临床免疫学检查

临床免疫学检查,上海交通大学医学院 季育华 教授,范畴(category)：,1、感染性疾病(infection disease) 2、自身免疫性疾病(autoimmune ) 3、超敏反应性疾病(hypersensitivity ) 4、免疫缺陷/增殖性疾病 (immunoabnormal deficiency/proliferation) 5、肿瘤(tumour) 6、移植(transplantation),手段(measure)与目的(objective)：,应用免疫学的理论(theory)与技术 (technique)，研究疾病的病因(致病) (pathogenesis)、发生(occur)、发展 (develop)和转归(turn)，并对疾病进行 诊断(diagnosis)、疗效监测(curative effect monitor)和预防(prevent)。,内容(content)：,1、体液免疫检测(humoral) 2、细胞免疫检测(cellular ) 3、相关临床疾病的免疫检测 感染性疾病 自身免疫性疾病 超敏反应性疾病 免疫缺陷/增殖、肿瘤与移植,一、体液免疫检测(test),（一）血清免疫球蛋白检测 (human serum immunoglobulin ) （二）血清补体检测 (human serum complement ) （三）体液免疫相关其他检测 (others ),（一）血清免疫球蛋白检测,免疫球蛋白（Immunoglobulins, Ig） 是具有抗体活性或化学结构与抗体相似 的球蛋白。 可分为分泌型和膜型两种，前者主要 存在于血清等体液中，如Ab；后者称膜 型免疫球蛋白（membrane Ig，mIg）， 是B细胞膜上的抗原受体(receptor)。,抗体（antibodies, Ab）是B细胞识别 抗原后增殖分化为浆细胞所产生的，能 与相应抗原特异性(specific)结合 (recognize antigen and binding)并 发挥免疫功能(antigen and antibody reaction)的球蛋白。,所有抗体都是免疫球蛋白， 但免疫球蛋白不都是抗体。,临床检测的血清免疫球蛋白,健康人血清主要Ig含量(content)（g/L）,年 龄 IgG IgM IgA 新生儿 6.617.5 0.010.06 0.060.21 6个月 2.66.9 0.080.57 0.261.00 1 岁 3.09.5 0.140.91 0.371.50 2 岁 4.712.3 0.211.45 0.411.75 8 岁 6.315.0 0.462.51 0.472.20 12岁 7.015.5 0.582.91 0.492.40 18岁 7.315.5 0.703.21 0.512.61 成人 7.016.0 0.703.00 0.402.80,检测手段(method)：,(Precipitation Reaction),(In fluid phase),(In agar),（ring、immune-turbidity、et al）,（diffusion）,（electrophoresis）,(In fluid phase ) 絮状沉淀试验：,Ag,Ab,环状沉淀试验,透射免疫比浊：,（turbidimetry）,在直射角度上测定光的透射强度，以吸收光单位（A）表示， A值与复合物量呈正比。,散射免疫比浊（终点散射/速率散射）：,（nephelometry） 在光路的5-95角的方向上测量散射光强度和被测溶液中微粒浓度关系的一种方法。 散射光：一定波长的光线沿水平轴通过复合物的混合液时导致光散射，散射光的强度与复合物量呈正比。 测定抗原抗体反应达平衡时 ，终点（end） 测定单位时间内抗原抗体形成最大量时，速 率（rate）,临床意义（significance）：,1.血清多克隆Ig水平增高 患者血清中各型Ig均升高，常见于各种 感染特别是慢性(chronic)细菌感染，如肺结 核、慢性支气管炎、慢性肝病自身免疫性 (autoimmune)疾病。SLE患者以IgG、IgA升高 较多见，类风湿性关节炎IgM增高为主。,多克隆抗体(polyclonal antibody): 由不同的B细胞克隆产生的抗体. 单克隆抗体(monoclonal antibody): 由一个细胞克隆所产生的只识别单一 抗原决定簇的纯的抗体.,2.血清单克隆Ig水平增高 患者血清中出现异常增多的单克隆蛋白 （monoclonal protein，MP（即M蛋白）达 30g/L以上，而正常Ig包括与MP同类Ig的含量 则显著降低。