微生物药物学--微生物资源与微生物新药发现

第三章 微生物资源的多样性与微生物新药的发现,第一节 稀有放线菌是产生微生物新药的重 要源泉 第二节 黏细菌是一类值得关注的微生物新 资源 第三节 从植物内生菌中筛选微生物新药 第四节 从海洋微生物中筛选微生物新药,第一节 稀有放线菌是产生微生物 新药的重要源泉,所谓的稀有放线菌 （rare actinomycetes)即为除链霉菌属外的其它属的放线菌。,稀有放线菌是产生微生物 新药的重要源泉,到1974年止，放线菌来源的抗生素几乎都是由链霉菌属产生的（约占2000种抗生素中的95%）。但在随后6年的报导中，由放线菌产生的仅占25%。事实证明，稀有放线菌是发现新抗生素的极好来源，且它们产生各种不同抗生素的能力不亚于链霉菌属。同样，细菌和霉菌也仍是产生新的生理活性物质的源泉，特别是近年来从霉菌的代谢产物中发现新的生理活性物质的数目正在不断增加。,小单孢菌能产生独特化学结构的生物活性物质,能产生独特化学结构的生物活性物质。近年来从小单孢菌中发现了引人注目的结构新颖的烯二炔类抗肿瘤抗生素calicheamicin1（结构如图所示），由棘孢小单孢菌.echinosporaspcalichensis所产生，与肿瘤细胞作用时,分子中烯二炔部分起“分子核弹头”作用，三巯基部分起“扳机”作用，寡糖部分起“识别”作用，能选择性地结合并切除双链中的特定片段，如、和。,Calicheamicin1的化学结构,小单孢菌能产生独特化学结构的生物活性物质,碳黑小单孢菌.carbonacea产生强效的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的寡糖类抗生素ziracin(如图3 所示)。它对甲氧西林和万古霉素耐药菌作用很强。对甲氧西林敏感和耐药的肺炎链球菌的为00320125/，对青霉素耐药菌的为01258/，对万古霉素敏感和耐药菌的为0452/。50为25/。静注剂量1/的血浓度为10/。虽已进入期临床试验，但没有获得批准。除产生抗生素外，小单孢菌还产生许多非抗生素的生物活性物质。,Ziracin的化学结构,游动放线菌(Actinoplane sp.)ATCC 3076产生的抗细菌抗生素雷莫拉宁。,黏细菌 一类值得关注的微生物新资源,Epothilons是由粘细菌纤维束菌(Sorangium cellosum)产生的新型细胞毒化合物。它是一种新的16元环多酮大环内酯,含有一个噻唑基和环上的一个环氧结构(结构如图所示)。该菌产生和两种主要组分、四种次要组分以及36种极微量成分。,Epothilons的化学结构,从植物内生菌中筛选微生物新药,要利用植物内生菌这一资源丰富的宝库，首先要将内生菌从植物中有效地分离出来，然后应用分离色谱层析等生物分析方法从内生菌培养物滤液中分离并鉴定出令人感兴趣的生物活性物质，如：紫杉醇、cryptocin、oocyclin、isopestacin、pseudomycin和ambuic acid等。本文主要阐述了植物内生菌分离的一般规则，其生物活性代谢产物的最新研究进展，以期读者对植物内生菌的重要性有更深刻的认识。,天然药物的筛选已成为现今的一个研究热点，植物是天然药物的主要来源之一。生活在植物组织中的植物内生菌，由于其与植物的关系密切，同时其产生的丰富多样的次生代谢产物具有多种生物活性，因此从中发现新的有意义的化合物的潜力相当大，其作为新的治疗药物或前体药物的潜在来源已经引起人们的广泛重视。,一、历史概况,1898年 Vogl从黑麦草的种子中首次分离出第一株内生真菌。 但在此后的70年间，内生菌的研究进展缓慢；直到70年代，Bacon等人发现高羊茅中的内生真菌和毒素的产生有关， 从此以后植物内生菌的研究在国际范围内引起了广泛的重视。,二、植物内生菌,目前较常用的宽泛实用性概念：,植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌和细菌，被感染的宿主植物（至少是暂时）不表现出外在病症， 可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。