间充质干细胞衰老机制的研究进展

解螺旋陪伴医生科研成长 1 / 5 间充质干细胞衰老的机制及相关信号通路间充质干细胞衰老的机制及相关信号通路 干细胞是一种具有自我更新及多向分化潜能的未成熟细胞，根据来源可分为胚胎干细胞、成体干 细胞及多能诱导干细胞。其中间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)应用最多，因其来源广 泛（骨髓、脂肪、肌肉、羊水、脐带血等）。MSCs是一类具有高效自我更新和多向分化潜能的成体干 细胞，具有易于体外培养、易与宿主细胞建立联系和免疫耐受等优势，是再生组织工程及多种疾病治 疗的理想种子细胞。 为获得足够数量的MSCs用于基础和临床研究，MSCs体外扩增培养的环节必不可少。当分裂次数达 到Hayflick极限后细胞就会发生衰老，并最终通过细胞凋亡而死亡。MSCs在扩增培养过程中同样会因 衰老及凋亡，导致其生物学功能下降。近年来研究表明，MSCs的衰老机制主要集中在：端粒与端粒酶、 氧化应激损伤、SIRT家族蛋白、高糖状态、wnt- catinin通路激活及DNA损伤等方面1。 1 1、MSCsMSCs的衰老机制的衰老机制 (一)端粒与端粒酶 端粒是位于真核细胞线状染色体末端、由短小高度重复非转录 DNA 序列(TTAGGG)和一些结构蛋白构成 的特殊结构，在染色体定位、复制、保护和控制细胞生长及寿命方面具有重要作用。随 MSC 分裂次数 增多端粒逐渐缩短，当端粒短缩到无法继续 DNA 复制及不能保证染色体稳定性时就会诱发 MSC 衰老， 导致细胞分裂停滞并无法继续复制，最终凋亡 2。端粒长度主要靠端粒酶（一种可延长端粒长度的逆 转录酶）维持。和鼠的 MSC 相比，人 MSC 的端粒明显更短，且不会在长期培养中自发启动转化而逃脱 细胞衰老。将人端粒酶应用于大鼠骨髓 MSCs 时，下调人端粒酶表达可缩短端粒长度，抑制细胞增殖， 促进细胞凋亡；而过表达人端粒酶可增加端粒长度，促进细胞增殖及减少细胞凋亡 3。近来还有研究 发现端粒完整性不仅取决于端粒长度，还取决于端粒/亚端粒区域的表观遗传状态。GADD45 A 通过诱 导碱基切除修复依赖的 CpG 岛去甲基化，产生针对 DDR 信号的容许性染色质状态，特别是在短端粒/亚 端粒区域。GADD45 A 的缺失促进亚端粒区的染色质致密化。而敲除 Gadd45a 可以改善肠道干细胞 （ISC）的功能，延长端粒酶缺陷小鼠（G3Terc-/-）的寿命 4。解螺旋 (二)氧化应激损伤 病理条件下引发的氧化应激损伤能产生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS) ，高浓度ROS具 有细胞毒性作用及诱导细胞损伤的能力。伴随年龄及体外传代次数的增加，MCS产生的ROS逐渐增加， 过量ROS或外源性H2O2可损伤MSC的增殖分化能力。亚致死量ROS及电离辐射可导致人脐带来源MSCs的 解螺旋陪伴医生科研成长 2 / 5 DNA损伤，导致DNA合成减少及细胞增殖减慢，导致细胞衰老。通过外源性H2O2诱发人子宫内膜来源 MSCs发生衰老，抑制p38/MAPK信号通路可部分减轻H2O2诱发的细胞衰老5。亚致死剂量H2O2可使骨髓 MSCs细胞周期停滞于G0/G1期，细胞成骨分化能力明显抑制，而抗氧化剂褪黑素以浓度依赖性方式促进 增殖细胞进入S期，并抑制p38/MAPK信号通路，减轻MSC衰老6。 (三)SIRT家族蛋白 沉默信息调节蛋白(silem infonIlation regIllator pmtein，Sirnlin)是一类进化保守的组蛋白去乙 酰化酶与ADP-核糖基转移酶蛋白酶，参与调控机体炎症反应、能量代谢及衰老等过程。SIRT1在维持 MCS细胞增殖及分化中、调节衰老方面发挥重要作用。选择性敲除Sirt1的骨髓MSCs早期呈现细胞生长 减慢，逐渐进入细胞停滞期，细胞衰老加速，同时S期细胞明显减少，p16和p21表达降低，而敲除脂肪 来源MSC的SIRT1基因可以逆转p16和p21的表达7。高糖可增加脂肪MSCs中miR-486表达并抑制SIRT1表达， 促进细胞衰老8。白藜芦醇能通过剂量依赖方式经sIRTl信号通路调节脐带来源MsCs的自我更新能力及 向神经细胞分化能力，表现为增加MSCs活力及增殖能力，减轻细胞衰老，促进S1RT1表达，抑制p53及 p16表达9。其机制与烟酰胺磷酸核糖转移酶相关，后者为NAD+合成限速酶。通过恢复线粒体NAD+水平 可延缓MsCs复制时产生的衰老，延长MSC寿命10。SIRT家族中除SITR1外，SIRT2、SIRT3及SIRT6同样具 有抗衰老功能。SIRT3过表达可通过激活超氧化物歧化酶(MnSOD)和过氧化氢酶(Catalase CAT)表达， 从而改善氧化应激对MSCs造成的损伤，减少细胞凋亡，而严重氧化应激可导致骨髓MSC的SIRT3表达下 降11。SIRT6通过影响DNA损伤修复过程维持基因组稳定，其功能缺陷将诱发细胞衰老。在骨髓MSC中， 敲除SIRT6基因可使细胞增殖、迁移及抗氧化应激能力受损，细胞加速衰老12。 (四)高糖状态 解螺旋 体内外微环境中葡萄糖浓度显著影响细胞的增殖、分化、衰老及凋亡。高糖环境可增加脂肪MSC中miR- 486表达并抑制SIRT1表达，促进细胞衰老8。SIRT1抑制剂白藜芦醇可保护由高糖环境诱导的MCS衰老13。 高糖诱导的蛋白质O位氮乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)糖基化修饰可抑制细胞增殖，阻滞细胞周期，促进细胞 凋亡及衰老14。 （五）Wnt-catenin信号途径 Wnt-catenin通路是MSCs中ROS生成的主要催化剂。该通路激活后可通过破坏氧化剂与抗氧化剂平衡， 导致MSC衰老；反之，清除ROS可使Wnt-catenjn信号通路诱导MSC衰老作用减弱（详见后面的信号通 路部分的阐述）。 (六)DNA损伤 MSC 的衰老涉及 DNA 损伤反应（DNA damage response，DDR）通路的激活。