2012年青基精胺通过诱导自噬减轻心肌无复流机理的研究

申请代码 受理部门 收件日期 受理编号 检查保护 国家自然科学基金国家自然科学基金 申申 请请 书书 ( 2 0 1( 2 0 1 1 1 版版 ) ) 资助类别： 亚类说明： 附注说明： 项目名称： 申 请 人： 电话： 依托单位： 通讯地址： 邮政编码： 单位电话： 电子邮箱： 申报日期： 2011年2月10日 国家自然科学基金委员会 您现在不能检查保护文档或打印文档，请根据以下三个步骤操作：您现在不能检查保护文档或打印文档，请根据以下三个步骤操作： 1)如果您是如果您是 Word2000,word XP, word 2003 或以上版本用户， 请把或以上版本用户， 请把 Word 宏的安全性设为宏的安全性设为:“中中“ 方法方法: Word 菜单菜单-工具工具-宏宏-安全性安全性-安全级安全级,设置为设置为“中中“ (如果您是如果您是 Word97 用户，继续执行以下步骤用户，继续执行以下步骤) (如果您是如果您是 Office2007 用户，点击用户，点击 word 左上角左上角“安全安全警告警告“处处“选项选项“ 中的中的“启用此内容启用此内容“) 2)关闭本文档，重新打开本文档关闭本文档，重新打开本文档 3)点击点击“启用宏启用宏“按钮，即可开始填写本文档或打印了按钮，即可开始填写本文档或打印了 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 2 页 版本 1.000.000 基本信息基本信息 申申 请请 人人 信信 息息 姓名 韩丽萍 性别 女 出生 年月 1978 年 2 月 民 族 汉族 学位 博士 职称 副教授 每年工作时间（月） 4 电话电子邮箱 hanlp78 传真 国别或地区 中国 个 人 通 讯 地 址 浙江省温州市茶山高教园区 工作单位 温州医学院 /基础医学院 主 要 研 究 领 域 心血管生理 依 托 单 位 信 息 依 托 单 位 信 息 名称 温州医学院 联系人 徐和靖 电子邮箱 xhj 电话网站地址 合 作 研 究 单 位 信 息 合 作 研 究 单 位 信 息 单 位 名 称 在此录入修改 在此录入修改 项项 目目 基基 本本 信信 息息 项目名称 精胺通过诱导自噬减轻心肌无复流机理的研究 资助类别 青年科学基金项目 亚 类 说 明 附注说明 申请代码 H0206:冠状动脉性心脏病 基地类别 研究期限 2012 年 1 月 2014 年 12 月 研究属性 应用基础研究 摘摘 要要 ( (限限 400400 字字) )：经皮冠脉介入等方法治疗急性心肌梗死后，常出现无复流现象，使患者的预后 很差，其机制尚未阐明。我们的前期研究发现心肌缺血/再灌注后内源性精胺浓度降低，而 补充低浓度外源性精胺可减轻心肌缺血/再灌注损伤并缩小无复流区面积，但其机制尚不明 确。根据文献报道，外源性精胺可诱导培养的酵母细胞和多种哺乳动物细胞发生自噬，而自 噬具有心肌保护功能。因此，我们推测精胺可能是通过诱导自噬而发挥其心肌保护和减少无 复流面积的作用。为了证实这一假说，我们将在整体和细胞两个水平复制急性心肌缺血/再 灌注模型，采用分子生物学、电镜、高效液相色谱等技术，观察应用低浓度外源性精胺对大 鼠急性心肌梗死/再灌注自噬体的形成，自噬标志蛋白的表达以及无复流的影响；并观察应 用精胺对原代培养缺氧/复氧微血管内皮细胞形态、自噬过程的影响及其机制。本课题将从 新的视角阐明精胺保护心肌，减少无复流面积的机制，为防治无复流提供新靶点。 关关 键键 词词(用分号分开，最多 5 个) 无复流；精胺；自噬；心肌梗死 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 3 页 版本 1.000.000 项目组主要项目组主要参与者参与者（注: 项目组主要参与者不包括项目申请人） 编号 姓 名 出生年月 性别 职 称 学 位 单位名称 电话 电子邮箱 项目分工 每年工 作时间 （月） 1 孔晓霞 1978-10-29 女 讲师 博士 温州医学院 0577866897 69 kong_xx 分子生物 3 2 袁琳波 1979-4-8 女 讲师 硕士 温州医学院 0577866897 69 ylb 细胞培养 4 3 陈兆琴 1983-1-11 女 助理实验 师 硕士 温州医学院 0577866897 69 czq 生化指标检 测 4 4 申屠杨萍 1981-2-23 女 硕士生 学士 温州医学院 0577866897 69 styp 动物模型 9 5 王桂琴 1984-1-16 女 硕士生 学士 温州医学院 0577866897 69 need1688 标本采集 9 6 在此录入修改 7 在此录入修改 8 在此录入修改 9 在此录入修改 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 6 1 2 1 2 说明: 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请人负责填报（含申请人） ，总人数由各分项自动加和产生。 