临床常见标本的微生物检验

,临床常见标本的微生物学检验,主要内容,1.临床常见标本的微生物检验 一、血、骨髓、静脉导管标本 二、痰及下呼吸道标本 三、尿液标本 四、大便标本 五、生殖道系统标本 六、化脓和创伤标本 七、穿刺液标本 八、眼、耳、鼻、咽拭子标本 九、组织标本,一、血、骨髓、静脉导管标本,（一）血培养检测采血指征 临床上疑为败血症、脓毒血症或其他血液感染的患者 1. 发热（38）或低温（36） 2. 寒战 3. 白细胞增多（10109/L，特别有“核左移”未成熟的或杆状核白细胞增多） 4. 粒细胞减少（成熟的多核白细胞1109/L） 5. 血小板减少 6皮肤粘膜出血 7昏迷，休克、多器官衰竭 8 CRP升高 在评估可疑新生儿败血症时，除发热或低烧外，很少培养出细菌，应该补充尿液和脑脊液培养。 对入院危重感染患者未进行系统性抗菌药物治疗之前，应及时采集血培养。 骨髓炎或长期使用抗菌药物者骨髓培养阳性率高于血培养。,（二）血培养检测消毒程序 1.皮肤消毒程序：严格执行三步法（防止皮肤寄生菌污染） （1）用75%酒精擦拭静脉穿刺部位待30s以上； （2）然后用1%-2%碘酊作用30秒或10%碘伏作用60秒，从穿刺点向外画圈消毒，至消毒区域直径达3cm以上； （3）最后用75%酒精脱碘，待酒精挥发干燥后采血。 新生儿及对碘过敏的患者，只能用75%酒精消毒60s，待穿刺部位酒精挥发干燥后穿刺采血。 2.培养瓶消毒程序： （1）用75%酒精消毒血培养瓶橡皮塞，作用60秒。 （2）用无菌纱布或无菌棉签清除橡皮塞表面剩余的酒精，然后注入血液。,。 无论采用何种采血方法，血培养可接受的污染率通常是3%。 1.严格无菌操作，避免被体表或腔道正常菌群污染； 2.不要和血气、血沉的取血同时进行； 3.穿刺点消毒不使用低效消毒剂，切勿在静滴的静脉处取血； 4.不宜从静脉导管或静脉留置口取血，若从该部位取血，应在申请单上注明；最好同时静脉取血，以求进行比对； 5.不推荐静脉血直接入瓶，以免血量控制不好或对患者不利； 6.不主张换针头入瓶，以免增加污染的机会。 7.采血前把血培养瓶从冰箱拿出后，待恢复至室温后采集，采集后切勿放回冰箱。,（三）血培养标本采集和运送 1.采集时间 患者出现寒战、体温升高前； 使用抗菌药物前； 患者已使用抗菌药物的情况下，若出现明显的发热前期症状，可在寒战前或寒战后1h内采血；若无明显的寒战阶段，应在第二次服抗菌药物前采血； 对于无明显感染病灶或未找到发热原因的发热患者，先在不同部位采集2-3份血标本，间隔大于或等于1h，24h-36h后再次采集2份以上； 疑似沙门菌感染的患者在病程第1-2周采集静脉血； 建议 ： 同时采集2-3瓶（不同部位）； 需氧菌、厌氧菌各一份，采集后同时送检； 在采血后的2-5天无需重复采血培养；,2.采集部位 要求：从两侧上肢静脉采血，“双瓶双侧”采血培养。至少做到“双侧双瓶”。必要时从下肢静脉采血做第三套血培养。 不建议采集 （1）动脉血，因其诊断价值没有比静脉血更大； （2）静脉留置导管，因其常伴有高污染率。,所谓“双瓶双侧”，是指从一个部位采血接种一套培养瓶，再从另一部位采血接种另一套培养瓶。（通常是双臂） 所谓“双侧双瓶”，是指从一个部位采血接种一个需氧瓶，再从另一部位采血接种另一个厌氧瓶。 一次静脉采血注入到多个培养瓶中应视为单个血培养。,3.采集次数 要求： 对怀疑菌血症、真菌血症的成人患者，推荐同时采集23套（不同部位）血培养标本。（即双瓶双臂同时采集血培养标本。） 婴幼儿患者，推荐同时采集2次（不同部位）血培养标本。,为什么要求多次采血？,（1）菌血症有“持续性”和“暂时性”之分，多次采血可提高阳性检出率，减少漏检； 两瓶或以上血培养以上血培养结果阳性，细菌鉴定结果相同，判断为感染菌，作药敏并报告临床。 