DDR 导致基因组的高度不稳 定是 MSC 衰老的重要机制之一。当 MSC 发生 DNA 损伤且快速修复机制修复失败时将导致细胞衰老甚至 凋亡。持续的 DNA 损伤可抑制 DNA 合成，改变 MSC 形态特征，促进衰老。通过敲除果蝇某些 DDR 相关 解螺旋陪伴医生科研成长 3 / 5 基因（如 ATM, ATR, Chk1, and Chk2），造成肠道细胞的 DDR 下降，从而诱导肠道细胞死亡并加速器 肠道干细胞的衰老，最终影响成年果蝇的生存期 15。累积性 DNA 损伤可产生内源性干扰素 B，经由相 关信号通路放大 DDR，激活 p53 信号通路，缩短端粒长度，促进 MSC 衰老 16。果蝇肠细胞中异染色质 稳定性发生年龄相关性地丢失，与肠道干细胞衰老的发生密切相关。这与肠细胞中 H3K9me3 和异染色 质蛋白 1（HP1）的功能下降有关，涉及的相关机制包括基因组氧化应激和 AKT/TOR 信号通路 17。解螺 旋 2 2、MSCsMSCs衰老涉及的信号通路衰老涉及的信号通路 1) Wnt/-catenin信号通路 Wnt信号通路在MSC自我更新和分化中发挥重要作用。将脐带血来源MSC置于含有Wnt-3a的条件培养液中 培养，脐带血MSC的衰老明显延缓，当加入Wnt受体抑制剂dickkopf-1或者转染-catenin的siRNA后 MSC则衰老加速18。BET蛋白抑制剂JQ1可通过Wnt信号通路阻滞MSC于G1期，抑制其细胞更新及有丝分裂 的相关基因表达19。成骨化能力减弱也是MSC衰老的特征之一。在衰老小鼠模型及体外细胞培养的衰老 过程中，Bmal1基因呈现高表达，进而通过抑制Wnt/ catenin信号通路降低MSC成骨化能力20。DNA损 伤是引起细胞衰老的重要机制之一，在此过程中，Wnt/ catenin信号通路也发挥了重要作用。过表 达-catenin可上调MSC核内Y-H2AX，进而招募DNA损伤修复相关蛋白和信号分子，如BRCA1，聚集与 DNA双链断裂部位发挥损伤后修复作用，降低胞内DNA的损伤积累，阻止其细胞衰老的进程21。 2) MAPK/ERK信号通路 解螺旋 ERK 是 MSCs 有丝分裂强有力的刺激源，ERKl/2 可抑制细胞凋亡，加快细胞周期进展，抑制 ERK 可以阻 止 MSC 自然分化。MAPK/ERK 通路也可调控下游靶基因 p16、p53 等与细胞衰老密切相关的基因，比如 该通路激活后可增强 p16 表达，加快 MSC 衰老进程 22。某些蛋白质或细胞因子也经由 MAPK/ERK 信号通 路影响 MSC 衰老。衰老 MSC 高表达小窝蛋白 1(caveolin-1，Cav-1) ，经抑制 ERKl2 磷酸化从而阻 止其发挥促进 MSC 增殖分化的作用 23。果蝇肠细胞中的磷脂酰乙醇胺结合蛋白 1（PEBP1）对维持肠道 干细胞（ISC）活性具有重要作用，其表达岁年龄和受氧化应激的增加而下调，进而促进 ISC 衰老 24。 该过程涉及肠细胞中 ERK 信号通路的过度激活，通过采用 ERK 信号通路抑制剂可以回复 PEBP1 缺失所 致的 ISC 衰老表型。成纤维细胞生长因子（FGFR1/2）经由 ERK 通路抑制小梁型人骨髓基质细胞 （hBMSCs）向成骨细胞分化，可能参与调控了与衰老相关的异常脂肪生成和骨质疏松等退行性疾病的 发病 25。GLP-1 通过 ERK 信号通路促进脂肪干细胞向成骨细胞分化，抑制其脂肪细胞分化26。硝酸异 山梨酯经由 ERK 信号通路对抗高糖诱导的 MSC 衰老 27。 3) P13K/AKT信号通路 解螺旋陪伴医生科研成长 4 / 5 P13K/Akt通路参与细胞的代谢、生存、凋亡等生物学功能，与阿尔茨海默氏症、系统性红斑狼疮（SLE） 等疾病的发病相关。SLE患者的体内微环境含有较高水平Leptin和NAP-2，可诱导MSC衰老。在加入 P13K/AKT抑制剂LY294002后，Leptin和NAP-2的作用明显减弱28。成纤维细胞生长因子（FGF）可通过 P13K/AKT信号通路降低MDM2表达，后者作为p53关键负调控因子，通过对周期蛋白Cyclin G表达的调控 抑制细胞衰老29。白藜芦醇通过P13K/AKT上调PIM-1增强，增加细胞中端粒的长度进而抑制MSC衰老13。 4) ROS相关信号通路 解螺旋 MSC衰老与ROS水平密切相关。在体外培养过程中，MSC内ROS水平随传代代数而升高，高浓度ROS通过促 进有缺陷的新生血管生成加快MSC衰老30。番茄红素加入衰老MSC的培养液中后可通过P13K/AKT信号通 路明显降低ROS水平，延缓MSC衰老31。单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)是MSCs体外培养时细胞衰老相关分 泌表型的重要成分。MCP-1作用于趋化因子受体2，激活ROS-p38-MAPK-p53/p21信号通路，阻止RB蛋白 磷酸化和降解，促进MSC衰老31。H2O2导致细胞内ROS积累，磷酸化激活ATM，促进受损DNA附近组蛋白磷 酸化，引发细胞衰老。 5) 其他信号通路 TGF-B信号通路可调控细胞的SA-gal或转录因子Nanog的表达量而影响MSC的衰老进程。衰老心肌的 MSC内TGF-发生明显改变32。Notch信号通路通过与SOX9增强结合，阻止Col 2A1激活，从而抑制TGF- 诱导的MSC软骨化过程33。 参考文献参考文献 1. Benameur L, Charif N, Li Y, Stoltz JF, de Isla N. Toward an understanding of mechanism of aging-induced oxidative stress in human mesenchymal stem cells. Bio-medical materials and engineering 2015; 25(1 Suppl): 41-6. 