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17.3.02 AOAC 官方方法官方方法 986.33 牛奶中细菌和大肠菌群的检测牛奶中细菌和大肠菌群的检测 再水化干膜法再水化干膜法 （Petrifilm 细菌总数测试片和细菌总数测试片和 Petrifilm 大肠菌 群测试片） 大肠菌 群测试片） 首次发布首次发布 1986 最终发布最终发布 1988 A. 原理原理 本方法使用含有干粉培养基和冷水可溶性凝 胶的细菌培养平板。每个平板加入 1.0 毫升未稀 释或稀释后的样品。使用塑料压板轻压盖好的上 层膜，让样液充满整个 20 平方厘米的生长区域。 让凝胶凝固后进行培养，然后计数。可使用移液 管或循环连续的移液枪进行加样。 B. 材料材料 (a) Petrifilm细菌总数测试片含有标准方法 培养基营养，940.36A(g)(见 17.1.02)，上层膜， 膜上的冷水可溶性凝胶和 TTC 指示剂。 圆形生 长区含 20 个 1 平方厘米的方格。 Petrifilm 细菌 总数测试片符合这些规格（生产商为 Medical Surgical Division/3M, 275-W 3M Center，St. Paul, MN 55144） 。 (b) Petrifilm大肠菌群测试片 含有符合 “食品中微生物检测方法纲要” （第三版，1990， 美国公共卫生协会，华盛顿）中列出的 APHA 标 准的结晶紫中性红胆盐营养培养基，冷水可溶性 凝胶和 TTC。Petrifilm 大肠菌群测试片符合这些 规格（生产商为 Medical Surgical Division/3M, 275-W 3M Center，St. Paul, MN 55144） 。 (c) 塑料压板和 Petrifilm 测试片一起提供，有 一个凹面和一个平面，用于将测试样品均匀地扩 散在测试片中的生长区域。 (d) 移液管细菌校准设备或持续移液注射器， 以移取 1.0mL（0.1 mL 的误差） 。也可使用自动 移液器。 (e) 菌落计数器标准设备，优先使用 Quebec 型，或者是能够提供同等放大倍数和可见度的设 备。 D. 分析分析 （a）细菌菌落计数将 Petrifilm 细菌总数测试 片置于平坦表面。提起上层膜，将 1mL 样品均液 接种于测试片中央。小心将上层膜覆盖在接种面 上。对压板（平面朝下）的中心轻轻施压，将样 品分布于限定的生长区域内。将测试片静置 1 分 钟以上，以使凝胶固化。将测试片置于 351C 的条件下培养 482 小时。 将测试片水平朝上放置于培养器中。每叠不 要超过 20 片。在培养结束后及时进行计数。培 养结束时，测试片能够在冷冻条件下保存 7 天 （-15C） ，但应避免将此作为常规操作。 使用标准菌群计数器计数，也可以使用放大 镜辅助计数。菌落被染成深浅不同的红色。在合 理计数范围(30-300 个)内计算所有的菌群数。 每个平板的总菌落数（若一个稀释度下有重 复平板则计算其平均数）乘以稀释倍数即为细菌 总数。 当计数连续稀释度下的平行重复样时，在 计算不同稀释度菌落数的平均值前，计算各个稀 释度下的菌落平均值。 当菌落数超出 300 时可 采取估算的方法而且最终报告为估算数。 此时， 圆形生长区可视为由 20 个平方厘米的方格组成。 当需要分离其中的菌落做进一步鉴定时，揭开上 层膜，从凝胶中挑取单菌落。 （b）大肠菌群计数使用大肠菌群测试片，并 用与 （a） 相同的方法处理， 只是使用塑料压板时， 平面朝上。 35C 培养 242 小时。 计数与（a） 相同的方法处理，但仅计数带有一个或多个气泡 的红色菌落 （距离小于 1 个菌落半径）