送检两瓶或以上血培养，仅1瓶结果为阳性，且为潜在的污染菌（如表皮葡萄球菌、微球菌、气球菌、棒状杆菌等），一般作为污染菌。 出现多种细菌在排除污染可能后，可考虑“复数菌”败血症的诊断。 仅送检1瓶血培养，且培养出上述潜在的污染菌。则其临床意义不能确定，需与临床医生讨论其可能的临床价值。 （2）血液感染有原发性和继发性之分，多次采血培养有助于循环外感染部位的诊断； （3）菌血症患者多数为间歇性，病原菌周期性出现在血液中，在无菌时期不管临床症状经历的严重程度，患者血液中的病原菌浓度水平相当低，因此要求多次采血，但24h内一般不超过3次。,4.采血量 要求： 成年患者推荐的采血量为每套不少于10ml，每瓶不少于5ml。 婴幼儿患者推荐的采血量为每瓶不少于2ml。 说明：血标本采集的量是影响检出率的最重要的因素。成人血培养采血量在230ml之间，病原菌检出率与采血量成正比例增长。每增加1ml的血液，病原菌的检出率增加3.2%。儿童患者因为血液中病原菌浓度较高，血培养量无需等同于成人。对血液病患者或者血容量相对较低的患者建议使用儿童瓶来减少血液的采集量增加病原菌的检出率。,5.血培养标本的运送 要求：（1）采集后的血培养瓶应在1小时之内送往实验室。 （2）血培养瓶在接种前和接种后均不得冷藏和冷冻。,血液标本的处理,1.自动化血培养系统： 立即放入仪器内，直到仪器报警提示阳性瓶后进行下一步操作。 2.传统血培养瓶： 放入35 温箱孵育，每日观察，若有生长情况立即转种，若第7天仍无菌生长，需要进行末次接种。,双相培养瓶,二.导管相关性血流感染的标本培养,导管相关性血流感染： 最常见的为血管内导管相关性血流感染（CRBSI），发生率与导管种类、导管相关医疗操作的频率、患者病情等因素有关。 短期留置的血管内导管，皮肤定值菌通过皮下隧道移植到导管尖端，随后引发感染； 长期留置的血管内导管，导管头被细菌污染，导管腔发生细菌定植，引发感染； 血行传播的细菌可定值在血管内导管中，引发新的病灶。,皮肤凝固酶阴性葡萄球菌定植于输液管,怀疑导管相关性血流感染的患者，可采用培养方法（建议同时进行）： 1.用Maki半定量培养法对血管内导管尖端片段进行培养： 采集： 用75%酒精消毒导管周围皮肤；移动导管，无菌剪刀剪取尖端末端5cm，直接置入无菌试管中；立即送检，防止干燥，常规培养不超过15min，4保存不超过2h。 接种： 用无菌镊子将5cm导管在血琼脂平皿上交叉滚动4次，然后弃之，放入5%二氧化碳35 温箱。 处理：若24h后血琼脂平皿生长15个菌落，提示有潜在导管相关性血流感染。 不推荐使用增菌肉汤培养，因为增菌扩大了污染的几率，导致结果不可靠。 2.采集外周静脉血培养： 采集至少2份血培养，至少1份经外周静脉血穿刺采血，至少1份从导管中心或静脉留置口隔膜取血，两者之间采血时间应5min。,Maki 滚动法,二 、 痰及下呼吸道标本,咳痰途经口咽部 不可避免地受到污染 唾液中口咽部定植菌的浓度可达108 109/ml。 研究显示，国内常规痰标本中约半数存在唾液严重污染现象。,（一）采集指征 凡是发热、咳嗽和咳痰，痰呈脓性、粘稠或血性，并伴有胸痛、气急，肺部闻及湿罗音，外周白细胞总数及中性粒细胞比例明显增高，X线检查提示肺部有炎性浸润或胸腔积液，甚至出现感染性休克和呼吸衰竭等患者，应采集痰液或下呼吸道标本。 对可疑烈性呼吸道传染病（如SARS、肺炭疽、肺鼠疫等）患者采集检验标本时必须注意生物安全防护。,（二）采集时间 在抗生素应用前采集痰标本; 标本采集后12h内必须立即进行实验室处理； 咳痰标本应用最早且广泛，但也是最受争议的标本 ; 取标本前应摘去牙托，清洁口腔如刷牙和漱口; 深咳，采集标本过程中要有专业的医务人员指导; 对于细菌性肺炎，痰标本送检每天1次，连续23天；不建议24h内多次采集，除非痰液外观性状改变； 怀疑分枝杆菌感染者，应连续收集3天清晨痰液送检。