DB21∕T 2631-2016 真鲷虹彩病毒LAMP 检测方法.pdf

ICS 67.120.30 B 50 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 26312016 真鲷虹彩病毒 LAMP 检测方法 Loop-mediated isothermal amplification detection method for Red sea bream iridoviral virus 2016 - 05 - 09 发布 2016 - 07 - 09 实施 辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 26312016 I 前 言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。 本标准主要起草单位：辽宁出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：肇慧君，胡强，刘钊，张达古拉，栾慎顺，张雪。 DB21/T 26312016 1 真鲷虹彩病毒 LAMP 检测方法 1 范围 本标准规定了真鲷虹彩病毒(Red sea bream iridoviral virus， RSIV） 的环介导恒温扩增 （loop-mediated isothermal amplification ，LAMP）检测方法。 本标准适用于 RSIV 病原的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 SN/T 2123-2008出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范 3 符号代号和缩略语 下列缩略语适用于本文件。 LAMP：环介导恒温扩增（Loop-mediated isothermal amplification） Betaine：甜菜碱 Bst酶：Bst DNA聚合酶（大片段）Bst DNA polymerase(large fragment) dNTP：脱氧核糖苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate） 4 试剂、仪器和耗材 4.1 试剂 4.1.1 引物 选取特异性的 RSIV DPO 基因序列， 设计出能专一性鉴别真鲷虹彩病毒的特异性引物组， 该引物组 由如下四条引物组成： 外引物1（F3） ：5-AGATGCACTGCTCAAACTCG-3 外引物2（B3） ：5-CTGATTGAGAAAGCCGCTCA-3 内引物1（FIP） ：5-CCGCGCATCACTCGATGAACTGCGCTCAAAGAAGGCCGAC-3 内引物2（BIP） ：5-CGTGGCCCAGCTGTATGTAGC-TCTCCTCAAGACGGTGGTG-3 4.1.2 商品化 DNA LAMP 法扩增试剂盒。 其中：Bst DNA polymerase：8U/L，-20保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 DB21/T 26312016 2 2反应缓冲液（RM）：含40mM Tris-HCL（pH8.8） 、20mM氯化钾溶液、20mM硫酸铵溶液、16mM 硫酸镁溶液、0.2%Tween-20、1.6M betaine（甜菜碱） 、2.8mM dNTPs每种。 4.1.3 荧光目视染料。 4.2 仪器与耗材 4.2.1 Loopamp 浊度仪：日本荣研化学株式会，型号 LA-320C。 4.2.2 组织研磨器。 4.2.3 普通冰箱和超低温冰箱。 4.2.4 反应管：由朗报 loopamp 提供。 4.2.5 移液器：量程 0.5L10L，量程 10L100L，量程 100L1000L。 4.2.6 吸头，配套移液器待用。 5 生物安全要求 采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守SN/T 2123-2008的有关规定。 6 操作步骤 6.1 样本的采集与处理 6.1.1 采样 按 GB/T 18088 的标准采集样品。体长小于 4cm 的鱼苗取整条鱼，体长大于 4cm 的鱼取脾和肾。 6.1.2 样品处理 从病鱼的脾和肾组织采集的样品， 按照重量体积 1:10 的比例， 加入 0.01mol/L PBS 缓冲液(pH7.2)， 用组织研磨器制备组织匀浆，备用。 6.2 RSIV 的 LAMP 检测 6.2.1 核酸提取 DNA核酸提取可使用市售商品化的DNA抽提试剂盒对组织匀浆液进行抽提。 6.2.2 LAMP 反应体系 LAMP 扩增反应采用脱氧核糖核酸扩增试剂盒（LAMP 法），具体操作步骤参照试剂盒说明书。 RSIV LAMP反应体系见下表。 表1 RSIV LAMP 样品反应体系(25L) 组分 工作液浓度 加样量/L 2反应缓冲液（RM） 2 12.5 外侧上游引物（F3） 5mol/L 1 外侧下游引物（B3） 5mol/L 1 内侧上游引物（FIP） 40mol/L 1 DB21/T 26312016 3 内侧下游引物（BIP） 40mol/L 1 Bst DNA polymerase 8U/L 1 DNA 模板 5 荧光目视染料 1 去离子水 1.5 表2 RSIV LAMP 对照反应体系(25L) 组分 工作液浓度 加样量/L 2反应缓冲液（RM） 2 12.5 引物溶液 DNA（PM DNA） 2.5 Bst DNA polymerase 8U/L 1 阳性对照 DNA（PC DNA）/ 阴性对照 2 荧光目视染料 1 去离子水 6 6.2.3 LAMP 反应过程 按照表1、表2所述配制反应体系：62恒温扩增60min，80 5min使酶失活，反应即结束。 6.2.4 对照反应设置 每次反应设置的阳性对照、阴性对照参照LAMP扩增反应采用脱氧核糖核酸扩增试剂盒进行。 7 结果判定 可通过以下两种方式任何一种进行判定： a）通过浊度仪检测浊度变化判读结果：在LAMP浊度仪检测图中，随着反应产物浊度的增加，模 块颜色转变为红色，表明RSIV基因被扩增，判定为阳性；而反应液未发生扩增时浊度无变化（近于0）， 模块的颜色仍旧为绿色，表明不存在RSIV基因的扩增，判定为阴性。 b）通过观察荧光颜色变化判读结果：反应结束后，观察反应管的颜色变化，反应液显示绿色荧光 的判为阳性，而反应液显示浅橙色荧光的判为阴性。 DB21/T 26312016 4 A A 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 以下所