沙门菌检验技术集大yqm.ppt

集美大学生物工程学院 杨秋明（高级实验师）Email:yangqm,沙门氏菌（Salmonella）的检验,是一大群寄生于动物肠道内生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌,一、沙门氏菌生物学特性,国内外沙门菌检测方法（传统方法）,国家标准(GB4789.4-2010:食品微生物学检验沙门氏菌检验) 行业标准（SN 0170-1992 出口食品沙门氏菌属(包括亚利桑那菌)检验方法 ） FDA （Food & Drug Administration） AOAC (Association of Official Analytical Chemists) FSIS （FOOD SAFETY AND INSPECTION SERVICE） ISO 加拿大官方食品微生物分析方法,标本采集,增菌培养,肠道选择性培养基分离培养,革兰染色,生化反应,取可疑菌落,血清学鉴定,食品中沙门氏菌检测的基本程序,沙门菌常用生化试验,三糖铁（TSI）,尿素酶试验 阴性（黄）阳性（红）,沙门菌常用生化试验,吲哚试验 阴性（液面黄）阳性（液面红）,VP试验 阳性（红色）阴性（不变）,沙门菌常用生化试验,赖氨酸脱羧酶试验 对照 阳性（紫） 阴性（黄）,丙二酸盐试验 阳性（兰） 阴性（不变）,ONPG试验 阳性（黄） 空白,沙门菌常用生化试验,TSI（排除A/A H2S结果 ），靛基质，尿素，KCN，赖氨酸,沙门氏菌血清学试验,H2S 靛 尿 KCN 赖,H2S 靛 尿 KCN 赖/,非如左述的各种反应结果,沙门氏菌血清学试验,沙门氏菌,非沙门氏菌,微生物学检验 沙门氏菌检验,中华人民共和国国家标准,GB/T 4789.4-2010,前增菌：使食品加工过程中受伤的沙门菌细胞恢复活力 未经加工过的食品，检验前不需要前增菌 前增菌：25克（加工食品）+225毫升缓冲蛋白胨水 37度培养4小时（干蛋品1824小时）。,（一）前增菌,选择性增菌,含选择性抑制剂 1：1稀释液而不是1：10，提高检出率,增菌：移取10毫升接种于100mL的增菌液中。氯化镁孔雀绿（MM）或四硫酸钠煌绿（TTB）、亚硒酸盐胱氨酸（SC）。 一种增菌剂不可能适合所有的沙门菌，所以，要同时使用两种以上的培养基增菌,（二）分离培养,最适生长温度为3537， 最适pH值为6.87.8。 选择性琼脂平板：BS培养基（亚硫酸铋琼脂）、DHL琼脂、HE（海克顿肠内琼脂培养基）或WS琼脂、SS琼脂。 BS最适合，但为提高检出率，需要使用一个BS培养基，同时再用另一个DHL、HE、SS或 WS,SS平板 分离肠道致病菌的强选择培养基 SS平板组成 基础培养基 乳糖 抑制剂(胆盐、枸橼酸钠、0.1%煌绿水溶液) 指示剂(中性红) SS平板上肠道细菌的生长现象 肠道致病菌：不分解乳糖，菌落无色或淡黄色 肠道非致病菌：分解乳糖产酸，菌落呈红色,肠道菌选择性培养基分离培养,分离培养 取增菌液划线接种于SS琼脂平板，于37培养1824h，观察菌落特征 肠道致病菌在SS平板上的菌落特征 沙门氏菌形成不发酵乳糖菌落 无色透明，光滑湿润、边缘整齐菌落,发酵乳糖菌落 (大肠杆菌菌落）,不发酵乳糖菌落 （肠道致病菌菌落）,SS培养基平板分离,革兰染色,沙门氏菌：革兰阴性杆菌,（三）五项生化试验,1、三糖铁琼脂试验 2、靛基质试验（吲哚试验） 3、尿素酶试验 4、氰化钾试验（KCN） 5、赖氨酸脱羧酶试验,1、三糖铁琼脂(TSI)成分,蛋白胨 20.0g 牛肉膏 3.0g 乳 糖 10.0g 蔗 糖 10.0g 葡萄糖 1.0g 硫酸亚铁铵(含6个结晶水) 0.5g 酚 红 0.025g或5g/L溶液5mL 氯化钠 5.0g 硫代硫酸钠0.5g 琼 脂 12.0g 蒸馏水 1000.0mL,TSI生化原理,斜面部分暴露于空气中，为有氧环境。而下部与空气隔绝是相对厌氧的环境。因此TSI时，最重要的是斜面部分和管下部琼脂的长度，两者均为3cm ，以保证两部分相对应的有氧或厌氧环境。,测试时使用接种针先穿刺至底部，而后于斜面作划线接种，经培养18-24小时后，依情况判断糖类发酵情形。,观察结果：有三种类型,A.非发酵型：无碳氢化合物发酵，所以无酸产生，斜面上琼脂的肽降解产物是碱性物质导致斜面变红。这种类型的细菌称为非发酵型。,B.非乳糖发酵型:如果接种的是发酵葡萄糖不发酵乳糖的细菌，培养基内仅有0.1%葡萄糖可以产酸。开始阶段，培养8-12h时，产生的酸足以引起斜面和底部颜色变成黄色。在接下来的时间里，葡萄糖被完全消耗，斜面部分的细菌在有氧条件下开始氧化降解氨基酸，产生的胺类很快就中和斜面上存在的酸；到18-24h，整个斜面又转换成碱性PH，颜色有变成红色。深部（厌氧区域），氨基酸降解不足以中和形成的酸，培养基仍为黄色。,C.乳糖（蔗糖）发酵型,三糖铁（TSI）试验,肠道杆菌科为革兰氏阴性菌，可发酵葡萄糖产酸。 利用糖类发酵之不同与硫化氢产生与否，加以区分。 三糖铁琼脂斜面培养基含有1乳糖及蔗糖与0.1葡萄糖作为发酵基质，且以酚红作为酸碱指示剂，如培养基由橘红转为黄色，表示有糖类发酵,三糖铁（TSI）琼脂试验,本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。