,（三）采集方法 自然咳痰法 以晨痰为佳。用清水反复漱口，用力咳出呼吸道深部的痰，痰液直接吐入无菌容器中，尽快送检。否则有的细菌（如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌）在外界可能死亡。不能及时送检的标本，室温保存2h。要求采到肺深部的痰液，不要唾液。,2.创伤性取痰方法（均由医生操作）： 经支气管镜抽吸法（支气管肺泡灌洗液、防污染样本毛刷等） 直接从肺部感染病灶采集高浓度的病原菌，较为安全，但不能避免咽喉部正常菌群污染。 经人工气道吸引分泌物（导管吸痰、防污染灌洗等） 较为采用，但人工气道常有致病菌或定值菌存在，建议采集前先做细胞血筛查。 经气管穿刺吸引物 采集到的下呼吸道标本不受上呼吸道污染，常用于厌氧菌培养，但患者不易接受。 经胸壁针刺吸引物 偶尔用于原因不明的肺炎或贴近胸壁的病灶。 胃内采痰法 用于结核杆菌感染的婴幼儿患者 小儿取痰法 用压舌板向后压舌，用棉拭子伸入咽部，小儿受刺激后咳出分泌物。 雾化取痰法 无痰或痰量极少时可用，使用5%NaCl雾化导痰。哮喘患者不能用该法。,痰标本的运送、保存,1.标本采集后2小时内送至实验室；否则可导致肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等苛养菌死亡； 2.延迟送检或待处理标本应置于4 冰箱保存（疑似肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等苛养菌的例外），但应在24小时内处理； 3.对可疑烈性呼吸道传染病（SARS、炭疽、鼠疫等）的标本，必须全过程注意生物安全； 4.经口腔部污染的标本均不可以做厌氧菌培养。,痰标本的处理,一.痰标本的革兰染色涂片检测： 其目的是判定标本是否适合做细菌培养，并初步判定有否病原菌，病原菌的数量级类别，有助于初步报告、培养基选择和培养结果的判定。 一般认为来自下呼吸道的合格标本应该是含脓细胞和支气管柱状上皮细胞较多，而受唾液污染的来自于颊黏膜的扁平上皮细胞较少，其判定标准如下表：,A、B级的痰标本适合进行培养； C、D级的标本须高倍镜镜下观察区分，根据视野内的白细胞或纤毛柱状上皮细胞的数量，以及细菌的种类及分布等结果进行判定； E级为不合格标本。,二.痰标本洗净： 目的：尽量排除上呼吸道正常菌群的污染： 方法：将痰加入含有15-20ml灭菌生理盐水的试管中，剧烈振荡5-10s，然后用接种环将沉淀于管底的脓痰小片沾出，再放另一个无菌试管中，将同样的方法反复2次。,三.痰标本的均质化处理： 目的：有助于痰核内部细菌的暴露，以提高痰培养标本的阳性培养率。 方法：向痰液内加等量的用无菌的PH7.6的磷酸盐缓冲液配制的1%的胰蛋白酶溶液，放置37 温箱内消化90min即能使痰液均质化，而对细菌培养无影响。此外，还可用玻璃组织研磨器或振荡器。,痰标本的处理（常规）,取痰液分区3区划线接种于血平板(及麦康凯平板MAC)上，若需培养嗜血杆菌，再接种于加入抗生素(每毫升巧克力琼脂内加万古霉素50mg，杆菌肽30mg，氯林可霉素1mg）的嗜血杆菌选择性巧克力平板（HA）。 血平板置于35普通温箱，巧克力平板置于5%CO2温箱内。 18-24小时后观察。,痰培养的结果判断,在培养出细菌时都面临判断该细菌是致病菌或携带菌的问题，而这些标本的采集很难不污染携带菌。 现代感染的特点是，低免疫人群大大增多，条件致病菌、非致病菌引起的感染增多，这些特点给致病菌的判断带来了困难。