白血病免疫分型讲课.ppt

正常血细胞从多能干细胞分化、发育、成熟为功能细胞的过程中，细胞膜、细胞浆或胞核抗原的出现、表达增多与减少甚至消失与血细胞的分化发育阶段密切相关，而且表现出与细胞系列及其分化程度相关的特异性。因此，这些抗原的表达与否可作为鉴别和分类血细胞的基础。 白血病是造血系统的恶性肿瘤，在形态上变化虽相当大，但仍能表达正常血细胞所具有的抗原，因而仍可依据其抗原的表达谱对白血病进行免疫分型。由于白血病细胞具有肿瘤细胞的特征，其抗原表达又不完全同于正常血细胞，常可出现某些抗原缺乏、过度表达、系列交叉表达某一系列或阶段不应有的抗原，这又增加了白血病免疫分型的复杂性。白血病/淋巴瘤的免疫分型已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重要标准之一。,早年曾用过的荧光显微镜或APAAP方法基本被废弃。国际上公认的通用的方法是流式细胞术（FCM）。流式细胞术（FCM）白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体（McAb）作分子探针，多参数分析白血病细胞的细胞膜和细胞浆或细胞核的免疫表型，由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。因为FCM能快速，多参数，客观的定性又定量测定细胞膜，浆，核的抗原表达。 另一个重要理由是至今尚未发现白血病/淋巴瘤的特异抗原。所以能用正常血细胞的单抗来进行免疫分型是基于白血病形成的分化阻断学说即白血病细胞基因异常，分化受阻于某阶段形成不同亚型的白血病。这群细胞充盈于骨髓。抗原表达与其相应系列/阶段的血细胞无明显差异。与形态学检查相似仅能根据数量的差异来判断病变细胞的属性。,单参数免疫标志测定易将正常细胞包括在内。因此，近年来主张用设门（gating）方法。即用CD45与侧向角（side scatter,SSC），对数取样后可将骨髓细胞清晰地分出淋巴细胞，单核细胞，成熟粒细胞，幼稚细胞和红细胞群，其理论依据是CD45是所有白细胞的抗原。其表达量在淋巴细胞最高，单核细胞，成熟粒细胞，早期造血细胞（blasts）依次减弱。红细胞（中，晚幼红细胞，成熟红细胞）不表达CD45。SSC反映细胞的颗粒性，成熟粒细胞SSC最高，依次为单核细胞，淋巴细胞，blasts，红细胞。以CD45/SSC双参数，对数取样时即可把各细胞群区分出来。若同时加上一个，二个甚或三个荧光标记的单抗，则很容易识别非正常细胞群所表达的抗原。这样可以排除正常细胞的干扰。在幼稚细胞低的情况下或检测残存白血病时尤为必要 FCM分析白血病免疫表型时，测量细胞数量一般在1000050000细胞之间，而且快速、特异、准确，重复性好，能区分细胞起源、划分其分化发育阶段等，对白血病的诊断与分型、治疗方案选择与预后判断、发病机理研究等有重要价值。,一 白细胞分化抗原,白细胞分化抗原（leukocyte differentiation antigen，LDA）指血细胞在分化成熟为不同谱系（lineage） 、分化的不同阶段及细胞活化过程中，出现或消失的细胞表面标记。 它们大都为跨膜分子，由胞外区、跨膜区和胞浆区组成；有些以糖基磷脂酰肌醇（GPI）“锚”在细胞膜上； 它们大都是蛋白或糖蛋白，少数为碳水化合物,二 CD的概念、CD分子的分 类、功能及应用,CD：用以单克隆抗体鉴定为主的聚类分析法，将来自不同实验室的单克隆抗体所识别的同一分化抗原归为一个分化群（Cluster of differentiation，CD）。并以此代替分化抗原以往的命名。 在许多情况下，单克隆抗体及其识别的相应抗原都用同一个CD序号。 迄今为止，人CD分子的序号已从CD1命名至CD371，可大致划分为14个组。,CD分子的功能： （1）免疫应答过程中参与免疫细胞的相互识别；免疫细胞识别抗原、活化、增殖和分化；免疫效应功能的发挥； （2）参与造血细胞的分化和造血过程的调控； （3）参与炎症的发生； （4）参与细胞的迁移如肿瘤细胞的转移等。,CD分子的临床应用 CD单克隆抗体可用于 （1）阐明某些疾病的发病机制； （2）广泛应用于多种疾病的免疫诊断； （3）治疗移植排斥反应和肿瘤等疾病；,CD20分子,结构与分布：单链跨膜蛋白，仅表达于B细胞， 早期即表达，分化为浆细胞后消失 功能： （1）参与和调节B细胞信号转导、生长和分化。 （2）直接参与调节跨膜Ca2+的流动。,三 免疫分型常用的免疫标志及其意义,白血病系列分化抗原,T淋巴细胞白血病：CD3、CD5、CD7。 B淋巴细胞白血病：CD10、CD19、CD22。 NK淋巴细胞白血病：CD16、CD56、CD57。 髓系白血病：CD13、CD14、CD33、MPO（髓过氧化物酶）。 红白血病：GlyA（血型糖蛋白A）。 巨核细胞白血病：CD41、CD42、CD61。