即我们可以把植物内生菌理解为植物组织内的正常菌群，它们不仅包括了互惠共利的和中性的内共生微生物，也包括了那些潜伏的宿主体内的病原微生物。,三、植物内生菌的生物多样性,宿主植物种类多样性 内生菌自身种类多样性 内生菌在植物组织中分布多样性,内生菌普遍存在于目前已研究过的各种陆生及水生植物中。目前全世界至少已在80个属290多种禾本科植物中发现有内生真菌。自20世纪70年代后期， 内生菌在一些重要的经济林木如针叶类的各种冷杉、云衫、红杉、紫杉、松柏等以及阔叶的桉树、栎树、桦树、桤木等植物树皮、枝叶中相继被发现并得到了广泛的研究。进而在多种灌木、草本植物以及栽培作物、果树甚至藻类、苔藓和蕨类植物中也发现了内生菌。,对于一种植物而言，从中可分离到的内生真菌和细菌通常为数种至数十种，有的甚至多达数百种。在热带雨林植物中，内生菌的多样性更为突出。 例如：Anorld等人最近分析了巴拿马中部雨林中两种植物叶子中的内生菌，结果发现分离自83片健康叶子上的内生菌可多达418个形态学种,主要内生真菌,子囊孢子类：核菌纲 盘菌纲 腔菌纲 广泛分布的种属：半壳霉属 拟隐孢霉属 拟茎点霉属 叶点霉属,常见内生细菌,大多数为土壤微生物类群： 假单孢菌属 芽孢杆菌属 肠杆菌属 土壤杆菌属,内生真菌的菌丝生长于植物组织的细胞间，分布于叶鞘、种子、花、茎、叶片和根。其中叶鞘和种子的菌丝含量最多而叶片和根的含量极微。,四、植物内生菌的作用,促进宿主植物的生长 增强宿主植物的抗逆性 产生具有生理活性的代谢产物,内生菌能产生IAA等植物生长激素 内生菌增强宿主植物对氮、磷等营养元素的吸收 如：禾本科农作物上的内生细菌具有很强的固氮能力。感染内生真菌的牧草对氮、磷的摄取能力也有所提高。,感染内生菌的宿主植物对环境具有很强的抗逆性，如抗干旱、抗病原细菌和真菌、抗线虫、阻抑昆虫和食草动物的采食等。,在内生菌中，有对宿主植物体内某些活性成分的形成有重要影响者，也有产生和宿主植物相同或相似的生理活性成分。,五、植物内生菌产生的生理活性物质,抗生素类物质 抗肿瘤活性物质 植物生长调节物质 杀昆虫物质 其他类型的活性产物,1.抗生素类物质,随着细菌耐药性的出现激发了人们寻求更多更好的抗菌素；同时，由于艾滋病和器官移植引起的真菌感染人数不断增加，对于高效抗真菌制剂的需求也不断增强；加之目前治疗原生动物寄生感染药物的匮乏，寻找更新更有效的治疗药物来解决这些问题已迫在眉睫。以往，抗生素的主要来源是土壤微生物。而今，植物内生菌这一多样性十分丰富却尚未开发的微生物类群看来是一巨大资源,刺盘孢属内生菌Colletotrichum gloeosporicoides 产生的Colletotric acid,抗微生物活性,内生菌Colletotrichum sp产生的,6-isopenylindole-3-carboxylic acid,3,5-dihydroxy-6-acetoxy-ergosta-7,22-diene,3,5-dihydroxy-6-phenylacety-loxy-ergosta-7,22-diene,抗微生物活性，对人畜和植物病原真菌和细菌有良好抑制作用,内生真菌Cryptosporiopsis cf. quercina 产生的新型环肽抗生素cryptocandin,对癣菌及白色念珠菌等人类病原真菌具有强烈抑杀作用其MIC与临床应用的抗真菌药amphotericin B相当，具有良好开发前景,内生真菌Cryptosporiopsis cf. quercina 产生的酰胺类生物碱cryptocin,对稻瘟病菌及其他多种植物病原真菌具有很强的抑杀作用,内生菌Cytonaema sp.产生的 Cytonic Acid A (1) 和 Cytonic Acid B (2),抑制人细胞肥大病毒组装,镰孢霉属内生真菌Fusarium sp. CR377产生的一种新型的酮内酯（pentaketide）化合物,对白色念珠菌有较强活性,内生真菌Fungus CR115 产生的一个二萜化合物Guanacastepene A,对多种革兰氏阳性和阴性细菌和白色念珠菌有活性,内生菌Geniculosporium sp.