,痰标本在平板上的菌落量化指标,未列入规范要求（参考）,有意义的痰培养结果,合格痰标本培养优势菌中度以上生长(+) 合格痰标本少量生长，但与涂片镜检结果一致(肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌) 多次培养到相同细菌；,无意义的痰培养结果,痰培养有上呼吸道正常菌群的细菌(如草绿色链球菌、表皮葡萄球菌、非致病奈瑟菌、类白喉杆菌等) 痰培养为多种病原菌少量(+)生长。,三、 尿培养标本,尿路感染是指尿道内有大量微生物繁殖而引起的尿路炎症。尿路感染并非是一种单一的疾病，而是一种临床综合征。根据感染部位可分为上尿路感染（如肾盂肾炎）及下尿路感染（如膀胱炎），男性还可出现前列腺感染，不同部位同时感染也很常见。尿路感染是人类最常见的感染之一，可发生于各个年龄段的人群，好发于女性，男:女之比为1:10。,典型的临床表现为发热、尿频、尿急、尿痛、排尿困难和耻骨上压痛，临床表现可因患者年龄和健康状况不同而异。新生儿尿路感染的症状往往是非特异性的、模湖的，可表现有厌食，呕吐，倦怠，无发热的菌血症等；婴儿期直到2岁，常有高热；2岁以后的尿路感染才会有典型的临床表现；老年患者的尿路感染，常缺乏明显的症状，更易造成菌血症和急性肾功能衰竭，应引起重视。,正常人尿液是无菌的，而尿液细菌培养最大的问题是杂菌污染。正常人外尿道有大肠杆菌、葡萄球菌等存在。而这些细菌又是尿路感染中常见的病原菌。因此要作好尿液细菌学检查，首先应注意标本收集问题。 尿液经尿道排出时会受到尿道内正常菌群的污染,但定量培养时计数不会超过103CFU /m l, 泌尿系感染时定量培养在104105CFU /m l 。 另外,由于绝大多数的泌尿系感染是由肠杆菌科细菌引起,而此类细菌的硝酸盐还原实验为阳性,故可参考尿检查常规中的硝酸盐还原实验来推断是否有细菌感染。,（一）尿培养标本送检指征 1. 有典型的尿路感染症状； 2. 有肉眼脓尿或血尿； 3. 尿常规检查白细胞或亚硝酸盐阳性； 4. 有不明原因的发热，无其他局部症状； 5. 留置导尿管的患者出现发热； 6. 膀胱排空功能受损； 7. 泌尿系统疾病手术前； 8. 有尿路感染症状者，前次培养结果阴性或抗菌治疗48h后仍持续发热。 9. 抗生素停药后，感染症状再次出现。,（二）尿培养标本采集方法 标本采集应在使用抗生素之前，避免消毒剂污染标本。 1清洁中段尿 留取清晨清洁中段尿标本，先用肥皂水仔细清洗会阴部，再用清水冲洗尿道口周围；将前段尿排去，留取中段尿10ml左右于无菌容器内，立即加盖送检，2h内接种。该方法简单、易行，是最常用的尿标本收集方法，但是容易受到会阴部细菌污染。 2耻骨上膀胱穿刺 使用无菌注射器直接从耻骨上经皮肤消毒穿入膀胱吸取尿液，是评估膀胱内细菌感染的“金标准”方法，主要用于厌氧菌培养或留取标本困难的婴儿尿标本的采集。,3直接导尿 按常规方法对会阴局部进行消毒后，用导尿管直接经尿道插入膀胱，获取膀胱尿液，可减少尿液标本污染，准确地反映膀胱感染情况。但有可能下尿道细菌进入膀胱，导致继发感染，一般不提倡使用。 4小儿收集包 无自控能力的小儿可用收集包收集尿液，这种装置由于很难避免会阴部菌群污染产生假阳性，所以只有在检验结果为阴性时才有意义。如果检验结果为阳性，应结合临床进行分析，必要时可使用膀胱上穿刺或导尿法留取标本进行复检。 5留置导尿管收集尿液 用导尿管导取10-15ml尿液置灭菌容器内送检。长期留置导尿管者，应在更换新导尿管后留取尿标本。留置导尿患者应消毒导尿管外部及尿管口，采取无菌操作方法，用注射器通过导尿管吸取尿液。注意防止混入消毒剂，不能从尿液收集袋中采集尿液。,（三）采集时间和标本运送 1.应选择在抗菌药物应用前或停用抗菌药物5天后采集尿液。 2.