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 4 页 版本 1.000.000 经费申请表经费申请表 （金额单位：万元） 科目 申请经费 备注（计算依据与说明） 一一. .研究经费研究经费 24.5000 1.科研业务费 7.5000 （1）测试/计算/分析费 3.0000 大型设备（如多项色谱分析仪）使用费，序列测定 费等 （2）能源/动力费 1.0000 水电费 （3）会议费/差旅费 1.0000 国内相关会议 23 人次 （4）出版物/文献/信息传播费 2.0000 论文版面费、文献检索费、复印费等 （5）其他 0.5000 不可预见费 2.实验材料费 17.0000 （1）原材料/试剂/药品购置费 15.0000 精胺等试剂、抗体、试剂盒以及各种耗材等 （2）其他 2.0000 实验动物的购买和养殖 3.仪器设备费 0.0000 （1）购置 （2）试制 4.实验室改装费 5.协作费 二二. .国际合作与交流费国际合作与交流费 0.0000 1.项目组成员出国合作交流 0.0000 2.境外专家来华合作交流 0.0000 三三. .劳务劳务费费 1.1000 研究生劳务费 四四. .管理费管理费 1.4000 项目依托单位管理费 合合 计计 27.0000 与本项目相关的 其他经费来源 国家其他计划资助经费 其他经费资助（含部门匹配） 其他经费来源合计其他经费来源合计 0.0000 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 5 页 申请者在撰写报告正文时，请遵照以下要求： 1、 请先选定“项目基本信息“中的“资助类别“，再填写报告正文； 2、 在撰写过程中，不得删除系统已生成的撰写提纲（如误删可点击“查 看报告正文撰写提纲”按钮，通过“复制/粘贴“恢复） ； 3、 请将每部分内容填写在提纲下留出的空白区域处； 4、 本要求将作为申请书正文撰写是否规范的评判依据，请遵照要求填写。 查看报告正文撰写提纲 报告正文报告正文 青年科学基金项目申请书撰写提纲青年科学基金项目申请书撰写提纲 （一）立项依据与研究内容（一）立项依据与研究内容（4000-8000 字） ： 1.1. 项目的立项依据项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需 结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发 展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考 文献目录） 急性心肌梗死（AMI）发病凶险，病死率高，实施冠脉再通治疗，是最重要的治疗 措施。近年来，随着溶栓疗法、冠脉搭桥术、特别是急诊经皮冠脉介入（PCI）等方法 的建立，使缺血心肌更快地重新获得血液供应，明显提高了临床疗效。而AMI急性期存 活率的提高直接与梗死相关动脉的再通速度、 开放程度及风险区心肌和微循环血流恢复 质量有关。然而，AMI 经PCI 成功再通后常产生慢血流(slow-flow phenomenon)或无复流 现象(no-reflow phenomenon)，即没有心外膜血管机械性闭塞的证据，但是在靶血管范围 心肌灌注不足。 无复流现象的定义为心外膜血流恢复正常而末梢组织灌注水平很差或没 有。 无复流与左心室射血分数的下降、 左室重塑及不良的临床结局有关， 既是心肌损伤、 梗死延展的标志，也是心室重构、心功能障碍的预测指标。无复流的存在是死亡率增加 的独立预测因子，这使得这样的患者成为再灌注中的高危人群。 心肌梗死经溶栓或PCI治疗后，大于30 %的患者可发生无复流现象。与心肌充分复 流的患者相比，无复流患者在心肌梗死后更多发生充血性心力衰竭，恶性心律失常和心 性猝死，在梗死恢复期更多表现为进行性左室扩大。无复流导致再灌注效果严重下降， 患者预后很差，成为心肌梗死等缺血性疾病防治技术发展的瓶颈。因此，因此，逐步更新和完逐步更新和完 善冠脉无复流现象的治疗策略，寻善冠脉无复流现象的治疗策略，寻找可以有效解决无复流现象的方法找可以有效解决无复流现象的方法是是提高临床提高临床AMI 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 6 页 治疗效果的关键，并治疗效果的关键，并将对将对PCI技术的广泛开展及减轻病人经济负担有重要作用。技术的广泛开展及减轻病人经济负担有重要作用。 无复流现象的机制目前尚不完全清楚，但已初步证实微循环障碍起着关键作用。导 致无复流的微血管功能障碍的发病机制比较复杂，主要包括以下几点：1）粥样斑块和 血栓导致的远端栓塞；2）缺血引起的损伤；3）再灌注引起的损伤；4）微血管痉挛， ， 血小板及粒细胞引起的微血管的填塞，内皮肿胀，压迫微血管系统的组织水肿， 氧化应 激以及炎症都可能起了一定的作用。 我们在近几年的研究中发现，大鼠心肌缺血/再灌注损伤会引起内源性多胺代谢紊 乱，精胺及总多胺池呈再灌注时间依赖性下降，多胺代谢关键酶鸟氨酸在鸟氨酸脱羧酶 （ODC）和精脒/精胺乙酰转移酶（SSAT）亦随再灌注时间延长而改变；进一步研究发 现，低浓度外源性精胺、精脒可减轻培养心肌细胞缺血/再灌注诱导的细胞凋亡，且于再 灌注前15min静注低浓度精胺不仅能显著减轻心肌损伤，还可明显降低大鼠缺血明显降低大鼠缺血30min， 再灌注再灌注1h时无复流不着色区占全心总重量的比值。