴别大肠杆菌与产气杆菌，前者阳性，后者阴性。此外肠 杆菌科中变形杆菌属、沙门菌属、枸橼酸杆菌属和志贺菌属等阳性，而肠杆菌 属、哈夫尼亚菌属则为阴性。 5、VP 试验 原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸脱羧产生乙酰甲基甲醇， 乙酰甲基甲醇在碱性环境中，氧化为二乙酰，与精氨酸中的胍基作用生成红色 化合物。 结果：在数分钟内出现红色为阳性，如无红色出现且于 354h 后仍如故者 即为阴性。 应用：本试验与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的细菌，后者通常为 阴性。 6、吲哚(靛基质)试验 原理：细菌分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚(靛基质)，加入对位二甲基苯 甲醛生成红色玫瑰吲哚。 结果：于两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。 应用：主要用于肠杆菌科的鉴定。 6、尿素分解试验 原理：具有尿素酶(尿酶)的细菌，分解尿素产生大量的氨，培养基变碱。 结果：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变色为阴性。 应用：主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定，奇异变形杆菌、普通 变形杆菌为阳性，克雷伯菌属、枸椽酸菌属、雷氏普罗威登菌和摩根摩根菌为 阳性。 7、苯丙氨酸脱氨酶试验 原理：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶使苯丙氨酸脱氨生成苯丙酮酸，加 入 FeCl3生成绿色化合物。 结果：出现绿色为阳性，应立即观察结果，延长会引起退色。 应用：主要用于肠杆菌科的鉴定，变形杆菌属、普罗威登斯菌和摩根摩根 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 13 菌均为阳性。肠杆菌科其它菌均为阴性。 8、氨基酸脱羧酶试验 原理：具有氨基酸脱羧酶的细菌，分解氨基酸脱羧生成胺和 CO2使培养基 变碱，指示剂改变颜色。 结果：对照管应呈黄色，测定管呈紫色(指示剂为溴甲酚紫)为阳性。 应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。 9、氧化酶试验 原理：氧化酶是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌， 首先使细胞色素 C 氧化，再由氧化型细胞色素 C 使对苯二氨氧化。生成有色醌 类化合物。 结果：细菌在与试剂接触 10 秒内呈紫色为阳性。为保证结果准确性，应作 阴、阳性对照。 应用：主要用于肠杆菌科与假单胞菌的鉴别，前者为阴性。后者为阳性。 10、过氧化氢酶试验(触酶试验) 原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而 形成分子氧出现气泡。 试剂：3过氧化氢溶液 方法：取菌置于洁净的试管或玻片上，然后滴加 3过氧化氢数滴；或直 接滴加 3过氧化氢于不含血液的细菌培养基中，立即观察结果。 结果：有大量气泡产生为阳性。不产生气泡为阴性。 应用：革兰阳性球菌中，葡萄球菌和微球菌均阳性。而链球菌均阴性。 1l、硝酸盐还原试验 原理：包括两个过程：一是在合成过程中，硝酸盐还原为亚哨酸盐和氨。 再由氨转化为氨基酸和细菌内其它含氮化合物。二是在分解代谢过程中，硝酸 盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的受氢体，能使硝酸盐还原的细菌从哨 酸盐中获得氧而形成亚硝酸盐和其它还原性产物。 