维生素类药物的分析 (4)

第五章 维生素类药物的分析 The Analysis of Vitamines,维生素是维持人体正常生理机能所必需的生物活性物质。 如果人体缺少某种维生素，就会引起维生素缺乏症，而影响人体的正常生理机能。 例如: VA 缺乏夜盲症 VB1缺乏脚气病,概 述,脂溶性： 水溶性：,按溶解性分类,VA、VD、VE、VK等,B族（VB1、VB2等）、 VC 、烟酸、叶酸、泛酸等,第一节 维生素A的分析,一结构与性质 1 化学结构,R=H VA醇 VA1 R= COCH3 VA醋酸酯 R= COC15H31 VA棕榈酸酯,（1）环己烯+共轭多烯侧链； （2）天然VA侧链为全反式； （3）天然来源主要是鱼肝油，为醋 酸酯，棕榈酸酯等,目前多由人 工合成。,结构特点：,a. 紫外吸收 具有共轭多烯侧链紫外吸收。 最大吸收波长在325328nm，随VA存在状态以及所用的溶剂，最大吸收波长的位置有所不同,2 .性质, 不溶于水 溶于乙醚，氯仿，异丙醇，环己烷，脂肪和油。,b.溶解性：,共轭多烯侧链性质非常活泼.,c. 不稳定性,维生素A的氧化产物：,环氧化物, 维生素A醛, 维生素A酸,or, 鉴别 含量测定,d.与SbCl3作用 Carr-Price反应,无水,二. 鉴别试验 1. 三氯化锑反应,无水,2. 紫外吸收光谱 VA的无水乙醇溶液在326nm有最 大吸收。,确认醇或酯，是醋酸酯或其他酸酯， 例：VA和其标准品用环己烷溶解 展开剂：环己烷乙醚（80：20） 板：硅胶G 显色：SbCl3T.S. Rf： VA 醇 0.08 VA 醋酸酯 0.41 VA棕榈酸酯 0.75,3、TLC：,三含量测定,1.概述 共轭多烯的结构具有特征的紫外吸收。 相关物质结构相似,维生素A最大吸收 波长附近也有吸收，对测定有影响。 Morton和Stubbs等人提出了三点校正法。,紫外分光光度法三点校正法,2. 原理（根据、假定）,物质对光的吸收具有加和性，即,维生素A中的不相关吸收在 310340nm范围内近似一条直线。,效价为维生素A1的40%，max345350nm,3. 相关物质的吸收,a. 维生素A的衍生物,维生素A2 去氢维生素A,效价低于维生素A1，max385390nm, b. 维生素A的氧化产物 已介绍。,维生素A3 去水维生素A, c. 合成时的中间体,侧连有4个双键应有 种异构体。 目前，包括维生素A在内，共发现有 6种异 构体。它们是：, e. 维生素A异构体, d. 鲸醇 维生素A醇的二聚体，没有生物活性,新维生素Aa,新维生素Ab,新维生素Ac,异维生素Aa,异维生素Ab,维生素A,1：维生素A的max 2、3：分别在1两侧,4. 三个波长的选择方法,等波长差法：,1=328nm; 2 =316nm; 3=340nm,这两个波长分别在1两侧12nm处，即,等吸光度法：,1=325nm; 2 =310nm; 3=334nm,VA在这两个波长下的吸光度应该等于1下 的吸光度的 ，即,5. 方法,Chp收载有2种方法。,第一法（适用于酯式维生素A的测定）,a. 操作方法,最大吸收波长确认 max 在326329nm，第一法测定。 max不在326329nm，第二法测定。,b. 计算方法,计算吸收度比及比值差,首先要计算吸收度比值 。,然后计算吸收度的比值差。,计算校正吸收度,吸收度校正公式：,换算因数,定义：每一个 数值所相当的效价。,1IU=0.344g全反式维生素A醋酸酯， 1g的维生素A醋酸酯就相当于,维生素A醋酸酯,练习题：维生素AD胶丸中维生素A的含量测定 已知：平均胶丸重为0.0815g 维生素A的标示量为10000IU/丸 取样：,求：维生素A的标示百分含量。,测定数据如下表,首先要求样品的 。,根据比尔定律,A为测得吸收度or校正吸收度,首先计算吸收度比值和吸收度比值差。