时无复流不着色区占全心总重量的比值。 部分研究结果已发表在在国内外重要 期刊上。 精胺(spermine)属多胺的一种，是多价正电荷、非蛋白质含氮小分子化合物，广泛 存在于哺乳类动物组织细胞。精胺具有多种生理功能，不仅对细胞的生长、分化、增殖 至关重要，且与细胞的凋亡和死亡也有密切的关系，在许多病理过程中也发挥作用，已 成为国际研究热点。 文献报道，精胺不仅可抑制由烷化剂、单线态氧和辐射所引起的DNA损伤和脂质过 氧化，并且在决定细胞周期性增生和凋亡上起关键作用。更重要的是应用外源性精胺可外源性精胺可 诱导培养的酵母细胞和多种哺乳动物细胞发生自噬诱导培养的酵母细胞和多种哺乳动物细胞发生自噬，延长细胞寿命。因此，我们推测精 胺可通过在缺血/再灌注中诱导自噬而发挥心肌保护作用，进而防止或减轻无复流现象。 自噬（autophagy）是由 Ashford 和 Porter 在 1962 年发现细胞内有“自己吃自己（self eating）”的现象后提出的，是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分 胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体（autophagosome） ，并与溶酶 体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细 胞器的更新。自噬是营养缺乏时细胞的适应性反应，缺血自噬是营养缺乏时细胞的适应性反应，缺血/再灌注等各种因素刺激下，再灌注等各种因素刺激下， 细胞启动自噬机制来清除受损线粒体，避免凋亡因子细胞启动自噬机制来清除受损线粒体，避免凋亡因子释放进入胞质，同时提高细胞对低释放进入胞质，同时提高细胞对低 氧的耐受力，对细胞起到一定保护作用。氧的耐受力，对细胞起到一定保护作用。 近年来，Huang C等发现缺血预适应可诱导自噬发生，并且自噬是预适应发挥心肌 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 7 页 保护功能所必需的，同时他们还证实3种心肌保护试剂，即UTP、氯甲苯噻嗪和雷诺嗪 雷诺嗪，都可以诱导自噬发生，如果自噬过程被抑制了，则这3种试剂的保护作用也就 没有了。 缺血/再灌注过程中自噬的心肌保护机制可能是：1）心肌缺血诱导自噬能够维持细 胞内ATP水平，促进细胞生存 。损伤线粒体能够产生过量的ROS、细胞色素C等促凋亡 信号，而自噬是细胞内清除损伤细胞器的唯一的生理过程；2）自噬可以在蛋白聚合物 清除水平上对细胞产生保护作用， I/R损伤能抑制泛素蛋白酶系统的作用， 引起泛素化蛋 白积聚，这种大的蛋白复合物主要通过自噬降解。 缺血/再灌注过程中自噬现象的发现为缺血性心脏病提供了一个新的治疗靶点，但 是调节心脏疾病中自噬活动的治疗方法还非常有限。 主要可能是自噬在缺血/再灌注过程 中是一把“双刃剑” ，轻度的自噬可以保护心肌，有利于细胞存活，但重度的自噬又会 通过增加细胞凋亡及坏死而使损伤加重。 而我们的研究发现，精胺也是一把“双刃剑” ，低浓度外源性精胺可减轻心肌缺血/ 再灌注损伤，高浓度则反而使损伤加重，因此我们提出低因此我们提出低浓度精胺可通过在缺血浓度精胺可通过在缺血/再灌再灌 注中诱导轻度自噬而发挥心肌保护作用，进而注中诱导轻度自噬而发挥心肌保护作用，进而防止防止或减轻或减轻无复流无复流现象现象。 本课题拟分别观察应用低浓度精胺以及高浓度精胺对大鼠在体急性心肌梗死/再灌 注后无复流的影响及自噬程度，以探讨精胺与自噬间的关系，以及自噬对无复流现象的 影响；并观察应用精胺对原代培养缺氧/复氧微血管内皮细胞形态、自噬过程等影响，在 器官、细胞等水平证实我们的假设，进而提出改善无复流现象的更有效的新方式，为拓 展防治无复流现象提供了新的思路奠定基础， 其成果必将具有一定的理论意义和应用价 值。 参考文献参考文献 1. Niccoli G, Spaziani C. Serotonin: another player in the complex pathogenesis of no-reflow phenomenon. Anadolu Kardiyol Derg. 2010;10(3):260-262. 2. Rezkalla SH, Kloner RA. Coronary no-reflow phenomenon: from the experimental laboratory to the cardiac catheterization laboratory. Catheter Cardiovasc Interv. 2008; 72 (7): 950-957. 3. Mah a P, Garcia B, Dom nguez-Oronoz R. No-reflow phenomenon in cardiac MRI: diagnosis and clinical implications. AJR Am J Roentgenol. 