2. Alder JK, Barkauskas CE, Limjunyawong N, et al. Telomere dysfunction causes alveolar stem cell failure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2015; 112(16): 5099-104. 3. He L, Zheng Y, Wan Y, Song J. A shorter telomere is the key factor in preventing cultured human mesenchymal stem cells from senescence escape. Histochemistry and cell biology 2014; 142(3): 257-67. 4. Diao D, Wang H, Li T. Telomeric epigenetic response mediated by Gadd45a regulates stem cell aging and lifespan. 2018; 19(10). 5. Borodkina A, Shatrova A, Abushik P, Nikolsky N, Burova E. Interaction between ROS dependent DNA damage, mitochondria and p38 MAPK underlies senescence of human adult stem cells. Aging 2014; 6(6): 481-95. 6. Zhou L, Chen X, Liu T, et al. Melatonin reverses H2 O2 -induced premature senescence in mesenchymal stem cells via the SIRT1-dependent pathway. Journal of pineal research 2015; 59(2): 190-205. 7. Simic P, Zainabadi K, Bell E, et al. SIRT1 regulates differentiation of mesenchymal stem cells by deacetylating beta-catenin. EMBO molecular medicine 2013; 5(3): 430-40. 8. Kim YJ, Hwang SH, Lee SY, et al. miR-486-5p induces replicative senescence of human adipose tissue- derived mesenchymal stem cells and its expression is controlled by high glucose. Stem cells and development 2012; 21(10): 1749-60. 9. Wang X, Ma S, Meng N, et al. Resveratrol Exerts Dosage-Dependent Effects on the Self-Renewal and Neural Differentiation of hUC-MSCs. Molecules and cells 2016; 39(5): 418-25. 10. Lawson J, Dickman C, MacLellan S, et al. Selective secretion of microRNAs from lung cancer cells via extracellular vesicles promotes CAMK1D-mediated tube formation in endothelial cells. Oncotarget 2017; 8(48): 83913-24. 解螺旋陪伴医生科研成长 5 / 5 11. Wang XQ, Shao Y, Ma CY, et al. Decreased SIRT3 in aged human mesenchymal stromal/stem cells increases cellular susceptibility to oxidative stress. Journal of cellular and molecular medicine 2014; 18(11): 2298- 310. 解螺旋 12. Lee N, Kim DK, Kim ES, et al. Comparative interactomes of SIRT6 and SIRT7: Implication of functional links to aging. Proteomics 2014; 14(13-14): 1610-22. 13. Lei LT, Chen JB, Zhao YL, Yang SP, He L. Resveratrol attenuates senescence of adipose-derived mesenchymal stem cells and restores their paracrine effects on promoting insulin secretion of INS-1 cells through Pim-1. European review for medical and pharmacological sciences 2016; 20(6): 1203-13. 14. Maury JJ, Chan KK, Zheng L, Bardor M, Choo AB. Excess of O-linked N-acetylglucosamine modifies human pluripotent stem cell differentiation. Stem cell research 2013; 11(2): 926-37. 