此类异常增多Ig多无免疫活性, 主要见于免疫增殖性(immunoproliferative) 疾病，如多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM),原发性巨球蛋白血症(primary macro- globulinemia)、重链(heavy chain)病、轻 链(light chain)病等。,新生儿、婴幼儿由于体液免疫功能尚不成 熟，免疫球蛋白的含量较成人低，需按年 龄组进行分析与判断。 关于血清IgE和IgD的测定： 血清总IgE为0.130.92mg/L; 血清总IgD为0.62.0mg/L; IgE值升高多见于超敏反应性疾病,骨髓瘤 IgD值升高多见于骨髓瘤等。,异常免疫球蛋白检测：,M蛋白/（Monoclonal immunoglobulins ） 由一种单克隆B淋巴细胞异常增殖时产生的 具有相同结构和电场移动率的Ig分子或分子片段，一般不具有抗体活性,又称副蛋白（paraprotein）。 冷球蛋白（cryoglobulin） 指血清中一种蛋白，4不溶解，30易于 凝聚，37便溶解。存在于多种疾病，参 与炎症或免疫复合物引起的疾病。,M蛋白的检测（免疫固定电泳） (immunofixation lectrophoresis),操作：待检血清 + 抗血清IgG IgA IgM 链 链 I 抗原抗体对应沉淀 并被固定，染色等,结果(result)：,与M蛋白检测相关(related)疾病：,1、多发性骨髓瘤（multiple myeloma） 2、巨球蛋白血症（macroglobulinemia） 3、重链病（heavy chain disease） 4、轻链病（light chain disease） 5、半分子病（half-molecule immunoglobulin disease） 6、恶性淋巴瘤(malignant ) 7、良性M蛋白血症(benign ),例:,多发性骨髓瘤 （multiple myeloma,MM） 是浆细胞异常增殖的恶性肿瘤，也称浆细胞瘤（plasmocytoma）。是IPD中最常见的一种类型。1873年由Butzky首先并命名。,MM的主要临床特征：,进行性的骨质破坏，如骨质疏松和溶骨性病变， 常有骨痛、易骨折，为MM最典型特征； 大量的M蛋白导致血液粘度增高,呈高粘血症或沉积 于肾小管中，肾小管上皮细胞淀粉样变性，发生肾病 综合征。损害中枢神经系统，可出现神经功能障碍； 骨髓损伤可引起贫血、粒细胞和血小板减少； 浆细胞浸润其他组织，如脊髓和神经根受压时引起 运动功能障碍等； 男性多发，平均发病年龄46岁左右； 恶性程度高，预后不良； 易感染。,MM的主要免疫学特征：,血清中出现大量的M蛋白：IgG35g/L, IgA20g/L, IgM15g/L, IgD2.0g/L，IgE 2.0g/L；或尿中有本周蛋白（1.0g/24h 尿）； 血清中正常Ig 水平明显降低； 骨髓中有无限扩增的异常浆细胞 （15%）为主要病理特征，组织证实有浆 细胞瘤； 有溶骨性损害。,不同类型的多发性骨髓瘤:,类 型 发生率（%） 本周蛋白尿阳性（%） 临 床 特 点 IgG 5060 5070 典型症状 IgA 2025 5070 高粘综合征较多见 IgD 12 90 骨髓外病变、溶骨病 变多见，44%淀粉样变 IgE 0.01 少见 IgM 1 90 高粘综合征最常见 非分泌型 15 无 溶骨病变较少，神 经系统损害较多见,MM的发病机制,发病机制不明，与下列因素有关。 （1）是遗传与环境因素综合作用的结果。主要发生 在1号、11号、14号染色体，使浆细胞可发生永生化 （2）造血干细胞的异常 。形成浆细胞瘤。 （3）细胞因子的异常 。MM患者可有IL-6异常增高， 体外内实验证明IL-6可促使MM细胞增殖、生长和存 活，使MM细胞增多。IL-6增高直接效应是抑制IL-4的 产生，从而抑制了正常的体液免疫功能。 （4）与粘附分子、IL-6等信号传递受体和B细胞12 等抑制凋亡的受体高表达有关。,本周蛋白（bence-jones protein）: 1847年由Bence-Jones在病人的尿液中检出而命名。已知M蛋白不具有免疫活性，无正常免疫球蛋白的功能，其轻链分子小可通过肾小球滤过从尿排除。 （本周蛋白是从尿中检出的M蛋白轻链）,冷球蛋白的检测(定性)：,冷球蛋白的定量分析 鉴定沉淀中蛋白质类型，可将沉淀用冷缓冲 液洗涤后，再溶于巴比妥缓冲液中，固定电 泳或免疫电泳鉴定。 冷球蛋白检测的注意事项 采血过程要保温，用品用预温，4下放置时 间要一周，正常人血清也可含有冷球蛋白， 多数在80g/L 以下。