2008; 191(1):73-79. 4. Reffelmann T, Kloner RA.The no-reflow phenomenon: A basic mechanism of myocardial ischemia and reperfusion. Basic Res Cardiol. 2006; 101(5):359-372. 5. Galiuto L, Crea F. No-Reflow: A Heterogeneous Clinical Phenomenon with Multiple Therapeutic Strategies. Curr Pharm Des. 2006; 12(29):3807-3815. 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 8 页 6. Porto I, AsharV, Mitchell AR. Pharmacological management of no reflow during percutaneous coronary intervention . Curr Vasc Pharmacol. 2006; 4 (2): 95-100. 7. Huang C, Yitzhaki S, Perry CN, Liu W, Giricz Z, Mentzer RM Jr, Gottlieb RA. Autophagy induced by ischemic preconditioning is essential for cardioprotection. J Cardiovasc Transl Res. 2010;3(4):365-373. 8. Sadoshima J. The role of autophagy during ischemia/reperfusion. Autophagy. 2008;4(4):402-403 9. Madeo F, Eisenberg T, B ttner S, Ruckenstuhl C, Kroemer G Spermidine: a novel autophagy inducer and longevity elixir. Autophagy. 2010; 6(1):160-162. 10. Sciarretta S, Hariharan N, Monden Y, Zablocki D, Sadoshima J. Is Autophagy in Response to Ischemia and Reperfusion Protective or Detrimental for the Heart? Pediatr Cardiol. 2010 Dec 19. Epub ahead of print 11.李桂兰, 杨洪双, 郭 彦.自噬在缺血性心脏病发病机制中的作用. 基础医学与临床. 2010; 30(5): 554-556. 12. Gillespie MN, Olson JW. Polyamine regulatory pathways as pharmacologic targets in pulmonary arterial hypertension. Adv Exp Med Biol. 2010;661:375-389. 13.韩丽萍韩丽萍，徐长庆徐长庆，姜春明姜春明，李鸿珠李鸿珠，孙轶华孙轶华. 精胺减轻大鼠在体心肌缺血精胺减轻大鼠在体心肌缺血-再灌注损伤的作用及机再灌注损伤的作用及机 制制. 中国病理生理杂志中国病理生理杂志 2007；23（5） ：） ：839-843. 14.Liping Han, Changqing Xu, Hongzhu Li, Chunming Jiang , Yajun Zhao. Polyamine metabolism in rat myocardial ischemia-reperfusion injury. Int. J Cardiology .2009; 132(1): 142-144. 2.2. 项目的研究内容、研究目标项目的研究内容、研究目标, ,以及拟解决的关键科学问题。以及拟解决的关键科学问题。 （此部分 为重点阐述内容） （1）研究内容：）研究内容： 1） 结扎大鼠冠状动脉左室前降支1.5h后剪开结扎线， 再灌注3h复制单纯心肌梗死再 灌注损伤模型。全程通过Powerlab 多导生理记录仪监测心电图、左室内压最大化 速率等心功能指标，采用试剂盒分别检测心肌组织各个时期AMPK的浓度和细胞 损伤生化标志物（如血浆肌球蛋白、肌酸激酶同工酶（CK-MB） 、心肌肌钙蛋白 T/I（cTnT/I）等） ，电镜观察心肌微血管形态学改变，同时检测血液动力学和冠 状动脉血流量，以观察心肌损伤程度；染色法测定缺血区面积、梗塞心肌面积以 观察无复流现象； （已基本完成）（已基本完成） 2）高效液相色谱分析内源性精胺浓度变化，蛋白印记、免疫组化等方法测定自噬标 记物Beclin 1、蛋白p62等的表达，电镜观察各期自噬泡的形成以探讨精胺与自噬 的关系。 