基因工程之基因操作的工具酶培训课件.ppt

3.3 DNA聚合酶 DNA聚合酶 ：能够催化脱氧核糖核苷酸连续加到双链DNA分子引物链的游离3-OH末端，使核苷酸发生聚合作用，而不从模板上解离。 反应特点 ： (1) 以四种三磷酸脱氧核糖核苷（dNTP）为底物 (2) 反应需要模板的指导，加入的核苷酸由模板链所决定 (3) 聚合反应需要有引物存在，且引物要有3-OH游离基团 (4) DNA链的生长方向为5 3 (5) 产物DNA链的性质与模板相同（半保留复制）,DNA聚合酶只能在已有的核酸链上延伸DNA链，而不能从无到有开始DNA链的合成。 种类 ： 到目前为止，已从E.coli 中发现了Pol I、Pol II、Pol III三种DNA聚合酶 。其中Pol I 和Pol II的主要功能是参与DNA的修复过程，Pol III与DNA的复制有关。三种聚合酶中，只有Pol I 同分子克隆关系密切。,3.3.1 大肠杆菌DNA聚合酶 I（E.coli DNA Pol I） DNA Pol I是从大肠杆菌细胞中分离得到的，该酶是由单一多肽组成的球蛋白，MW=109000，直径=65 DNA Pol I已得到高度纯化，从100 kg大肠杆菌中可以分离到约500 mg纯化的酶蛋白。每个成熟的大肠杆菌细胞中约有400个分子的Pol I。,1. DNA Pol I在空间结构上有三个位点： (1) DNA模板结合位点结合模板 (2) 核苷酸-磷酸结合位点结合引物 (3) dNTP结合位点结合底物,2. DNA Pol I是一种多功能酶： (1) 5 3的聚合酶活性 催化单核苷酸逐个地结合到DNA模板的3-OH末端，沿着引物的3-OH方向按模板顺序从5 3延伸。 每分子DNA pol I每分钟可以催化约1000个核苷酸的聚合。,(2) 5 3的外切酶活性 只作用于双链DNA（dsDNA） ，从5端切割下一个个单核苷酸。,(3) 3 5的外切酶活性 能从游离的3末端降解单链DNA（ssDNA）成为单核苷酸，通常对双链DNA不作用。,在正常聚合条件下，该酶对dsDNA的3 5外切酶活性受到5 3聚合酶活性的抑制。但一旦出现错配碱基时，聚合反应立即停止，由3 5外切酶迅速除去错误进入的核苷酸，然后聚合反应才得以继续进行下去。所以3 5核酸外切酶活力被认为起着校对功能，对DNA复制的忠实性极为重要。,3. E.coli DNA Pol I在基因工程中的用途: (1) 可用于填补dsDNA上的缺口，以便有效地进行DNA重组 (2) 用于DNA序列分析 (3) 用于制备DNA探针 在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶I的5 3核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。当外切酶活性从缺口的5一侧移去一个5核苷酸后，聚合作用就会在缺口的3一侧补上一个新的核苷酸。随着反应的进行，5一侧的核苷酸不断地被移去，3一侧的核苷酸又按序地增补，于是缺口便沿着DNA分子按合成的方向移动缺口平移（Nick Translation）。,应用缺口平移法制备DNA杂交探针，其典型的反应体系是：在25 l总体积中含有1 g纯化的特定的DNA片段，并加入适量的DNase I、pol I、32PdNTP和未标记的dNTP。 脱氧核糖核苷酸酶 I（DNase I）是一种内切酶，它能够水解单链或双链DNA，形成带有5-磷酸末端的单（寡）核苷酸。,由于32PdNTP比较昂贵，所以一般都采用低浓度的32PdNTP（2 mol/L）和高浓度的未标记的dNTP（20 mol/L）。而且就大多数实验的要求，使用一种32PdNTP就足够了，其他3种均可采用未标记的dNTP，或是用适量的未标记的dNTP稀释每种32PdNTP。 改变反应体系中DNase I的数量，可以控制32PdNTP的参入程度，一般希望有30%左右的32PdNTP参入DNA链。,3.3.2 大肠杆菌DNA聚合酶 I的Klenow片段 （E.coli DNA Pol I Klenow fragment） 用蛋白酶将DNA Pol I 作有限水解，可得到分子量为75000 dal和36000 dal的两个片段，大片段即称为Klenow片段，它具有5 3的聚合酶活性和3 5的核酸外切酶活性，但失去了全酶的5 3的核酸外切酶活性。 Klenow聚合酶可以标记DNA片段末端（5延伸末端）。,对于限制性核酸内切酶EcoR I切割后形成的5延伸末端可用32PdATP标记： 而BamH I切割后形成的5延伸末端可用32PdGTP标记：,3.3.3 T4 DNA聚合酶 是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中分离纯化的一种特殊的DNA聚合酶。 1. T4 DNA聚合酶也是一种多功能酶： (1) 5 3的聚合酶活性 (2) 3 5的外切酶活性 其外切酶活性比E.coli DNA Pol I 的活性高200倍。 (3) 取代反应活性 如果在反应混合物中仅存在一种dNTP，则此酶的3 5外切酶活性将从dsDNA的3末端降解，直到互补于这个dNTP的碱基出现为止，然后在这一位置发生取代反应。,2. T4 DNA聚合酶在基因工程中的应用 (1) 以填充反应标记带有5延伸末端的dsDNA片段 (2) 将DNA的3延伸末端切成平末端 (3) 以取代反应标记带有3延伸末端或平末端的dsDNA片段 (4) 以部分消化dsDNA法标记DNA片段作为杂交探针（链特异的探针）,3.3.4 逆转录酶 是一种有效的转录RNA成为DNA的酶，又称RNA依赖的DNA聚合酶，其产物DNA称cDNA，即互补DNA。 1. 逆转录酶也是一个多功能酶： (1) RNA依赖的DNA聚合酶 以RNA链为模板，以带有3-OH末端的DNA片段为引物，沿5 3方向合成DNA链。 几乎所有真核生物的mRNA分子3末端都有一段Poly A，故加入寡聚dT后，mRNA就可以成为逆转录酶很好的模板，由此可合成cDNA。,(2) DNA依赖的DNA聚合酶 以ssDNA为模板，以带有3-OH末端的DNA片段为引物，沿5 3方向合成DNA链。 可在新合成的DNA链上合成另一条互补DNA。,(3) 外切RNA酶活性 底物是RNA-DNA杂交分子中的RNA链，其水解方向有两种： * 从RNA链 5末端外切：称5 3外切RNA酶 * 从RNA链 3末端外切：称3 5外切RNA酶 2. 逆转录酶在基因工程中的应用： 主要用途是转录真核生物的mRNA成为cDNA，从而制备基因片段。,3. 商品化的逆转录酶有两种： (1) 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）逆转录酶 (2) Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV）逆转录酶 AMV逆转录酶虽能更有效地拷贝复杂的mRNA，但它有很强的外切RNA酶活性。而Mo-MLV逆转录酶的外切RNA酶活性较弱，更有利于制备全长的cDNA。 两种逆转录酶均无3 5外切DNA酶活性，故不具备校对功能，在高浓度dNTP和Mn2+存在下，容易出现核苷酸错误掺入。,3.4 DNA和RNA的修饰酶 3.4.1 核酸酶SI 1. 作用特点： 此酶是从米曲霉（Aspergillus oryzae）中提取的，可降解ssDNA或ssRNA，又称单链特异性酶，其降解产物是5-磷酸末端的单或寡核苷酸片段。,核酸酶SI对DNA底物的活性比对RNA强。高浓度的核酸酶SI可从缺口（nick）或小裂缝（gap）处降解dsDNA。 2. 作用条件： 需要Zn2+作为辅助因子，最适pH是4.5，这是与基因工程的其它工具酶不同的两个特点。 3. 在基因工程中的应用： 由于核酸酶SI能从DNA片段中切除单链尾巴，因而在质粒的重建和DNA重组中被广泛使用。 切除单链粘性末端，产生平末端，再用T4连接酶连接。 切除cDNA的发夹结构。,3.4.2 末端脱氧核苷酸转移酶 1. 作用特点： 此酶是从小牛胸腺中提取的，可催化单核苷酸转移到另一个DNA分子的3-OH末端上，不需要模板，其引物是带3-OH末端的ssDNA （Mg2+为辅因子）。平末端的dsDNA只有CO2+存在时才能作引物。 2. 在基因工程中的应用： 在连接平末端DNA片段时加上互补的同源多聚物（同聚物加尾法）。,3.4.3 外核酸酶III 1. 作用特点： 此酶是从E.coli中分离得到的，是一种从dsDNA的3-OH末端降解产生5单核苷酸的外切酶。 2. 在基因工程中的应用： 产生具有5延伸末端的DNA片段 制备特异的DNA探针,3.4.4 外核酸酶Bal 31 1. 作用特点： 此酶是从乳白短杆菌（Brevibacerium aldidum）中提取的。能以渐进的方式从线型DNA分子的3，5两端同时降解，产物是单核苷酸或寡核苷酸片段。底物可以是带延伸末端或是平末端的dsDNA，对3、5两端的降解速度相同。 2. 作用条件： 降解时需要Ca2+作辅助因子，以EDTA作螯合剂，可使Bal 31失活。,3. 在基因工程中的应用： 可用于组建DNA的物理图谱，以及造成克隆DNA分子的末端缺失。,3.4.5 T4多核苷酸激酶 1. 作用特点： 此酶是从噬菌体T4感染的E.coli中分离的。能催化ATP的-磷酸转移到DNA或RNA的5-OH末端上。,2. 在基因工程中的应用： 可用于缺乏5-磷酸的待连接DNA片段的5端磷酸化：反转录mRNA生成的cDNA、人工合成的DNA片段及PCR扩增得到的DNA都缺少5-磷酸基，在与克隆载体连接之前，需用T4多核苷酸激酶将DNA的5-磷酸化。,3.4.6 碱性磷酸化酶（碱性磷酸酯酶） 1. 作用特点： 从细菌中分离的碱性磷酸化酶简称BAP，从小牛肠中分离的简称CAP。它能特异性地切去DNA或RNA的5-磷