,（二）血清补体检测,补体（complement）是指血清中具有酶活性的一组不耐热球蛋白。 A. C1C9(C1q、r、s)； B. B因子、D因子、P因子、H因子； C. C1抑制物、C4结合蛋白、促衰变因子 等。,溶血程度与补体含量的关系:,补体相关的实验室检测：,1、总补体溶血活性测定（CH50） 反映主要补体C1C9成分的综合水平。 试管法：正常参考值范围 50 100U/ml 脂质体免疫法：其范围23 46U/ml 测得值高：急性炎症、损伤、恶性肿瘤 测得值低：补体消耗相关疾病 补体合成降低（肝病） 先天性缺陷,2、补体单个成分检测（C3、C4、C1q） 方法:免疫比浊法、单向免疫扩散法,补体单个成分检测的意义:,若血清C3含量增高，由于C3是急性时相反应蛋 白，在急性炎症、传染病早期、急性组织损伤、恶 性肿瘤、移植物排斥反应时增高。但是补体含量增 高的临床意义不大。 若血清C3含量降低，见于合成能力低下，如慢性 肝病；合成原料不足，如营养不良；补体消耗或丢 失增多，如系统性红斑狼疮活动期、白血病化疗 后、大量失血、大面积烧伤。 血清C4含量降低，见于多发性骨髓瘤、遗传性血 管性水肿、遗传性C4缺乏症等。,二、细胞免疫(cellular)检测,参与机体细胞免疫反应的细胞 T淋巴细胞 B淋巴细胞 NK细胞（自然杀伤） 中性粒细胞 针对细胞的数量(amount)、活性（功 能 function）、表面标志物(membrane molecules )表达(express)程度。,T细胞表面标志物(主要):,1、羊RBC受体(E花环) 2、T细胞抗原受体（T cell receptor,TCR) 3、CD3,CD4/CD8；CD28,152,154和CD2等 （Cluster of differentiation；CD） 4、丝裂原受体（PHA/ConA） 5、MHC分子（MHV-类分子） 6、细胞因子受体,临床常见的细胞免疫检测项目,T细胞表面标志物检测 (membrane molecules of T lymphocytes) 通过检测T淋巴细胞表面特有的标志物 识别，计数细胞总数；分析细胞亚群。 方法：E玫瑰花环形成试验 (Erythrocyte rosette forming cell test) T细胞分化抗原（CD）测定 (Cluster Differentiation of T cells ),E玫瑰花环形成试验:,T细胞表面有特异性绵羊红细胞 (SRBC) 受体，即E受体。将T细胞与SRBC按一定比例混匀，置4至少2h或过夜，T细胞表面的E受体能与SRBC结合形成以T细胞为中心，四周环绕SRBC的花环样结构（见图)镜检计数可得总花环(Et)形成率，亦即T细胞的百分率。,正常参考值范围 Et 64.46.7% Ea 20%40%,流式细胞术(flowcytometry,FCM) ：CD3+T细胞 6185%；CD4+T细胞 2858%；CD8+T细胞 1948%；CD4+/CD8+T细胞比值 1.660.33(1)。,T淋巴细胞功能检测(function),T淋巴细胞体外培养,在有丝分裂原作用下 细胞内核酸与蛋白质合成增加,细胞发生母细 胞化(transformation ),或经混合(mixed) 淋巴细胞培养等来帮助细胞免疫功能评估。 方法：形态学(morphologic counting ) 3H-胸腺嘧啶核苷掺入法 (3H-thymidine incorporation) MTT法(MTT colorimetry) Mixed lymphocyte culture (one-way/two-way),Lymphocyte transformation (%) =(transferred lymphocyte)200100% Reference value: 70%,(3H-thymidine incorporation): T细胞经有丝分裂原刺激，向母细胞转 化时胞内DNA合成活跃， 3H-胸腺嘧啶核 苷作为原料摄入， 3H-胸腺嘧啶核苷的 掺入量与细胞增殖相关（SI2，正常）,Stimulating index (SI) = mean CPM of the stimulated cells/ mean CPM of the corresponding control Cells (unstimulated=control ),MTT法(colorimetry): 细胞增殖代谢活跃，细胞内线粒体脱 氢酶活性增高，通过线粒体能量代谢 使得MTT代谢形成紫色甲潜，经细胞溶 解分析吸光度，估计细胞增殖程度(SI2)。 