通常采集清晨第1次尿液送检，确保尿液在膀胱内停留4h以上，使细菌有足够时间繁殖。嘱患者睡前少饮水以免尿液稀释。 3.怀疑沙门菌感染时应在发病2周左右采集尿液培养。 4.对无症状的患者应连续采集3天晨尿送检。 5.怀疑结核分枝杆菌感染时，患者应停药1-2天后采集晨尿或24h尿的沉渣部分10-15ml送检。 6. 标本采集后应立即送检、及时接种，室温下保存时间不得超过2h（夏季保存时间应适当缩短或冷藏保存），冷藏保存标本必须在6h内进行接种，但冷藏保存的标本不能用于淋病奈瑟菌培养。,（四）注意事项 1. 由于自然排尿收集的标本很难避免会阴部及下尿道细菌污染，所以需要定量接种、合理评价才能判断培养的细菌是否与尿路感染有关。尿标本菌落计数中革兰阴性杆菌数105CFU/ml 或革兰阳性球菌数104CFU/ml时有临床诊断意义。 （不是绝对的，受多因素影响，综合判断） 2. 尿液标本的采集和培养中的问题是污染杂菌，故应严格进行无菌操作。 3. 尿标本采集后应立即送检，以免污染，尿液中不得加防腐剂和消毒剂。,4.除非是流行病学调查，长期留置导尿管患者常规尿培养没有临床意义，大量病原菌常可在这类患者中检出，导尿管留置时间延长易导致与引起患者尿道感染不一致的微生物定植生长； 5.不可从集尿袋的下端管口留取标本，集尿袋内的尿液也不能用于培养，可能会引起污染； 6.临床常让患者留取清洁中段尿，应该在医护人员监督指导下让患者正确的留取清洁中段尿； 7.由于种种原因，患者常常不能正确地留取清洁中段尿，实验室只是针对尿液标本培养的结果进行评估，或常常由于分析前尿液标本污染了多种细菌无法正确解释的结果，可能延误了临床的正确诊断和治疗。,下列因素可使尿液中细菌数量减少，判断结果时应注意,使用抗生素治疗，细菌生长受到抑制； 尿液稀释，尿比重1.003，营养成分减少，细菌生长迟缓； 尿PH5.0或8.5，细菌生长受阻； 尿频时，膀胱内细菌停留时间短，菌落数减少； 尿道口消毒液混入标本中，影响细菌繁殖，菌落数减少； 不同种类的细菌生长速度不同、营养要求不同，菌落计数有所 不同。,接种方式,接种于血平板；置于35普通温箱；18-24小时后观察。采用1ul或者10ul定量接种环。,尿培养的划线方式,1ul接种环：菌落数*1000/ml 10ul接种环：菌落数*100/ml 5ul接种环：菌落计数*200/ml,尿培养结果评价,正常情况下从肾脏排泌至膀胱的尿液是无菌的，但膀胱中的尿液经尿道排出体外时可受到下尿道中正常菌群的污染而出现细菌。因此对不同方法获取的尿液标本培养结果需正确评价，才能有效指导临床合理治疗。一般认为，清洁中段尿标本中单种细菌菌落数105CFU/ml可能为感染；5104CFU/ml可能为污染，在两者之间需要根据具体情况进行评估（表1）。,表1 不同方法采集的尿标本培养结果评价,标本来源 菌落数CFU/ml 结果评价,清洁中段尿,5104,无意义，仅报告菌落数及革兰染色特征，并注明是纯培养或是混合菌生长,纯培养有意义，报告菌落计数和菌种鉴定及药敏试验结果；混合菌生长无意义，仅做革兰染色镜检，并报告镜检结果,(510)104,纯培养或混合菌生长，其中某种细菌数105者有意义，需进行细菌鉴定及药敏试验；4种及以上细菌生长无意义，报告标本污染,105,3种以内细菌生长都有意义，对2种主要生长菌需进行菌种鉴定及药敏试验；4 种及以上细菌生长无意义，报告标本污染,103,导尿,都有意义，所有细菌均需做菌种鉴定及药敏试验,任意数目,耻骨上膀胱穿刺,阴性培养结果报告,培养48h无菌落生长，即为阴性。接种1ul尿量者，应报告“培养48h，菌落计数103CFU/ml”；接种10ul尿量者，应报告“培养48h，菌落计数102CFU/ml”。