结果：出现红色为阳性。若加入试剂后无颜色变化反应，可能是硝酸盐 没有被还原，试验阴性。硝酸盐被还原为氨和氮等其它产物而导致假阴性， 这时应加入少许锌粉，如出现红色则表明试验确实为阴性。若仍不产生红色， 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 14 表明为试验为假阴性。 应用：本试验在细菌鉴定中应用广泛。 12、氧化酶(改良法)试验 试剂： 四甲基对苯二胺(TMPD) 6.0g 二甲基亚砜(DMSO) 100.oml 溶解 TMPD 于 DMSO 中，置于避光玻塞瓶中，可在室温中保留几个星期。 方法：被检菌株移种于 7羊血琼脂上，30需氧条件下孵育 1518h，刮 取菌落涂布于无色滤纸片上，加 l 滴上述试剂，阳性者在 2min 内呈深蓝色。 若被测菌株移种在蛋白胨酵母浸出液琼脂上，至少孵育 3 天以上，才可检 测，阳性反应 510min 出现。 13、CAMP 试验 原理：B 群链球菌能产生 CAMP 因子，可促进葡萄球菌的 -溶血素溶解 红细胞活性，因此在两菌的交界处溶血力增加。出现矢形(半月形)的溶血区。 结果：在两划线交界处出现箭头样的溶血区为阳性 应用：在链球菌中，只有 B 群链球菌 CAMP 试验阳性。 14、O/129 抑菌试验 原理：O/129(二氨基喋啶)对弧菌属、邻单胞菌属细菌有抑制作用，而对气 单胞菌无抑制作用。 方法：将待检菌均匀涂布于碱性琼脂平板上，镊取 O/129 纸片(含药 40ug) 贴于平板上，35，1824h，观察结果。 结果：出现抑菌环为敏感，无抑菌环为耐药 应用：弧菌属、邻单胞菌属对 O129 敏感，而气单胞菌属耐药 15、杆菌肽试验 原理：A 群链球菌对杆菌肽几乎全部敏感，而其它链球菌绝大多数对其耐 药。 16、奥普托欣试验 原理：几乎所有的肺炎链球菌对 Optochin 敏感，而 Optochin 对其它链球菌 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 15 则无抑制作用 17、 H2S 试验 原理：有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸(如胱胺酸、半胱胺酸)产生 硫化氢，硫化氢遇到铅或亚铁离子，则生成黑色的硫化铅或硫化铁。 结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性。 应用：主要用于肠杆菌科属或种的鉴定。 18、触酶试验(过氧化氢酶试验) 试剂：3%H202溶液，置棕色瓶内于 4阴暗处保存。 方法：先挑取固体培养基上的菌落，置于洁净的玻片上，然后滴加 3过 氧化氢溶液 12 滴。静置之，lmin 内产生大量气泡的为阳性，不产生气泡的为 阴性。 19、葡萄球菌凝固酶和凝聚因子试验 葡萄球菌凝固酶试验被广泛地用于常规鉴定金黄色葡萄球菌与其他葡萄球 菌。试管法凝固酶试验称为葡萄球菌凝固酶，玻片法为检测凝聚因子。 19.1 凝聚因子试验：取 1 滴蒸馏水于洁净的玻片上，用接种环挑取待检菌 一环置于蒸馏水中，制成浓的菌悬液，无自凝现象。然后加一环家兔血浆混合， 10s 内观察结果，出现明显细菌凝块为阳性，否则为阴性。如超过 10s 可出现假 阳性，有 1015金黄色葡萄球菌呈假阴性，因此必须用试管法验证凝聚因 子试验。 操作过程中的注意点： (1)10s 内观察结果。 (2)必须制备浓厚的均匀菌悬液。 (3)用 EDTA 抗凝的兔血浆为最好。 (4)加血浆后不要再混搅，以免细菌凝块分散变小。 (5)生长在高盐培养基上的菌落可出现自凝或假阳性。 19.2 葡萄球菌凝固酶试验：用生理盐水将血浆 4 倍稀释，取 0.5ml。