3）再灌注前分别给予低浓度、高浓度精胺以及自噬的特异性阻断剂Tat-ATG5K130R， 后再检测上述指标，从而观察外源性精胺对心肌梗死再灌注后无复流的影响及其 自噬介导机制。 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 9 页 4）蛋白印记等方法测定组织样本中组蛋白乙酰基转移酶（histone acetylase，HAT） 和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）的表达，以探讨精胺诱导自 噬的机制。 5）培养心肌微血管内皮细胞，培养好的细胞用N2饱和的低糖无血清DMEM培养基， 于37 ，5 % CO2加95 % N2孵箱中培养4小时，再将细胞置于氧饱和的含10胎 牛血清的高糖 DMEM培养基常规培养8小时以模拟急性缺血再灌注模型，观察精 胺干预对内皮细胞的形态、增值以及自噬等情况的影响，从而在细胞水平揭示精 胺对心肌梗死再灌注后无复流的作用机制。 （2）研究目标：）研究目标： 1）揭示内源性精胺与自噬以及再灌注损伤和无复流现象间的关系； 2）探讨精胺减少无复流面积的机制，证实其自噬介导假说； （3）拟解决的关键）拟解决的关键科学科学问题：问题： 文献报道自噬对缺血/再灌注表现出双向作用，轻度自噬可适应性保护细胞，但自噬 程度过高则会引起细胞凋亡、坏死，所以控制自噬程度是决定精胺是否发挥保护作用而 减轻无复流现象的关键。而我们过去的研究也发现只有低浓度外源性精胺能保护缺血/ 再灌注心肌，减轻无复流现象，高浓度精胺则相反。所以本课题要解决的一个关键问题 就是要确定精胺浓度与自噬程度之间存在正性关系。 3.3. 拟采取的研究方案及可行性分析。拟采取的研究方案及可行性分析。 （包括有关方法、技术路线、实验 手段、关键技术等说明） （1）拟采取的研究方案）拟采取的研究方案： 1）整体水平）整体水平： 在体模型制备：Wistar大鼠，体重200-250g，雌雄不拘，清洁级，本单位动物中 心提供。 每组n=713 （视具体情况而定） 。 2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉 （2mg/kg） ， 同时腹腔注射肝素（1000IU/kg） ，气管插管，正压人工呼吸。开胸暴露心脏，剪 开心包，于冠状动脉左室前降支离左心耳下缘约0.15cm处绕左室支穿线结扎，缺 血30min后剪开结扎线，再灌注2h、6h、12h和24h，造成心肌缺血-再灌注损伤。 术中连续监视ECG导联的变化，以S-T段明显抬高为结扎成功（心肌缺血）的 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 10 页 指标，剪开结扎线后S-T 段下降1/ 2 以上表明复灌成功。 【参见：【参见：韩丽萍，徐长庆，姜春明，李鸿珠，孙轶华韩丽萍，徐长庆，姜春明，李鸿珠，孙轶华. 精胺减轻大鼠在体心肌缺血精胺减轻大鼠在体心肌缺血-再灌注损伤的作用及机制再灌注损伤的作用及机制.中中 国病理生理杂志国病理生理杂志2007；23（5） ：） ：839-843. 】 无复流面积测定：恢复灌注后经导管注入左心室6% thioflavin S溶液（1mg/kg） 。 thioflavin S 可发出荧光，用以标记再灌注心肌。再次结扎原冠脉，并经导管注入 左心室Monastral蓝溶液（1mg/kg） 。迅速取出心脏，分离左心室，快速深低温冷 冻。取出冷冻心脏，沿房室沟平行切为8-10层。未被蓝色染色的心脏为结扎冠脉 供血范围的心肌；在紫外灯下无荧光的心肌为无复流心肌，后者与前者的比例为 无复流所占的比例。将各层心肌行triphenyleterazolium chloride（TTC）染色，TTC 阳性心肌为非梗死心肌，阴性为梗死心肌。将以上各层数据通过计算机模型计算 无复流心肌、梗死心肌所占的比例。 自噬体及微血管病理检测：取心脏左室，以2. 5%的戊二醛及1%锇酸双重固定， 乙醇、丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，切片，厚度为50nm，醋酸双氧铀和枸橼酸 铅双重染色后，透射电镜观察，拍照，记录。计算电镜照片各个细胞中自噬泡占 胞质总面积的比例；光镜、电子显微镜分别观察各区微血管内皮细胞和平滑肌细 胞形态学改变，monodansyl-cadaverine（MDC）荧光染色标记法检测自噬情况。 【参见：【参见：Zhang H, Kong X, Kang J, Su J,Li Y,Zhong J, Sun L. Oxidative stress induces parallel autophagy and mitochondria dysfunction in human glioma U251 cellsJ. Toxicological Sciences, 2009, 110(2), 376-388 】 . 高效液相谱仪（HPLC）检测心肌组织中精胺含量：试验结束后，迅速取左心室 约150mg， 加入0.3mmol/L冷的高氯酸在冰水浴中制成匀浆， 3500r/min离心10min， 去除蛋白，上清贮存在-20oC直至分析使用。