,白血病系列非特异性抗原,CD34、HLADR为早期细胞抗原，无系列特异性，可与CD38联合运用于免疫分型。一般而言，干/祖细胞CD34、HLADR、CD38，原始细胞CD34、HLADR、CD38，而幼稚细胞（如早幼粒细胞）CD34、HLADR、CD38。,白血病分化阶段抗原,T细胞抗原：CD4、CD8。 B细胞抗原：CD10、Cy（胞浆链）、SmIg（表面膜免疫球蛋白）、CD38和CyIg （胞浆免疫球蛋白）、CD11C。,白细胞共同抗原,CD45为白细胞共同抗原，但原幼细胞表达量比成熟淋巴细胞低，幼红细胞不表达。用SSC/CD45 PerCP双参数分析可十分容易鉴别骨髓和血液中的原始或成熟细胞。用两个系列或阶段特异性McAb加CD45进行三色免疫荧光染色，经FSC、SSC、McAbl-FITC、McAb2-PE、CD45 PerCP五参数分析，可特异地分析原幼白血病细胞的免疫表型而不受成熟细胞的干扰。,四 白血病免疫分型,急性髓系细胞白血病,MO Mo blasts 有低的SSC和FSC。在CD45SSC图上出现在淋巴细胞位置上，至少表达一个特异性标志如CD13或CD116，但MPO比CD13与CD33更灵敏。一般淋系标志阴性，但也可表达CD7或CD4。 Mo blasts一般HLADR、CD34阳性，有些研究表明CD7与CD34共表达在AML且预后差。,M1 流式上M1与M0相似不易区分，M1一般CD13、CD33、HLADR，但CD34表达少于M0，可能表达部分CD15。 M2 M2与M1要区别是成熟度增加，blasts减少，CD15较M1较显著，CD34弱于M1，CD13有时表达强于CD33，多数病例HLADR（-）。CD45SSC图显示从髓系blast区至成熟骨髓细胞区的连续细胞带，CD45SSC图有助于确定blasts比例。,M3 高颗粒性，具较高的SSC，但CD45较成熟细胞少，多数情况HLADR（-）或表达减少，CD34少于M2、一般CD13弱（），可有CD2表达。,M4与M5 两型表型相似，但M4较M5表达更多的CD34（），较之M0、M1，M4与M5有更大的FSS和SSC，CD45SSC图上，成熟C出现在单核区，重要的表型为CD13、CD33、HLADR、CD14和CD15，CD33可表达强于CD13，CD33（）、CD13（）、CD34（）很可能为M5，但只出现在少数病人中，部分M5可见CD56（）。,M6 M6较少见且特征不明显，一般HLADR，CD34、CD13、CD33阳性，CD45SSC图显示主要为红系成份。 M7 巨核细胞白血病，在AML中少于1。一般CD61（Gpa）和/或CD41（Gpb-a）阳性，而注意由于血小板粘附在blasts上造成的假阳性，可以用流式双色分析在EDTA存在下，测pb/a与CD34以减少激活血小板的粘附。,急性淋巴细胞白血病,ALL是儿童中最常见的恶性肿瘤，约占全部肿瘤的25，在成人，ALL约占急性白血病的25，我们将ALL分为B祖细胞型，CD10或CD10，前B细胞型，B细胞型，T细胞型,B祖细胞型ALL：在幼儿约占ALL的6570，青少年为5560，人为50。在儿童，约90病例CD10，在幼儿只有少于50病例CD10，blasts一般FSC、SSC很少，是FAB标准的L1或L2，一般TdT(+)HLA-DR(+)，CD19(+)，此型又分为2个亚型，CD10和CD10，前者预后好，多数病例CD24，CD34，CD20表达随成熟度增加而增加，B祖细胞被定义为sIg-。,前B细胞型ALL：此亚型约占儿童ALL的25，细胞一般为CD19，CD24，HLADR，胞浆CD22，CD10，TdT随CD20变化，CD34多为阴性，前B亚型被认为比B祖型预后更差，这与t(1；19)出现相关并由此产生E2APBX1融合蛋白，它的表型为CD19、CD10、CD9，不同程度CD20表达，CD34，确认此表型有助于诊断基因上不确定的病例。,B细胞型ALL：成熟B细胞型ALL约占ALL25，B细胞型ALL较之B祖细胞型ALL有更大的FSC和SSC，在CD45SSC图上出现在淋巴和单核细胞区域，即FAB标准的L3，表型为CD19、CD20、CD22、CD24且sIg（多数为IGM）多数病例CD10。但成熟抗原及sIg使之区别于更早的B系ALL，极少数成熟B细胞ALL无FABL3形态。,T-ALL：多数病例有大的FSC、SSC，在CD45SSC图上可能出现在淋系未成熟细胞和髓系未成熟细胞或单核细胞区，多数表现为胸腺亚型，最常见亚型为皮质晚期表达，CD1、CD2、CD5、CD7、CD4/CD8双阳与极少膜表面CD3、TdT多为阳性。另一常见亚型为皮质早期表达CD2、CD5、CD7、TdT强表达。髓质期亚型表达CD2、CD5、CD7、与CD3CD4/CD3+CD8+,很少见TdT表达。前T细胞亚型，表达CD7