然后挑 取 35 个菌落于稀释血浆中，成浓菌悬液。置 37水浴，34h 后读取结果， 凝固者为阳性。若阴性，继续观察到 24h，不凝固者为阴性。试验应同时作阳 性、阴性对照。 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 16 试管法葡萄球菌凝固酶试验阳性者，应见到明显的纤维蛋白凝胶块，出现 羊毛状或纤维状沉淀物并非真正凝固，应判为阴性。中间型葡萄球菌、猪葡萄 球菌需要较长时间孵育，才可出现阳性。凝固酶试验应考虑下述情况： 某些金黄色葡萄球菌产生溶纤维蛋白酶，溶解纤维蛋白凝块。 所用血浆缺乏纤维蛋白原。 试验菌株不纯。 结果：玻片法以血浆中有明显的颗粒出现而盐水中无自凝现象判为阳性； 试管法以血浆凝固为阳性。 应用：作为鉴定葡萄球菌致病性的重要指标，也是葡萄球菌鉴别时常用的 一个试验。 20、新生霉素耐药试验 方法：挑取待检菌菌落数个，制成相当 0.5 号麦氏管(McFarland)浓度菌液， 棉拭子浸透，挤去多余液，均匀涂在 M-H 平板上，贴上含 5ug片的新生霉素 纸片，35孵育 1620h，抑菌环直径16 为阳性(耐药)。试验时应以金黄色 葡萄球菌 ATCC25923 做阴性(敏感)对照，以确认纸片是否有效。 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 17 细菌的接种与培养方法操作规程细菌的接种与培养方法操作规程 一、细菌的接种 根据待检标本的来源、培养目的及所用培养基的性状，采用不同的接种方 法。 l、平板画线分离法 （1） 、连续画线分离法此法主要用于杂菌不多的标本。用接种环取标本少 许，于平板 l/5 处密集涂布，然后回来作曲线连续划线接种，线与线间有一定距 离，划满平板为止。 （2） 、分区画线分离法此法适用于杂菌较多的标本。先将标本均匀涂布于 平板边缘一小区 (约占平板 1/5)，再在二、三区依次连续画线，每画线一区均 将接种针灭菌一次。每一区的划线均接触上一区的接种线 12 次。以获得单个 菌落。 2、斜面接种法 该法主要用于单个菌落的纯培养。用灭菌接种针取菌少许，从培养基斜面 底部向上划一直线，然后从底部向上作连续曲线画线。一直画到斜面顶端。 3、液体接种法 多用于一些液体生化试验管的接种。用灭菌接种环取菌少许，在试管内壁 与液面交接处的管壁上轻轻研磨，使细菌混合于液体中。 4、穿刺接种法 主要用于半固体培养基、明胶及双糖铁的接种。用接种针取菌少许，从半 固体培养基中央，平行于管壁垂直刺入，接近管底但不可接触管底，然后接种 针原路退出。 5、倾注平板法 临床上主要用于尿液等标本的细菌计数。将标本经适当稀释后，取一定量 加入已灭菌的平皿内，倾入已经溶化并冷却至 45左右的定量培养基，混匀， 待凝固后倒置、培养。 6、涂布接种法 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 18 常用于纸片药物敏感性测定，也可用于被检标本的细菌计数。加定量的被 检菌液于琼脂平板表面，然后用灭菌的棉签反复涂布几次，使被检菌均匀分布 在琼脂平板表面。然后贴上药敏纸片培养，或直接培养观察结果。 二、细菌培养方法 根据临床初步诊断及待检细菌的种类，可选用不同的环境进行培养。常用 的有需氧培养法、二氧化碳培养法和厌氧培养法。 1、需氧培养法 本法是临床细菌室常用的培养方法，即将已经接种好的平板、斜面和液体 培养基等。置于 35温箱中孵育 1824 小时。 2、二氧化碳培养法 本室用 CO2孵箱将已接种好的培养基置于 CO2孵箱内培养。 三、分离及纯化法 3.1、分离是指从原材料或多种细菌的混合培养物中将各种细菌彼此独立地 分离开，以得到纯的单一菌株，技术步骤如下： 作纯培养分离时，一般只用一只完整的琼脂平板。