产生的 Geniculol (1) 和 Cytochalsin F (2),杀藻剂,内生真菌Pestalotiopsis jesteri 产生的新的环己烯酮环氧化合物Jesterone,对引起大多数植物致病的致病真菌有选择性活性,内生菌Pestalotiopsis microspora 产生的Ambuic acid,抗真菌剂,内生菌Phoma sp. NRRL 2 5697 产生的5种新的化合物Pginadecakubs A-D (1-4) & Pginaoebtebibe A (5) 具有抗革兰氏阳性菌活性,拟点霉属内生菌Phomopsis sp.产生的 Phomoxanthones A (1) & B (2)是两个新的氧杂蒽酮二聚体,具有显著的抗疟疾和抗结核活性,分离自锡兰桂小枝的内生菌Muscodor，其所释放的挥发性物质（醇，酯，酮，酸和脂）对人及植物的致病真菌和细菌有很强的杀伤性 。,分离自欧洲紫杉（Taxus baccata）的内生真菌Acremonium sp.产生的白灰制菌素A具有抗真菌活性。,分离自欧洲杜松（Juniperus communis）的内生真菌Hormonema，从其发酵液中分离出一种新的三萜糖苷对念珠菌属和曲霉属的真菌具有很强的活性,2.抗肿瘤活性物质,1） 紫杉醇（Taxol） 紫杉醇是一种以极低含量存在于各种紫杉属植物树皮和树叶中的萜类化合物，临床上是治疗乳腺癌、子宫癌和卵巢癌的良效药物，自1992年投入市场以来，取得了临床疗效和市场效应的极大成功。,Taxol,1993年美国学者Stierle等人首次从短叶紫杉（Taxus brevifolia）的树皮中分离出一株内生的真菌新种Taxomyces andreanae，在培养液种能产生紫杉醇和其他紫杉烷类化合物。,至今已在短叶紫杉、喜马拉雅红豆衫、欧洲红豆衫、南方红豆衫、云南红豆衫、落羽衫、榧树中分离到了许多种能产生紫杉醇的内生真菌和放线菌。其中内生真菌微孢拟盘多毛孢的紫杉醇产量已初步显示出其商业潜力。,一些能够产生紫杉醇类物质的植物内生菌及其植物宿主,这些发现为人类突破植物资源周期长、不可再生等限制，利用植物内生菌来工业化发酵生产重要植物药物提供了新的思路。,2）ras法呢基转移酶抑制物,抑制法呢基蛋白转移酶（FPTase）或ras法呢基转移酶的化合物往往具有抗肿瘤活性。,A. Lingham RB等曾报道毛壳属内生真菌Chaetomella acutisea产生的长链脂肪酸Chaetomellic acid A和B以及从一种小檗叶的某种内生真菌中发现的天然产物oreganic acid可选择性抑制法尼基蛋白转移酶（FPTase），具有抗癌活性。,B. Ishii T等报道，从Phoma sp.中分离得到的一种生物碱TAN1813可抑制鼠脑ras法尼基转移酶，对各种人体肿瘤细胞的增殖也有抑制作用，并可引起NIH3T3/kras细胞形态的改变。 此外，内生菌Coniothyrium sp.产生的醌类化合物对ras法呢基转移酶也具有很高的抑制活性。,3）植物黄酮类物质,植物中的一些黄酮类物质，如香豆素，异香豆素等，具有综合的抗癌活性，在分离自加拿大Cirsium arvense的一个内生真菌Mycelia sterila的发酵液提取物中发现了新的异香豆素。从中国南海红树嫩叶分离出来的内生真菌No.2533，其发酵液提取物分离出2种新的异香豆素类化合物enalin A和B，均具有抗癌活性。,4）生物碱类,从来源于传统药用植物雷公藤的内生真菌Rhinocladiella sp. 中发现了三种新生物碱，实验结果表明它们对多种人肿瘤细胞有很强的抑制作用,此外，从Ficus microcarpa L的树皮中分离到的一株未鉴定的内生菌的发酵液中分离到一种新的生物碱nomofungin，该化合物能干扰培养的哺乳类细胞微丝并且对于Lo Vo和KB细胞有轻微的毒性，是一种新型的微丝干扰剂,5）其它,Brady SE等通过BIA法从一株内生真菌分离到具有抗癌活性的二蒽醌类化合物cytoskyrin A。 Huang Y等也使用MTT法从三种药用植物中筛选具有抗癌活性的植物内生真菌。这些结果表明植物内生真菌是新的抗癌药物或前体的重要来源。,已有多篇文章报道内生真菌可产生植物生长激素物质,如：Mcinroy等人从玉米、棉花上分离到具有促进植物生长的内生细菌。 