（填于上表）,由此可知，应该用测得的328nm处的吸收度计算。,然后计算校正吸收度与未校正吸收度相差的百分数,由结果知，需计算校正吸收度。,所以，维生素A的标示含量,这样,第二法（皂化法）： 消除植物油干扰：适合VA醇,b.在300，310，325和334nm处测定吸收度，找出max c.计算 d.校正公式 A325（校）=6.815A325-2.555A310- 4.260A334 e. 判断,5、注意事项 （1）VA遇光易氧化变质，操作应半暗室 中快速进行，所用试剂不得含氧化性物 质，以防VA紫外线或氧化性物质破坏。,（2）用三校正法测定时，一点在max处，其余两点均为吸收曲线的上升和下降陡坡处。对波长的正确性要求严格。340nm处，若波长误差0.5nm，可影响结果-3.12.07%。所以测定时所用仪器的波长读数应注意，必要时应作标准。,维生素A醋酸酯胶丸含量测定:取内容物39.1 mg,加环 己烷溶解并稀释成100ml，在下列五个波长处测得吸 收度A值如下：,已知：平均胶丸内容物重为0.08736g;维生素A的标示量为3000 IU/丸 试求：维生素A的标示百分含量？,维生素A醋酸酯胶丸的含量测定，取内容物W，加环己烷溶解并稀释至10ml，摇匀，精密量取0.1ml,再加环己烷稀释至10ml ，使其浓度为915IU/ml。已知内容物平均重量为80.0mg,每丸标示量为10000IU。试计算取样量（ W ）的范围是多少？,第二节 维生素E的分析,名称：消旋生育酚醋酸酯 母核：苯骈二氢吡喃衍生物 苯环上有一乙酰化的酚羟基 侧链：脂肪烷烃,一化学结构与性质,二、鉴别试验 1、硝酸反应： 本品，无水乙醇溶解，加硝酸，75加热约15分钟，显橙红色。 2、水解后氧化反应： 本品，在碱性条件下水解，得生育酚，在联吡啶和三氯化铁试液的作用下，反应产生血红色配离子。,3、UV吸收： VE的0.01%无水乙醇液： max=284nm min=254nm,三、杂质检查 检查游离生育酚: ChP2000 P798 取0.1g样品，按铈量法用Ce(SO4)2(0.01mol/L)滴定，以二苯胺为 指示剂，消耗Ce(SO4)2液不得超过1.0ml。,（一）铈量法 1、原理： VE用硫酸加热回流，水解成生育酚，用硫酸铈定量地氧化为对一生育醌，过量的硫酸铈氧化二苯胺指示剂而指示滴定终点。 终点：亮黄灰紫 空白试验,四、含量测定,2、反应条件 （1）VE在H2SO4酸性条件下水解为宜。 碱性溶液中游离生育酚易被氧化。Ce(SO4)2液滴定在酸性溶液中进行,如在碱性中会生成碱式盐而影响测定。,（2）Ce(SO4)2溶于酸水溶液，不溶于醇,生育酚溶于酸而不溶于水, 滴定过程中应有一定浓度的乙醇。 （3）本法适用于纯度高的VE供试品。,（二）气相色谱法：Chp2000 1、色谱条件及系统适应性试验 色谱柱：2m4mmI.D.硼硅玻璃柱， 内装硅藻土（80100目） 固定相：硅酮（OV-17） 涂布浓度 2% 载气：N2， 流速:含2%固定相：以1820分钟为宜； 含5%固定相：以3032分钟为宜,柱温：265 内标：正三十二烷 检测器：FID（氢火焰离子化检测器） 性能要求： 理论塔板数按VE峰计算应不低于500， VE峰与内标物质峰的分离度应大于2。,2、溶液配制： 内标溶液：正三十二烷的环己烷溶液 （1.0mg/ml） 对照溶液：对照品溶解于内标溶液中 (1mg/ml) 供试品溶液：供试品约50mg，用内标溶液，溶解并稀释至50ml,4、供试品测定 mg=FAxMs/As Ax ：供试品峰面积 F：校正因子 As ： 内标物的峰面积 5、特点： （1）简便快速、专属性强，适用于VE、VE制剂及多种维生素制剂中VE的测定。 （2）需要特殊仪器,（三）高效液相色谱法 日本药局方（JP13） 色谱条件： 柱：ODS 流动相：甲醇水(49:1) 检测波长：292nm 对照品法定量,第三节 维生素B1的分析,一、化学结构与性质 1.