methyl thiazolyte trazolium;MTT 四甲基偶氮唑盐,为一种染料.,混合淋巴细胞培养(mixed culture)： 将两个无关的淋巴细胞混合培养， 由于不同个体MHC的差异，彼此都以对方 为抗原发生反应，导致T细胞转化。 T细胞转化能力可通过3H-胸腺嘧啶 核苷掺入法、MTT法，检测分析。,B淋巴细胞表面标志物检测,B淋巴细胞表面标志物： 1、膜表面免疫球蛋白（SmIg） 2、分化抗原（CD1922和CD29） 3、Fc受体(Fc receptor) 4、补体受体(complement receptor) 5、EB病毒受体等(EB virus receptor),检测方法(method)： 1、免疫荧光(fluorescence immunoassay) 法测SmIg（用5种抗Ig抗体+B细胞荧光显 微镜下计数）. 参考值: SmIg+细胞总数1628%，其中G+ 4 13%；M+713%；A+14%；D+58%; E+0 1.5%。 2、流式细胞术(flowcytometry,FCM)检测B 细胞分化抗原（CD19）. 参考值: CD19+细胞 11.74%3.73%,B淋巴细胞功能检测(function):,1、B淋巴细胞增殖(proliferation)试验 2、溶血空斑(hemolytic plaque)试验 3、酶联免疫斑点法（ELISPOT） 4、体内试验（皮试）(/),ELISPOT:,用抗原包被固相，加入待检的抗体产生细胞，再诱导其抗体的分泌。 分泌的抗体与包被于固相的抗原结合，在抗体形成细胞周围形成抗原抗体复合物。 再加入酶标记二抗，通过底物的显色反应镜下计数着色斑点，并记录显色的深浅、范围，可评估B细胞功能,A and B：检测标本（刺激后的待测细胞） E and F：检测抗体对照（相同数量刺激后的待测细胞，使用PBS替代了检测抗体） C and D：阴性对照（相同数量的未刺激细胞） G and H：背景对照（只加入培养基，无细胞） H1 and H12：阳性对照（重组的细胞因子）,检测模式和结果示意图,体内试验（皮试）,正常机体对某种抗原建立了细胞免疫后，如用相同的抗原做皮肤试验时，常出现阳性的迟发型超敏反应。本试验不仅可以检查受试者是否对某种抗原具有特异性细胞免疫应答能力，而且可以检查受试者总体细胞免疫状态。,体内试验（皮试）:,B细胞功能减低或缺陷，可表现为体内Ig 和血型抗体量下降或缺如，患者对外源性抗原的应答能力减弱或缺如，仅产生极低或不能产生特异性抗体。故临床定量测定受检者血清中各种Ig量和相应血型抗体可判断B细胞功能，也是诊断体液免疫缺陷的重要指标。反之，如血清中一种或多种Ig或轻、重链片段异常增高，表明B细胞产生Ig的功能异常增高。,4、自然杀伤细胞（NK）免疫检测： NK为一类大颗粒淋巴细胞，其表面无专 门的识别标志，具有细胞介导的细胞毒 作用能直接杀伤靶细胞。 NK具有抗肿瘤、抗感染和免疫调节等功 效，还参与移植排斥、超敏反应等 NK功能测定：包括乳酸脱氢酶释放率、 51Cr释放等等 。,5、吞噬细胞（phagocytes）功能检测： 吞噬细胞 中性粒细胞（neutrophils） 单核-吞噬细胞 （mononuclear /macrophages） 吞噬细胞的吞噬活力 趋化（trend） 吞噬（phagocytosis） 胞内消化（elimination）,细胞免疫相关的主要细胞因子检测：,细胞因子(cytokines): 由活化的免疫细胞和某些基质细胞分泌的，介导和调节免疫、炎症反应的小分子多肽。细胞因子少入血，检测局部含量有意义；细胞因子具网络特性，联合检测多信息分析有意义。,细胞因子的种类：,1、白细胞介素（ IL-118） 2、集落刺激因子（CSF）（粒、巨噬细 胞和混合） 3、干扰素（IFN）（、） 4、肿瘤坏死因子（TNF）（ 、 ） 5、转化生长因子家族/ （SGF） 6、趋化因子家族 7、其他（表皮生长、血小板衍生）,常见细胞因子检测方法：,1、生物学检测法（促细胞增殖和增殖抑制、 细胞毒活性、抗病毒活性、趋化活性等）。 2、免疫学检测法（ELISA、RIA、免疫印迹、 免疫斑点）。 3、分子生物学法（RNA印迹、PCR等）。 4、单个细胞产生细胞因子测定法（反向溶血 空斑、反向ELISA斑点）。,IL-2/ IL-2R,IL-2主要由活化的CD4+细胞产生，通过自分泌和旁分泌作用于分泌IL-2的细胞本身或近邻的CD4+和 CD8+细胞，是机体免疫网络中最重要的调节因子。 为评价机体免疫功能的重要指标之一。 体液中含量低难以直接检测。 通常检测由刺激原（PHA/ConA）诱导单个核细胞在体外产生其的能力来反映。,IL-4,主要