取处理好的样品400l，加入内标（1， 6-己二胺）10nmol混匀，加入2mmol/L NaOH 2ml，苯甲酰氯10l，漩涡振荡5min， 40oC水浴30min后，加氯仿2ml，漩涡振荡2min，2000r/min离心10min，取1.5ml 氯仿层，加入2ml流动相，漩涡振荡2min，2000r/min离心10min，吸取氯仿层，通 风橱中加热挥干，残余物溶于300l甲醇中，取10l上高效液相色谱柱分析。 固定 相为Hypersil ODS C18柱(250mm 4.6mm，5m)，流动相为甲醇与水（V：V为65： 35） ，柱温35oC，流速为0.4ml/min，紫外检测波长为229nm，AUFS为0.04。标准 品浓度为1-20nmol/ml时，将标准品溶液进行苯甲酰化，以标准品峰面积与内标峰 面积的比为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，浓度与峰面积比呈线性关系，建立 直线回归方程。 将含有10nmol/ml精胺的标准品溶液中加入心肌组织匀浆上清， 经苯甲酰化反应后，按下式计算回收率。将同一多胺标准品，经苯甲酰化反应后， 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 11 页 在当日内进样完成，共进行6次分析，计算日内变异系数；同样，将同一多胺标 准品，经苯甲酰化反应后，在连续6天内进样完成，计算日间变异系数。 【参见【参见: 赵雅君赵雅君，徐长庆徐长庆， 李全风李全风，马丽英马丽英. 应用反向应用反向高效液相色谱分析离体心脏灌流大鼠心肌组织中的多胺高效液相色谱分析离体心脏灌流大鼠心肌组织中的多胺. 中国病中国病 理生理杂志理生理杂志. 2005; 21(2): 412-413. 】 将组织样本和血清样本按 SOD 试剂盒、NO试剂盒、MDA 试剂盒和 LDH试剂 盒、AMPK 试剂盒操作，分别测定血清中相应酶的活性或含量。 取各组心肌组织，在液氮内研磨，加入冰预冷的蛋白裂解液（lmmol/L PMSF， pH7.4)，摇匀，冰浴作用 30min；4，12000r/min，离心 30min，取上清液，用 考马斯亮蓝法染色， 测定蛋白含量； 取上清加入上样缓冲液 （体积比 4： 1） ， 100 沸水中煮 5min， -20备用。 蛋白印记、 免疫组化等方法检测蛋白 p62以及 Beclin 1 的表达。 技术路线技术路线： 2）细胞水平细胞水平： 原代培养的心肌细胞的准备：将出生1-3天的Wistar乳鼠浸泡70%的酒精中消毒， 开胸后取心室肌，用Hanks液清洗2次，剪碎，放入10ml离心管中；离心管中加入 5倍体积的0.25%胰酶， 37消化10分钟后， 加等体积的DMEM全培养液终止消化， 自然沉淀；取出沉淀物，放入另一盛有胰酶的离心管中，重复上述消化过程4次， 每次3720分钟；收集除第一次以外的上清液，1500r/min离心15分钟，弃上清， 用含10胎牛血清的高糖 DMEM培养液充分而轻柔地吹打成单细胞悬液， 经 200 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 12 页 目筛网过滤去除未消化组织块。然后按差速贴壁分离法 37、5%CO2 孵育 1-1.5 小时，纯化心肌细胞。细胞计数，相同密度接种于培养瓶中，37，5%CO2条件 下培养。于培养后12 h即可见部分细胞收缩，36h 后换液,此时心肌细胞约90 %以 上都在收缩，速率达96/ min-120/ min。以后每3天换1次液，取第4天的细胞进行 实验研究。 建立细胞模拟细胞缺血-再灌注模型：首先将高纯度氮气(N2)通入低糖DMEM饱 和30min，以驱除氧气。取生长4天的单层心肌细胞，用此N2饱和的低糖无血清 DMEM培养基，于37 ，5 % CO2加95 % N2孵箱中培养4小时以模拟缺血环境。 再将细胞置于氧饱和的含10胎牛血清的高糖 DMEM培养基常规培养8小时以 模拟再灌注环境。精胺干预组及自噬阻断组在再灌注时添加低浓度外源性精胺和 Tat-ATG5K130R。 电子显微镜观察各组内皮细胞形态学改变； 取各时间段细胞标本， 利用上述方法检测各项指标情况。 【参见：【参见：Liping Han, Changqing Xu, Chunming Jiang, Hongzhu Li, Weihua Zhang, Yajun Zhao, Li Zhang, Yanqiao Zhang, Weiming Zhao, Baofeng Yang. Effects of polyamines on apoptosis induced by simulated ischemia/reperfusion injury in cultured neonatal rat cardiomyocytes. Cell Biology International 2007; 31(11): 1345-1352.】 