结构：,氯化3-（4-氨基-2-甲基嘧啶-5-）甲基-5-（2-羟乙基）-4-甲基噻唑的盐酸盐,2. 结构特点： a.氨基嘧啶次甲基噻唑环季铵化合物 b.碱性基团： 嘧啶环上的氨基 可与酸成盐 噻唑环上的季铵,3. 性质： 硫色素反应 VB1噻唑环在碱性条件下可被铁氰化钾K3Fe(CN)6等一些氧化剂氧化后，与嘧啶环上的氨基缩合成具有荧光的硫色素。, 沉淀反应 VB1的含氮杂环，能和生物碱沉淀试剂反应产生沉淀。 如：VB1与硅钨酸反应可生成组成一定的沉淀。 重量法测定VB1含量。, 硫胺显碱性 具有两个碱性基团: 噻唑环上的季铵 嘧啶环上的氨基 可以和酸成盐。 如：盐酸硫胺、硝酸硫胺。, 加碱分解后与醋酸铅反应 VB1与NaOH试液一起加热，分解产生NaS，可与PbAc2反应生成PbS的黑色沉淀。 维生素B1的水溶液显氯化物的特征反应。,二. 鉴别试验,1. 硫色素荧光反应,VB1专属反应，用于鉴别和含量测定。,2、沉淀反应： 可与某些生物碱沉淀试剂生成组成恒定的 沉淀 如：与碘化汞钾产生淡黄色沉淀 与碘生成红色沉淀 与硅钨酸生成白色沉淀 与苦味酸生成扇形白色结晶,三. 含量测定 非水滴定法（ChP所用方法） 硅钨酸重量法 银量法 硫色素荧光法 紫外分光光度法 比色法 络合滴定法,（一）非水溶液滴定法： 1、原理： VB1分子中含有已成盐的伯胺和季铵基团，在非水溶液中，在醋酸汞存在下，均可被高氯酸滴定。,2、方法： 溶剂：冰醋酸 指示剂：喹哪定红- 亚甲蓝混合指示液 滴定剂：高氯酸 醋酸汞： 终点：天蓝色 空白校正： T=16.86mg/ml,（二）硅钨酸重量法,2VB1硅钨酸,白色沉淀4HCl,1、原理： VB1在酸性溶液中与硅钨酸作用 产生沉淀，根据沉淀的重量和供试品 的重量即可计算其含量。,2、计算： 2VB1的分子量为2337.27 沉淀的分子量为3479.22 换算因数=0.1939 （含义：1g沉淀相当于0.1939gVB1）,3、测定方法：,4、实验条件 （1）取样量： 应在50mg左右，不得少于25mg。 （2）加入盐酸的目的：易于过滤。 酸量不足：沉淀的颗粒过细。 酸量过多：无太大影响。,（3）硅钨酸的用量： 硅钨酸：VB1= 8：1 用量不足，导致结果偏低 （4）干燥温度： 80，干燥3hr，至恒重，沉淀含4分子结晶水，换算因数为0.1939,（5）硅钨酸的加入速度 用滴管一滴一滴加入，纯度高快加，纯度低慢加。 防止沉淀表面吸附的杂质来不及离开而被沉淀包围。 （6）煮沸时间 25min为宜 使沉淀颗粒大，利于过滤洗涤。,（7）沉淀的洗涤 用热稀盐酸洗涤，洗涤液用量不得多于50ml，否则，沉淀会部分溶解 （8）洗器 用4号垂熔玻璃漏斗为宜。,4、重量法特点 （1）比较准确、灵敏； （2）方法简便，不需要特殊仪器； （3）恒重比较费时间。,第四章 维生素C的分析 一. 化学结构,结构特点： 维生素C分子中具有2个手性C原子，具有4种光学异构体。其中生理活性最强的是L（+）-抗坏血酸,D(-)-异抗坏血酸,L(+)-异抗坏血酸,L(+)-抗坏血酸,D(-)-抗坏血酸, 具有内酯结构。 碱性下可水解。 具有烯二醇基。 还原性，能够被氧化成去氢抗 坏血酸。 酸性,能与碱成盐。,二性质与鉴别试验 1. 酸性 烯二醇结构酸性。 C3-OH， pKa=4.17(共轭效应) C2-OH，pKa=11.57(邻位羰基) 一元酸. 能与NaHCO3作用生成钠盐。,2.还原性 烯二醇基还原性。 如：,3. 水解反应,L-二酮古罗糖酸 (无生物活性),4. 荧光反应,5. 糖的性质 VC的结构很象糖结构，具有糖的性质。,这个反应的摩尔比是12。,三含量测定,1. 碘量法,a. 原理,b. 操作,终点颜色：无色蓝色 1ml 0.