,阳性培养结果报告,应报告细菌种属名称、菌落计数和药物敏感性试验结果。如：大肠埃希菌生长，菌落计数105CFU/ml，药物敏感性试验结果：,菌落计数105CFU/ml只是诊断尿路感染的一般标准。对一个实验室而言，如果仅使用一个标准对实验结果进行解释，那么若标准制定过松，将会造成抗生素滥用和不必要的资源浪费；制定过严，将有可能导致尿路感染的漏诊。所以每个实验室应在与临床医生密切合作的基础上，根据不同的情况制定不同的解释标准。尿培养菌落计数可受多种因素的影响，在一些患者即使菌落计数较少，也有明显的临床意义，所以对菌落计数5104CFU/ml，“规范”中认为无意义的阳性结果，不应随意丢弃，必要时应根据患者的具体情况或与临床医生联系后，决定是否需要做细菌鉴定和药敏试验。,四、 大便培养标本,最常见于感染性腹泻： 1.吸收不良性腹泻； 轮状病毒、腺病毒、隐孢子虫、致病性大肠埃希菌 2.分泌性腹泻（肠毒素性腹泻）； 霍乱弧菌、产肠毒素大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌. 3.侵袭性腹泻（渗出性腹泻）； 沙门菌属、耶尔森菌、溶组织内阿米巴、侵袭性大肠埃希菌 4.抗生素相关性腹泻,（一）采集时间 腹泻患者应在急性期，并尽可能在使用抗生素之前采集新鲜粪便；伤寒患者在发病2周以后。 （二）采集方法 1自然排便采集法 自然排便后，挑取有脓血或黏液部位的粪便2-3g ，液状粪便取絮状物盛于无菌的容器内或置于保存液或增菌液中送检。 2直肠拭子采集法 对不易获得粪便或排便困难的患者及婴幼儿，可采用直肠拭子法采集标本，其方法是将拭子前端用甘油湿润。然后插入肛门约45cm（幼儿约23cm）处，轻轻在直肠内旋转，擦取直肠表面粘液后取出，盛入无菌试管或保存液中送检。,（三）实验室检查 肠道细菌大多为革兰阴性杆菌，且因粪便标本中有各种正常菌群，形态上区分困难，因此一般不做直接涂片检查。 只有当临床怀疑肠道菌群失调或检查霍乱弧菌、结核分枝杆菌、疑似葡萄球菌或难辩梭菌引起的伪膜性肠炎以及真菌性腹泻时，才做直接涂片检查。 疑似葡萄球菌引起的抗菌素相关性肠炎，可取水样便或肠黏膜样物涂片，革兰染色后镜检，见革兰阴性杆菌明显减少，革兰阳性球菌大量散在或成堆（葡萄状）排列，可提示肠道菌群失调。,（四）注意事项,在腹泻发病的正确时间收集标本，病人应尽量在急性期（3d）内和用药前采集标本，以提高检出率。 大便标本中含有很多杂菌，粪便标本的采集须注意防止外界脏物污染，尽量采用无菌容器。 为提高阳性检出率，要采集新鲜标本，立即送检。,标本接种,一 细菌性痢疾、伤寒感染（沙门、志贺） 取标本接种于SS琼脂平板或麦康凯平板或XLD平板，置于35普通温箱，18-24小时后观察。 二 伪膜性肠炎（难辨梭状芽孢杆菌） 接种于CCFA平板和厌氧血琼脂平板，置于37普通温箱，48小时后观察。 三 霍乱感染 标本接种于碱性蛋白胨水， 35培养6-8h后转种于庆大霉素琼脂平板或SS琼脂平板， 35普通温箱，18-24小时后观察。 四 其他感染 真菌、小肠结肠炎耶尔森菌、空肠弯曲菌。,接种方式,四区划线，每区均换环。,五、 生殖道标本,（一）送检指征 1. 男性泌尿系统表现 尿急、尿频、尿痛 尿道分泌物增多 会阴部疼痛及阴囊疼痛 性功能障碍 泌尿生殖器畸形和缺损,2. 女性泌尿系统表现 分泌物增多及性状异常 尿道口搔痒及脓性分泌物流畅 下腹疼痛 月经失调 阴道出血 外阴搔痒 外阴或阴道疼痛 性功能障碍,（二）标本采集 生殖器官标本包括子宫颈、阴道、前列腺；男性及女性外生殖器的分泌物及经血等。应根据感染的部位和可能的病原体决定用于病原学诊断的标本种类、采集部位和采集方法等。阴道、子宫颈及前列腺等分泌物应由医师采集，收集于无菌试管内送检。,尿道分泌物 1.