技术路线：技术路线： （2）可行性分析）可行性分析 本课题技术上的主要难点有以下两个方面： 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 13 页 1）精胺浓度的测定： 精胺是细胞固有的代谢产物，故当观察外源性精胺对细胞作用时应考虑到心肌梗 死再灌注本身对内源性精胺代谢的影响，以及外源性精胺是否能进入细胞而发挥 作用。因此，应既检测细胞外液中精胺浓度，也应检测细胞内精胺浓度。另外正 常大鼠细胞内精胺浓度很低，测量时必须要加大样本量才能得出准确数据。 2）细胞培养模拟急性缺血-再灌注模型制备： 细胞培养状态下不可能完全复制出标准的急性缺血-再灌注模型，但缺血-再灌注 主要是缺氧-复氧为主，故细胞培养时可以模拟该病理过程。本人过去从事的试 验研究已经建立了稳定的细胞培养模拟缺血/再灌注模型。 4.4. 本项目的特色与创新之处。本项目的特色与创新之处。 虽然目前临床上已有一些药物用来应对无复流现象， 但还没那种药物有确切的治疗 效果。 本项目申请人，在参与国家自然科学基金课题的科研工作时首次发现，于再灌注前 15min静注低浓度精胺不仅能显著减轻心肌损伤，还可明显降低大鼠缺血30min/再灌注 1h时无复流不着色区占全心总重量的比值。因此我们提因此我们提出出假设：在再灌注前给予适当剂假设：在再灌注前给予适当剂 量的外源性精胺可以防治无复流现象的发生，机制量的外源性精胺可以防治无复流现象的发生，机制可能与可能与诱导一定程度的自噬，减轻缺诱导一定程度的自噬，减轻缺 血和再灌注性损伤血和再灌注性损伤等等有关有关。 本课题在全面检索文献的基础上，通过严密科研设计，拟采用多层次(整体，器官， 细胞，分子)和多方法(高效液相色谱，分子生物学，流式细胞仪、电镜等)相结合的方法， 深入观察精胺对大鼠心肌缺血/再灌注无复流现象的影响及其自噬机制， 国内外尚无该方 面的研究。总之，该研究为拓展防治无复流现象提供了新的思路奠定基础，其成果必将 具有一定的理论意义和应用价值。 5.5. 年度研究计划及预期研究结果年度研究计划及预期研究结果。 （包括拟组织的重要学术交流活动、 国际合作与交流计划等） 年度研究计划：年度研究计划： 2012.1 - 2012.12：复制在体模型，采集样本，测定各种生化指标，以观察急性心肌 梗死再灌注后，心肌无复流现象、精胺代谢和自噬程度的改变间 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 14 页 的关系。 2013.1 - 2013.12：对模型给予外源性精胺干预和一只内源性精胺产生，观察精胺对 急性心肌梗死再灌注后，自噬程度和心肌无复流现象的作用，并 探讨精胺诱导自噬的机制。 2014.1 - 2014.12：培养心肌微血管内皮细胞，模拟急性缺血/再灌注模型，观察精胺 干预对内皮细胞的形态及自噬程度的影响。 预期预期研究成果：研究成果： 本课题完成后， 将在大体动物及培养细胞上， 揭示精胺对大鼠急性心肌梗死再灌注 后无复流现象的作用规律和生理病理意义，明确其自噬机制。 预计本课题的完成将发表SCI收录论文12篇。 培养硕士研究生2名， 骨干教师1名。 （二）研究基础与工作条件（二）研究基础与工作条件 1、 工作基础工作基础 （与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩） a）本项目申请人在哈尔滨医科大学攻读博士学位期间先后参加了徐长庆教授课题 组的多项基金课题的研究，包括国家自然科学基金课题大鼠心肌细胞钙敏感受体的生 物学活性及其在心肌缺血-再灌注损伤中的作用 和 大鼠心肌多胺代谢规律和“双刃剑” 作用机制的研究等，也主持了一项黑龙江研究生创新资金项目多胺对大鼠心肌“双 刃剑”作用机制的研究 ，深入研究心肌缺血/再灌注机制并探讨其防治方法及新药开发， 熟练地掌握了心肌缺血/再灌注在体、 离体以及细胞水平模型的制备方法， 系统地掌握了 分子生物学及免疫学技术， 积累了丰富的经验， 并发表了相关文章： Liping Han, Changqing Xu, Chunming Jiang, Hongzhu Li, Weihua Zhang, Yajun Zhao, Li Zhang, Yanqiao Zhang, Weiming Zhao, Baofeng Yang. Effects of polyamines on apoptosis induced by simulated ischemia/reperfusion injury in cultured neonatal rat cardiomyocytes. Cell Biology International 2007; 31(11): 1345-1352等。 b）2007年毕业后到温州医学院工作，在校、省教育厅基金的资助下继续该方面的 课题研究，并于2010年获得了浙江省自然科学基金资助（精胺与后适应联合应用对无复 流现象的作用与机制，项目编号：Y2100028，第一负责人） 。目前研究工作进展顺利， 为开展本项目打下了坚实的基础。