从柑橘属果树中分离出来的Penicillium. Italicum也能产赤霉素（GA）。 在对5种从药用植物中分离到的内生菌进行研究时发现，它们各自的发酵液中都含有至少一种植物激素：GA，IAA，ABS（Abscisic acid），Z（Zeatin），ZR（Zeatin riboside）,这些由内生真菌产生的植物激素是揭示内生真菌促进药用植物生长机制的重要物质,禾本科植物内生真菌能产生4大类 即： 有机胺类（peramine） 吡咯里西啶类（loline） 吲哚二萜衍生物类（lolitrem B） 麦角碱类（ergovaline） 多达十种的生物碱，这些生物碱具有抗病原菌，抗线虫，增强植物他感作用等多种生物学活性，其中大多数对食草昆虫乃至哺乳动物（牛、羊）具较强的毒性。,从内生菌感染的一种草熟禾中分离到数个对蚊子幼虫有毒性的黄酮类化合物。 从云杉等针叶树的内生真菌的次生代谢产物中，Findlay等人发现了一系列具抗虫活性的物质。,雷公藤的内生真菌Fusarium subglutinans产生的2中二萜化合物subgutinol A和B,具有无细胞毒性的免疫抑制作用,subgutinol A,六、前景,从各个层次上深入探讨内生菌寄主之间的相互作用，将有助于了解内生菌的生物学本质以及未知生态学作用 从传统药用植物以及一下特殊环境中植物的内生菌代谢产物中寻找新型活性物质，将继续是内生菌研究的主流 分子生物学手段将在内生菌研究的各个方面发挥重要作用,植物内生菌的生境特殊性决定了其既有理论研究的广度和深度，又有多方面的应用潜力，是个潜力巨大，尚待开发的微生物新资源。,第四节 从海洋微生物中筛选微生物新药,一、研究背景和现状 二、海洋微生物的生活习性及其多样性 三、海洋微生物活性成分的研究及药物 的开发 四、海洋微生物药物研究展望,一、研究背景和现状, 陆栖微生物的代谢产物，已成为像抗生素这样生物活性物质的源泉。根据下列的理由，深信海洋微生物的代谢产物，也是希望之所在。,一、研究背景和现状,(1) 自然界里，微生物的种类和数量是明显地随着环境不同而改变。 (2) 微生物代谢产物的生产，会受所使用的培养条件调节。 (3) 已经知道许许多多生物活性物质是通过次级代谢而产生的，也因此将同时产生小量其他的相关物质。如果引进更敏感的测定方法来检测；更有效的的分离方法来纯化；更精密的方法来分析，将能得到新生物活性化合物，即使其在发酵液里含量甚少。,一、研究背景和现状,(4) 已经知道大多数生物活性化合物的产生是菌株特异的，而不是分类学上种属特异的。因此，可以直接培养分离到的菌株以取得新生物活性化合物，而无须先进行菌株分类。 (5) 要成功地发现新的生物活性物质，用于分离微生物菌株的样品的采集是一个重要环节。近来，样品采集的设计已为发现新生物活性化合物作出了重大贡献。最近，已实现通过肉眼观察，采集深海海底的样品。 (6) 最近开发的在不减压的情况下分离和培养嗜压微生物的方法和设备，将对新微生物的生物活性产物的研究作出贡献。,二、海洋微生物的生活习性 及其多样性,1、耐盐性：一般地讲，海洋细菌的盐耐受性使最适宜生长于含2%4%的培养基。从放线菌来说，大多数海洋链霉菌比陆栖链霉菌有较广的盐而受性(1%7%NaCl)，尽管有一些对小于1%的NaCl仍敏感，和另一些能而受大于7%NaCl。由此可见，某些链霉菌的先祖可能来自陆地。,二、海洋微生物的生活习性 及其多样性,2、耐压性：静压力是深海的很重要的环境参数。只有那些嗜压和耐压的细菌才能在深海的高静压下生存。,二、海洋微生物的生活习性 及其多样性,3、寄生性：一些完全适应了海洋寄生、处于寄主体内微环境中的海洋微生物完全可能发展了非钠依赖的其它特性。,海洋微生物的种类,关于海洋微生物的种类，目前还无法做出准确的判断。只知道海洋中的微生物种类可能约为陆生微生物的20倍以上。其中的土著海洋微生物与外来微生物的比例同样不清楚。,开发海洋微生物资源的意义, 海洋丰富的微生物资源为新药发现提供了多样的物种基础，它的开发将使人类进一步认识自然； 新抗生素由于结构与作用机制可能有别于陆生来源的抗生素，将极大地克服目前的抗药性，同时为新药的合成提供新的“母核”； 微生物易于培养、发酵，可无限再生而无需过度开采野生资源，经济和社会价值较大。,三、海