女性尿道：患者排尿1小时后采集，首先拭去尿道口的渗出物；再用拭子通过阴道，靠着耻骨联合，按摩尿道，采集分泌物；如未获得分泌物，清洗外尿道，用灭菌纱布或棉球擦拭，用泌尿生殖道拭子插入尿道24cm，旋转拭子2秒。 2. 男性尿道：用泌尿生殖道拭子插入尿道腔24cm，旋转拭子，至少停留20秒，而使之容易吸收。,阴道分泌物 擦除过多的分泌物和排出液，用无菌棉拭子采取阴道口内4厘米内侧壁或后穹窿处分泌物，如果需要涂片，需再用一个拭子。 男性前列腺： 用前列腺按摩法采集前列腺液。清洗尿道口，冲洗尿道膀胱，从肛门用手指按摩前列腺，使前列腺液溢出，用无菌容器收集。无肉眼可见脓液时，可用灭菌拭子轻轻伸入前尿道内，旋转拭子采集标本。,（三）注意事项 1.生殖器是开放性器官，标本采集过程中应严格遵 循无菌操作规程以减少杂菌污染。 2.由于阴道正常菌群的存在而使细菌的分离鉴定 受到干扰，所以在采集女性生殖道标本时应注意尽 量减少或避免正常菌群的污染。 3.疑有宫腔感染，如遇产妇需行剖宫产，待胎儿 娩出后取宫腔分泌物，并同时取婴儿耳拭子一同送 检。 4.沙眼衣原体和病毒均在宿主细胞内繁殖，取材 时拭子应在病变部位（移行上皮处稍内）停留十几 秒钟，并采集尽可能多的上皮细胞。,5. 生殖道感染厌氧菌也较多见，疑有厌氧菌感染时，标本采集和运送应避免与氧气接触，最佳方法是床边采样，直接接种至厌氧装置内。 6. 淋病奈瑟菌检查时，取材的深度一定要够，因为淋球菌好发于柱状上皮细胞而不是复层鳞状上皮细胞。不论男女尿道及子宫颈均需用拭子插入尿道及子宫颈3cm深转动并停留10-30s取样送检。 7. 淋病奈瑟菌抵抗力低，对外环境变化颇为敏感，对寒冷和干燥抵抗力很弱。因此，为了保证培养有足够的成功率，取材后要尽快送检，立即接种，标本离体时间越短越好。,直接接种于巧克力培养基，置于5%CO2温箱内，18-24小时后观察。,六、 化脓和创伤标本,组织或器官的化脓性感染，其病原菌的来源可分为两类： 内源性：感染源是炎症局部周围器官中的正常菌群，由于损伤等因素进入无菌状态的组织内，发生感染。 外源性：感染源是存在于人体外部自然界的微生物，由于外伤和直接接触通过人体表面进入人体，造成感染。 脓液的细菌学检查对于确定感染的种类（结核性或非结核性等）、提供药物敏感结果和指导临床治疗有重要的意义。,（一）标本采集 1开放性感染和已溃破的化脓灶 标本采集前先用灭菌生理盐水拭去表面渗出物，尽可能用抽吸或将拭子深入伤口，紧贴伤口前沿取样，从脓肿底部或脓肿壁取样，效果最好。慢性感染，污染严重，很难分离到致病菌，可取感染部位下的组织，研磨成组织匀浆接种于适宜的培养基。 2封闭性脓肿 局部消毒后用针及注射器抽吸脓肿壁，将所有物质置于无菌试管内送检，疑为厌氧菌感染时立即作床边接种或置于厌氧转运装置送检（针头插一橡皮塞隔绝空气）。但取样时，可能会带入与感染过程无关的定植细菌。 3大面积创伤感染：可取感染组织块或沾有脓汁的内层敷料送检。,（二）注意事项 细菌对干燥敏感或只能采集少量标本时，用棉拭子采集标本后立即放入液体培养基内，或采标本前先将棉拭子沾少许肉汤以保持标本湿度。 对于不能立即送检的标本，应放4保存，培养淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌的标本除外。 尽可能在用药前采集标本。 采样前病灶局部应避免用抗菌药物或消毒剂。 革兰染色对标本进行评估。涂片中如出现上皮细胞提示标本已被污染。没有上皮细胞而有白细胞说明标本采集正确。 有的创伤均可有细菌污染，但不一定发生感染，因此对分离到的细菌要根据创伤的情况、菌量和种数，收集标本的处理过程、机体免疫力及抗生素的使用情况等多种因素来分析判断。