涂划多采用分区划线法， 在一只平板中可划 35 个区。划法有两种： 3.1.1、从临床标本分离细菌所含菌数相对较少时，可用接种环取标本涂布 在平板一角边缘，然后从此区开始划线至 13 平板，为第一区，再在 2、3 区 依次划线，每划完一个区域均将接种环灭菌一次，冷却后再划下一区域，每一 区域的划线均接触上一区域的接种线 12 次，使菌量逐渐减少以获得单个菌落。 3.1.2、快速划线分离法：采用快速划线使一接种环标本能分离出单个菌落， 这与标本的菌量及操作者的技能有很大关系。 3.2、纯化是指欲获得大量纯培养物的方法，所用平板大小可根据需要的菌 量而定。方法是将一单个菌落或将相同的菌落作大量密集涂划于平板上而获得 大量纯的培养物。 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 19 支原体培养、鉴定及药敏操作规程支原体培养、鉴定及药敏操作规程 1原理及依据标准： 支原体分离鉴定培养基用于泌尿生殖道支原体(解脲支原体 Uu 和人型支原 体 Mh)的检测与诊断。当有 Uu 和 Mh 生长，分解尿素和精氨酸引起 PH 上升， 使以酚红为指示剂的培养基由黄转红。依据珠海迪尔生物工程有限公司生产的 试剂盒说明书。 2标本的采集： 2.1、男性：用特别细的无菌棉拭子沾取无菌生理盐水少许深入尿道口内 22.5cm 处取分泌物，前列腺液亦可用沾取无菌生理盐水的无菌棉拭子尽量多 的沾取。 2.2、女性：用沾取少许无菌生理盐水的棉拭子取宫颈内口 12cm 处单层 柱状上皮细胞，取样拭子不可碰阴道壁。 2.3、支原体对干、热抵抗力差，标本采集后应立即送检。整个采样过程应 注意无菌操作。 3、标本接种：(本实验应注意无菌操作，避免污染杂菌) 3.1、取出培养基，放置接近室温，并在瓶盖上编号。 3.2、将采集的标本拭子插入培养瓶中，在靠近液面上方的瓶壁挤示压旋转 拭子数次，使拭子中标本渗入到肉汤中：若为液体标本，取 200 u 1 加入培养基 中；若为中段尿，经 3000 转分离心 15 分钟取沉渣 100ul 加入培养基中。 3.3、盖上瓶盖，置 3537孵箱，在 2448 小时分别观察结果。 4、结果判读： 培养基变红，判断阳性，培养基黄色并清亮，判断阴性。 5、已检标本处理：密闭容器高压灭菌后，按医用垃圾处理。 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 20 血液感染病原体检验操作规程血液感染病原体检验操作规程 1、标本采集 (1)、采集时间和次数血标本一般应在病人发热初期或根据不同的发热情况 在未用抗生素前采集做细菌培养，提高阳性率需连续三次采血进行培养。 (2)、采血部位及抽血量一般抽取肘静脉血。采血量为成人 510ml，儿童为 35ml。 (3)、结果观察：培养 72 小时后若肉眼或自动血液培养仪报告仍未细菌生 长，则盲目移种一次，仍未细菌生长，向临床发出一级初级报告：“血液经 72 小时培养无细菌生长” ，为避免漏诊，应在培养 5 天、7 天时再作盲目移种培养。 疑为亚急性细菌性心内膜炎、真菌血症等时，血培养至少连续培养 23 周，仍 无细菌生长方可报告为阴性。 2、检验程序 血液标本（无菌采集） 72h 盲目移种 （初级报告） 有细菌生长 涂片、染色、镜检需氧培养、CO2 培 养 直接药敏试验 观察菌落 涂片、染色、镜检纯培养 血清学鉴定、生化反应试验、药敏试 验 确认报告 初步报告 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 21 3、血培养瓶中不同表现为不同细菌生长： 浑浊并有凝无块 均匀浑浊，发酵葡萄糖产气 微浑浊，有绿色变化 表面有菌膜，培养基清晰，底层容血 表面有菌膜，膜下有绿色浑浊 