,制好的培养基,对照管,斜面红色， 底面黄色,培养基全黄色,斜面、底部黄色，并产生H2S,斜面红色，底部黑色，产生H2S,底面黄色，并产生CO2,（1）斜面碱性（红色-）底部酸性（黄色+）产气或不产气（产气时会造成琼脂裂开）：表示仅葡萄糖发酵。因微生物优先分解葡萄糖产酸，使培养基变黄，但因葡萄糖含量低，于斜面产生之微量酸立即氧化而呈碱性反应，同时培养基中的蛋白质也随之利用而产碱，培养基底部则因氧张力较小，且微生物生长较慢，故仍维持酸性反应。 （2）斜面酸性（黄色+）底部酸性（黄色+）产气或不产气：表示除了葡萄糖发酵外，乳糖与（或）蔗糖也发酵。由于乳糖与蔗糖浓度高，经继续发酵，可维持培养基斜面与底部保持酸性反应。,（3）斜面碱性（红色-）底部碱性（红色-）或无变化（橘红色）：表示无糖类发酵。而蛋白质则于有氧或厌氧条件下进行代谢产生氨，而使培养基呈碱性反应，如有氧与厌氧均发生蛋白质分解，则斜面与底部均呈碱性反应。 为使结果准确，应于接种培养18-24小时内观察结果，以确保糖类尚未用尽，且蛋白质分解之碱性终产物尚未产生。,培养基变黑,（4）三糖铁琼脂培养基中亦含有硫代硫酸钠 若微生物有硫化氢产生，会与亚铁离子作用生成不溶性硫化亚铁之沉淀，进而使培养基变黑。,肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果,肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表,2、靛基质（吲哚）试验 阴性（液面黄）阳性（液面玫瑰红）,3、尿素酶试验 阴性（黄）阳性（红）,5、赖氨酸脱羧酶试验 对照 阳性（紫） 阴性（黄）,4、氰化钾试验 “浑浊”为“+”,ONPG试验 阳性（黄） 空白,丙二酸盐试验 阳性（兰） 阴性（不变）,沙门氏菌O多价血清凝集试验 左为阳性 右为阴性对照,3/3,血清学试验结果,结果报告,凡血清学鉴定与生化反应均符合沙门氏菌者 报告：食品25g检出沙门氏菌 反之则报告：食品25g未检出沙门氏菌,出口食品沙门氏菌属（包括亚利桑那菌）检验方法,肉类、蛋品,缓冲胨水（BPW）,四硫磺酸盐煌绿（TTB） 亚硒酸盐胱氨酸（SC）,亚硒酸盐胱氨酸（SC） 四硫磺酸盐煌绿（TTB）,BS & DHL (亚利桑那菌琼脂),TSI & 赖氨酸脱羧酶,TSI & 尿素酶,生化试验,血清学试验（“O”抗原，“Vi”抗原）,结果判定,检验检疫行业标准,SN 017092,样品（20类）25g,BS & XLD & HE,TSI & LIA,非沙门菌,沙门菌,非沙门菌,细菌学分析手册（FDA/BAM）,第五章 沙门菌属,肉、禽和蛋品中沙门菌的分离和鉴定,USDA/FSIS MLG 4.02,样品,BPW or BPW（含结晶紫）,351 20-24h,BGS & DMLIA or XLT4,42 0.5 2224h,0.5 0.05mL 10mL TT,0.1 0.02mL 10mL mRV,42 0.5 2224h,35 1 1824h & 48h,TSI & LIA 血清学试验,商业生化试剂盒或自动鉴定系统 or 传统生化鉴定（AOAC Official Method 967.27 or “Edwards and Ewings Identification of Enterobacteriaceae“）,报告结果,肉制品中沙门菌的分离和鉴定 FDA&USDA/FSIS,乳糖肉汤,缓冲蛋白胨水,TTB肉汤,RV肉汤,TTB肉汤,RV肉汤,BS,XLD,HE,XLT4,2倍改良LIA,BGS,生化筛选 （LIA,TSI）,鉴定及确证试验 葡萄糖 脲酶试验 卫矛醇 动力试验 吲哚 MR-VP测试 氰化钾 粉红酒石酸盐琼脂 乳糖 水杨苷 赖氨酸脱羧酶 西蒙氏枸橼酸盐 丙二酸 蔗糖,血清学试验,AOAC沙门菌检测方法,AOAC Official Method 967.25 Salmonella in Foods Preparation of Culture Media and Reagents AOAC Official Method 967.26 Salmonella in Processed Foods Detection AOAC Official Method 967.27 Salmonella in Foods Identification AOAC Official Method 967.28 Salmonella in Foods Serological Tests,食品中的沙门菌检测方法,AOAC 967.25967.28,处理样品,1mL+10mLSC,1mL+10mLTT,35 242h,XLD & HE & BS,35 242h（BS 24h&48h）,35 242h,TSI & LIA,35 242h,纯培养物,不纯培养物,纯培养物,MAC or XLD or HE,尿素酶,尿素酶,非沙门菌,H抗原，LIA，酚红卫矛醇肉汤，色氨酸肉汤 （KCN，丙二酸盐，吲哚），O抗原,吲哚 & H血清,KCN & LIA,非沙门菌,非沙门菌,补充生化试验,酚红乳糖肉汤，酚红蔗糖肉汤，