15. Park JS, Jeon HJ, Pyo JH, Kim YS, Yoo MA. Deficiency in DNA damage response of enterocytes accelerates intestinal stem cell aging in Drosophila. Aging 2018; 10(3): 322-38. 16. Yu Q, Katlinskaya YV, Carbone CJ, et al. DNA-damage-induced type I interferon promotes senescence and inhibits stem cell function. Cell reports 2015; 11(5): 785-97. 17. Jeon HJ, Kim YS, Kim JG, et al. Effect of heterochromatin stability on intestinal stem cell aging in Drosophila. Mechanisms of ageing and development 2018; 173: 50-60. 18. Jeoung JY, Nam HY, Kwak J, et al. A decline in Wnt3a signaling is necessary for mesenchymal stem cells to proceed to replicative senescence. Stem cells and development 2015; 24(8): 973-82. 19. Alghamdi S, Khan I, Beeravolu N, et al. BET protein inhibitor JQ1 inhibits growth and modulates WNT signaling in mesenchymal stem cells. Stem cell research 7: 22. 20. He Y, Chen Y, Zhao Q, Tan Z. Roles of brain and muscle ARNT-like 1 and Wnt antagonist Dkk1 during osteogenesis of bone marrow stromal cells. Cell proliferation 2013; 46(6): 644-53. 21. Goldberg M, Stucki M, Falck J, et al. MDC1 is required for the intra-S-phase DNA damage checkpoint. Nature 2003; 421(6926): 952-6. 22. Kolosa K, Motaln H, Herold-Mende C, Korsic M, Lah TT. Paracrine effects of mesenchymal stem cells induce senescence and differentiation of glioblastoma stem-like cells. Cell transplantation 2015; 24(4): 631-44. 23. Park JS, Kim HY, Kim HW, et al. Increased caveolin-1, a cause for the declined adipogenic potential of senescent human mesenchymal stem cells. Mechanisms of ageing and development 2005; 126(5): 551-9. 24. Pyo JH, Jeon HJ, Park JS, Lee JS, Chung HY, Yoo MA. Drosophila PEBP1 inhibits intestinal stem cell aging via suppression of ERK pathway. Oncotarget 2018; 9(26): 17980-93. 25. Simann M, Le Blanc S, Schneider V, et al. Canonical FGFs Prevent Osteogenic Lineage Commitment and Differentiation of Human Bone Marrow Stromal Cells Via ERK1/2 Signaling. Journal of cellular biochemistry 2017; 118(2): 263-75. 26. Lee HM, Joo BS, Lee CH, Kim HY, Ock JH, Lee YS. Effect of Glucagon-like Peptide-1 on the Differentiation of Adipose-derived Stem Cells into Osteoblasts and Adipocytes. Journal of menopausal medicine 2015; 21(2): 93-103. 27. Xu J, Huang Z, Lin L, et al. miRNA-130b is required for the ERK/FOXM1 pathway activation-mediated protective effects of isosorbide dinitrate against mesenchymal stem cell senescence induced by high glucose. International journal of molecular medicine 2015; 35(1): 59-71. 28.