血细胞层上面有颗粒状生长，自上而下的溶血 金黄色葡萄球菌 多为革兰阴性菌 肺炎链球菌 枯草杆菌 铜绿假单胞菌 溶血性链球菌 4、血液及骨髓标本中常见病原菌 革兰阳性菌 革兰阴性菌 肺炎链球菌 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 伤寒及其它沙门菌 表皮葡萄球菌 变形杆菌 溶血性链球菌 产气肠杆菌 粪肠球菌 肺炎克雷伯氏菌 铜绿假单胞菌 粪产硷杆菌 沙雷氏菌 流感嗜血杆菌 布鲁氏菌 5、报告结果 血培养阳性均作为危急值报告，所以血培养的结果应及时通知临床医生， 每日开始工作可以首先检查血培养，如有细菌生长，立即处理。 5.1、疑有细菌生长者，经涂片、革兰氏染色、镜检后，电话通知主治医生， 报告“疑有革兰氏菌生长” 。并做药敏试验，报告初步结果。 5.2、经分纯培养完成鉴定及药敏试验，发出报告。 5.3、培养 7 天仍为阴性的标本，报告无细菌生长。 临床上诊断为亚急性细菌性心内膜炎者，可持续培养至两周再发阴性报告。 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 22 中枢神经系统感染病原体检验操作规程中枢神经系统感染病原体检验操作规程 l、标本采集 以无菌方法采集脑脊液 25ml，盛于无菌瓶中送检。 2、直接检查 脑脊液可直接涂片、革兰染色或抗酸染色等，然后镜检。无 色透明的脑脊液，应作离心取沉淀物涂片、染色镜检。 3、检验步骤： 3.1、一般细菌涂片检查除结核性脑膜炎外，由其它细菌引起的化脓性脑膜 炎，脑脊液明显混浊，可直接涂片，革兰染色镜检。无色透明的脑脊液，应离 心后涂片、染色、镜检，根据染色及形态特征可初步提示细菌的种类。结核分 枝杆菌涂片检查：取脑脊液的离心沉淀物(3000rmin。30min)作抗酸染色。新 型隐球菌涂片检查：取脑脊液的离心沉淀物作墨汁负染色。 3.2、分离培养用接种环挑取混浊脑脊液或经离心沉淀的沉淀物，分别接种 于血平板、巧克力平板，巧克力平板应置于 CO2环境中 35培养 1824 小时。 脑脊液也可直接注入血培养瓶。 4、检验程序 生化鉴定、血清学鉴定 药敏试验 报告初步报告 结核分枝杆菌 新生隐球菌等 一般细菌 脑膜炎奈瑟菌 抗酸染色革兰染色 动力试验 墨汁染色 沙氏培养基、血平板 血平板、巧克力平板 （5%CO2环境）染色标本不染色标本 分离培养直接涂片（取离心沉淀） 脑脊液 一般细菌 脑膜炎奈瑟菌 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 23 5、脑脊液培养常见病原菌 革兰阳性菌 革兰阴性菌 金黄色葡萄球菌 脑膜炎奈瑟菌 A、B 群链球菌 卡他布兰汉菌 肺炎链球菌 流感嗜血杆菌 结核分支杆菌 肠杆菌科菌种 产单核李斯特菌 脑膜败血性黄杆菌 新型隐球菌 假单胞菌 白色念珠菌 6、报告结果 无论是涂片还是培养，一但见到阳性菌应立即通知临床医师。培养并经鉴 定的结果报告“菌” ，同时报告药敏试验结果。 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 24 下呼吸道感染病原体检验操作规程下呼吸道感染病原体检验操作规程 1、标本的采集 有自然咳痰法、咽拭子采集法、支气管镜下采集法及分泌物标本。 2、标本的直接检查 (1)、将痰标本涂片后待干，固定、染色，或直接湿片镜检，对病原学早期、 初步诊断有重要意义。并向临床发出初级报告。 (2)、一般认为合格的痰标本为：以白细胞25 个/低倍镜视野，而上皮细 胞10 个/低倍镜视野。采集合格标本对细菌的诊断尤为重要。 3、分离培养与鉴定 (1)、一般要求下呼吸道感染培养的细菌浓度应107CFU/ml，可视为病原菌， 104CFU/ml 可视为污染菌。