,标本处理,直接涂片，做出初步判断； 接种于血平板，置于35普通温箱；18-24小时后观察。,七、 穿刺液标本,穿刺液主要包括: 脑脊液 胆汁 胸水 腹水 心包液 关节液 鞘膜液 在正常人体中，上述体液均是无菌的。有感染的情况下检出的细菌，在排除污染后应视为病原菌，及时给予正确的治疗，使病人早日恢复健康。,送检指征,脑脊液： 症状指征：发热等感染性全身症状、颅内压升高、脑膜刺激症状、神经麻痹症状、脑脊液常规及生化变化；怀疑脑膜炎时。 胸水： 多伴有胸痛、发热、胸腔积液；疑似胸膜炎、胸腔积水； 腹水： 有积液伴腹痛、呕吐、肌紧张、肠鸣音弱或消失等。疑似原发或继发性腹膜炎； 胆汁： 腹痛、黄疸、右上腹压痛、肌紧张、胆囊区深吸气时有触痛；疑似胆石症、胆囊炎、肝胆系统感染等。 心包液： 发冷、发热、心悸、出汗、乏力及精神症状；心前区疼痛、心包摩擦音、心音明显减弱、心电图改变等。疑似心包炎； 5关节液： 关节肿胀，关节周围肌肉发生保护性痉挛；疑似化脓性关节炎。,（一）脑脊液 1. 采集时间： 怀疑为脑膜炎的病人，应立即采集脑脊液，最好在使用抗菌药物以前采集标本。 2. 采集方法： 用腰穿方法采集脑脊液35ml，分装到3个无菌试管中，每个试管12ml。第一管用于细菌培养! 也可将抽取液直接注入血培养瓶,用血培养仪培养。,3.标本运送和保存： 脑膜炎奈瑟菌离体后会迅速自溶,肺炎链球菌和流感嗜血杆菌也很容易死亡,因此,标本应立即送检,并注意保温、防干燥。切不可置冰箱保存,否则会影响检出率。 脑脊液标本送检的理想时间为15分钟内，半小时送检是可接受的，如果送检时间超过1小时，则会影响结果。 如不能及时送检，可使用血培养瓶（怀疑脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌感染时，请勿使用血培养瓶）,（二）胆汁及其它穿刺液（胸水、腹水、心包液、关节液及鞘膜液等） 1. 采集时间 怀疑感染存在，应尽早采集标本，一般在患者使用抗菌药物之前或停止用药后2-3天采集。 2. 采集方法 无菌操作穿刺抽取标本或外科手术采集标本。 标本采集量应1ml;胸腔积液、腹水可抽取10ml; 心包液、关节液等可抽取25ml 。 标本采集后注入无菌小瓶或无菌试管中送检也可将抽取液直接注入血培养瓶，用血培养仪培养。 为防止穿刺液的凝固，应在无菌试管中预先加入灭菌肝素，再注入穿刺液。,标本处理,脑脊液： 1. 若脑脊液标本明显红色或浑浊，直接接种； 若脑脊液清晰透明，应以3000r/min离心10-15分钟后，取沉淀物进行接种。 2.一般选择血琼脂平皿、巧克力平皿、麦康凯或中国蓝平皿、沙保罗平皿、硫羟乙酸盐肉汤。 3.接种前将平板置于温箱中预温30min，保存平皿表面干燥。 4.采用10ul定量环接种进行4区划线。接种后37、5%CO2温箱培养24h，若不见生长，继续培养。,注意： 1.脑脊液标本不推荐接种与增菌肉汤，其营养条件较弱，不易苛养菌生长： 2.脑脊液标本不能使用血培养瓶培养，由于培养瓶中含有的聚茴香胺硫酸钠（SPS）对脑膜炎奈瑟菌有毒性。,胸腹水、胆汁、心包液、关节液等标本的接种,标本处理： 将标本取10ul直接接种于血琼脂平皿、巧克力平皿、麦康凯或中国蓝平皿、沙保罗平皿上，除巧克力平皿放入37、5%CO2温箱外，其余平板均放入35 普通温箱。 备注：由于该方法检出率低，目前国内使用新的接种方法： 无菌操作将标本与肉汤按11-1 2比例加入到已配置的血液增菌肉汤管中，轻轻摇匀。置于35 普通温箱，24h后转种到血琼脂平皿上，再次培养24h观察。,八、 眼、耳、鼻、咽拭子标本,正常眼部、中耳及鼻窦内是无菌的，而咽峡部有口腔的常在菌丛。 耳、鼻、咽部的细菌感染病原菌多源于口腔，口腔中既有需氧菌也有厌氧菌，所以，其周围组织器