若介于两者之间 105106CFUml 时，要连续分离 培养两次以上仍为 105106CFUml 时，亦认为是病原菌。 (2)、检验程序 分离培养 血平板、麦康凯平 板 涂片、染色、镜检 痰液及下呼吸道分泌物 报告 鉴定试验、药敏试 验 纯培养细菌 菌落观察初步报告 涂片、染色、镜检 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 25 4、下呼吸道标本培养常见病原菌 革兰阳性菌 革兰阴性菌 金黄色葡萄球菌 脑膜炎奈瑟氏菌 化脓性链球菌 流感嗜血杆菌 肺炎链球菌 肠杆菌科细菌 结核分支杆菌 非发酵菌 白喉棒状杆菌 嗜肺军团菌 假丝酵母菌 5、报告结果 痰中的病原菌不少属于机会致病菌，与正常菌群同时存在，报告时应作说 明，未检出致病菌时，应报告“无致病细菌生长” 。 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 26 尿路感染病原体检验操作规程尿路感染病原体检验操作规程 1、尿液培养常见病原菌 革兰阳性菌 革兰阴性菌 金黄色葡萄球菌 淋病奈瑟菌 肠球菌 大肠埃希菌 A 群链球菌 变形杆菌 腐生葡萄球菌 肺炎克雷伯菌 表皮葡萄球菌 产气肠杆菌 结核分支杆菌 沙门菌种 铜绿假单胞菌 沙雷菌 2、标本收集 2.1、尿液标本的采集可采用多种方法：有中段尿采集法、膀胱穿刺法、肾 盂尿采集法，而常规是取中段尿作细菌培养。 2.2、取中段尿作培养时先要进行前尿道的清洗消毒，以免前尿道寄生菌群 污染标本。 2.3、如采用其他方法收集标本，必须由临床医生根据临床诊断需要而执行 收集术，并在检验单上写明。 3、检验步骤 3.1、涂片检查 3.1.1、一般细菌及淋病奈瑟菌涂片：以无菌操作吸取尿液 10ml，3000r/min 离心 15min，去上清液，取沉淀涂片，革兰氏染色镜检，作初步报告。如查见 革兰氏阴性双球菌，呈肾形位于细胞内或细胞外，报告“找到革兰阴性双球菌， 存在于细胞内外，形似淋病奈瑟菌” 。如未查见上述细菌可报告“未发现革兰阴 性双球菌” 。 3.1.2、念珠菌涂片：取尿液沉淀物放于清洁玻片上，覆以盖玻片，制成涂 片，用高倍镜检查。革兰染色后，如发现发亮的芽生孢子和假菌丝，就可报告 “霉菌孢子及菌丝” 。 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 27 3.1.3、结核分枝杆菌：取尿液 10ml，4000r/min 离心 30min，取沉淀物涂片， 抗酸染色，镜检。如找到红色杆菌，可报告“查到抗酸杆菌” 。 3.2、一般细菌培养(细菌计数)：用定量接种环取尿液 10 u l 接种血平板， 35培养 1824 小时，观察有无细菌生长，并计数菌落数，乘以 1000，求出 每毫升尿液的菌落数。根据菌落特征、涂片染色结果，进行鉴定和药敏试验， 如培养 48 小时无菌生长，即报告“无细菌生长” 。 3.3、特殊菌培养：淋病奈瑟菌培养，选用专用巧克力琼脂平板，接种后放 入二氧化碳环境中培养。 4、检验程序 5、结果报告： 5.1、尿液细菌培养检查必须报告细菌的种属、菌落计数(cfu/m1)及药敏结 果。 5.2、革兰氏阴性菌落计数大于 105cfu/ml，革兰氏阳性菌计数大于 104cfu/ml，真菌大于 103cfu/ml 有诊断意义。 5.3、一般常规结核培养要 8 周方能报告。阳性结果可提前报告。但不做菌 落计数只报告“抗酸杆菌生长”的报告，如做了进一步的分型和鉴定，才能报 分离培养淋病奈瑟菌培养 报告 鉴定、药敏试验涂片染色镜检 血平板、麦康凯平 板 离心、沉淀涂片染 色 （革兰及抗酸染色） 尿标本 初步报告 专用巧克力培养基 （5%10%CO2，35, 1824h） 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 28 告“有型结核杆菌生长” 。 5.4、用专用培养基培养淋球菌经鉴定可直接报告“有淋球菌生长”但不做 菌落计数，如涂片发现细胞内或外有革兰氏阴性双球菌可报告“发现革兰阴性 双球菌” 。 5.5、如尿液培养同时有三种或以上细菌生长时，可视为污染标本，建议重 留送检。 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 29 消化道感染病原体检验操作规程消化道感染病原体检验操作规程 1、粪便标本中常见病原菌 革兰阳性菌 革兰阴性菌 金黄色葡萄球菌 伤寒及其它沙门菌 结核分支杆菌 志贺菌属 难辨梭菌 致病大肠埃希菌 白色念珠菌 (ETEC、EPEC、EIEC、EHEC) 弧菌属菌种 气单胞、邻单胞菌种 小肠结肠炎耶尔森菌 弯曲菌 2、标本采集 2.1、自然排便采集法：自然排便后，挑取脓血、粘膜部分的粪便 23g， 液体粪便取絮状物置于大便培养管或增菌液中送检。 2.2、直肠肛管法：用大便培养用的肛管直接插入肛门成人 45cm，幼儿 23cm，轻轻在直肠内旋转数次，目的是使直肠表面粘液能通过肛管孔进入肛 管内。然后拔出放入大便培养管中送检。 3、检验步骤 3.1、涂片检查粪便标本因各种正常菌群含量甚多而一般不作直接涂片找致 病菌，只有怀疑霍乱弧菌及菌群失调所致腹泻时，才作直接涂片检查。 3.2、各项的涂片检验均按染色方法进行，但大便检查霍乱弧菌的处理程序： 3.2.1、染色检查：将米泔样的标本涂 2 张片用乙醇固定后染色，观察弧菌 有无呈鱼群状排列。 3.2.2 悬滴检查：取患者粪便制成悬滴涂片，霍乱弧菌古典型和 EL-Tor 型 均呈现极活泼的穿梭状运动。 3.2.3 制动检验：运动活泼的弧菌涂片加人霍乱弧菌诊断血清后，在显微镜 下观察，若原运动活泼的现象停止，为制动试验阳性。 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 30 3.3、大便标本的培养目的是培养致病菌或追踪病人有否菌群失调现象，无 特殊要求作一般致病菌培养的标本接种麦康凯、SS 平板各一个。 3.4、菌群失调的细菌学检验：选用多种培养基包括 SS、麦康凯、血平板、 高盐甘露醇盐琼脂平板、Campy-BA 血琼脂平板和沙氏琼脂等，目的是使更多 的菌群得到生长，以利于检查肠道的细菌情况。 3.5、霍乱弧菌的培养：直接取患者米泔样粪便 0.5ml，接种于碱性蛋白胨 水增菌液和 4 号平板，35培养 68h，再转种一只 4 号平板。35 培养 1824h 后形成较大、菌落中间为灰黑色、有光泽、隆起、湿润的菌落，如泼 水状。挑取可疑菌落 510 个与霍乱多价“O”血清作凝集试验。 诊断血清作玻片凝集试验，如为阳性，则立即报告，并将可疑菌送疾病控制 中心确认。 3.6、真菌培养：真菌性腹泻多继发于抗生素治疗后，常见的真菌腹泻多由 白色假丝酵母菌引起。将标本接种于沙氏平板及血平板上，置 27和 35培养 1824h，根据形态染色、菌落特征，做真菌鉴定和药敏试验。 4、检验程序 5、结果报告 粪便培养的报告方式应以分离目的菌种的结果而定，如：目前常规以 SS 培养 基分离粪便中的致病菌，阳性者应报告“检出沙门菌或检出志贺菌” ，阴性者报 报告 鉴定、药敏试验涂片检查 菌落观察 观察动力革兰氏染色 SS、麦康凯平板 沙氏平板、血平板等 沙门氏菌、志贺氏 菌 霍乱弧菌 涂片检查分离培养增菌培养 便或肛拭子 细菌室操作规程 细菌室操作程序文件 31 告“未检出沙门菌或未检出志贺菌” 。其他培养结果报告方式与上述原则相同。 脓汁及病灶分泌物细菌学检验操作规程脓汁及病灶分泌物细菌学检验操作规程 1、脓汁及病灶分泌物培养常见病原菌 革兰阳性菌 革兰阴性菌 葡萄球菌 肠