关于本申请项目现阶段所取得的部分结果如下： 我们在研究中首次发现，大鼠在体冠脉结扎30min后再灌注2h、6h、12h和24h随再 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 15 页 灌注时间增加，精胺及总多胺池呈时间依赖性下降（图1） ，多胺代谢关键酶鸟氨酸在鸟 氨酸脱羧酶（ODC）和精脒/精胺乙酰转移酶（SSAT）亦随再灌注时间延长而改变（图2、 图3） ；进一步研究发现, 低浓度外源性精胺、精脒可减轻培养心肌细胞缺血/再灌注诱导 的细胞凋亡，且于再灌注前15min静注低浓度精胺不仅能显著减轻心肌损伤，还可明显 降低大鼠缺血30min，再灌注1h时无复流不着色区占全心总重量的比值。但关于外源性 低浓度精胺减轻缺血-再灌注心肌无复流现象的机制还有待于进一步研究。 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 puspdsptotal pool Polyamines content (nmol/g.wet weight) sham 2h 6h 12h 24h 图图 1 1 缺血缺血-再灌再灌心肌多胺含量的变化心肌多胺含量的变化 (*P0.05，*P0.01 与假手术组比，n=8) 图图2 2 Western blot 检测检测各各缺血缺血-再灌再灌注时间大鼠心肌组织中注时间大鼠心肌组织中ODC和和 SSAT 蛋白的表达蛋白的表达 (*P0.05，*P0.01 与假手术组比，n=6) 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 16 页 图图3 RT-PCR检测检测各各缺血缺血-再灌再灌注时间大鼠心肌组织中注时间大鼠心肌组织中ODC 和和 SSATmRNA的表达的表达 (*P0.05，*P0.01与假手术组比，n=6) 本课题组成员从事心血管方面研究多年，课题组成员已经熟练掌握了心肌缺血-再 灌注模型复制技术。申请人在多胺与心肌缺血-再灌注损伤间的相互影响及机制方面作 了初步的研究并取得了结果，验证了心肌缺血-再灌注损伤可导致多胺代谢紊乱，而失 衡的多胺池可加重缺血-再灌注损伤，尤其是精胺减少十分明显，并且发现给予低浓度 外源性精胺可减轻心肌缺血-再灌注损伤，并能减少再灌注心肌无复流区面积。课题成课题成 果已在国内外核心期刊发表论文果已在国内外核心期刊发表论文10余篇，其中余篇，其中4篇被篇被SCI收录。收录。 2、工作条件工作条件（包括已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的 途径，包括利用国家实验室、国家重点实验室和部门开放实验室等研究基 地的计划与落实情况） 本单位拥有完成本课题所需的全部设备： 高效液谱仪，电镜，激光扫描荧光成像仪， 分子生物学检测的配套相应设备(如 PCR 仪，全自动蛋白核酸电泳仪，毛细管电泳分析仪，DNA 合成仪，DNA 测序仪等)，细 胞培养室所需的各种设备，层析和色谱技术所需的各种设备，多道生理记录仪，双光束 紫外分光光度仪等，均为进口仪器。 3、申请人简介申请人简介（包括申请人的学历和研究工作简历，近期已发表与本 项目有关的主要论著目录和获得学术奖励情况。论著目录要求详细列出所 有作者、论著题目、期刊名或出版社名、年、卷（期） 、起止页码等；奖励 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 17 页 情况也须详细列出全部受奖人员、奖励名称等级、授奖年等） a）申请人申请人 韩丽萍韩丽萍 全面负责全面负责 韩丽萍：韩丽萍：博士、副教授。2007年毕业于哈尔滨医科大学，并获得博士学位。攻读学 位期间主持了黑龙江研究生创新资金项目多胺对大鼠心肌“双刃剑”作用机制的研究 (2005-2007), 并参加了国家自然科学基金课题国家自然科学基金课题大鼠心肌细胞钙敏感受体的生物学活 性及其在心肌缺血-再灌注损伤中的作用和大鼠心肌多胺代谢规律和“双刃剑”作用 机制的研究 ， 黑龙江省教育厅海外学人科研合作课题心肌细胞钙敏感受体的基因表 达和生理病理意义研究 ，等多项课题，主要从事心肌缺血再灌注损伤防治的研究，取 得了一定成果，并掌握了大部分机能实验、细胞培养、分子生物学实验技能及膜片钳等 技术。 毕业后任教于温州医学院生理教研室。工作三年，主持了浙江省教育厅科研资金项 目 多胺对大鼠心肌缺血-再灌注损伤的作用及机制 ， 温州医学院科研发展基金项目 多 胺对大鼠心肌缺血-再灌注损伤的影响及机制初探 ，并顺利结题。2010年立项省自然课 题一项，参与国家自然课题一项。 近年发表的主要论著近年发表的主要论著： 1. 韩丽萍，李鸿珠，姜春明，徐长庆，龚永生，郭益民. 精胺抑制模拟缺血-再灌注心肌细胞 Fas/FasL 的表达. 中国病理生理杂志 2010；26（4）:630-634 2. Liping Han, Changqing Xu, Hongzhu Li, Chunming Jiang , Yajun Zhao. Polyamine metabolism in rat myocardial ischemia-reperfusion injury. Int. J Cardiology .2009; 132(1): 142-144.（SCI， IF=3.469） 3. 韩丽萍韩丽萍，徐长庆，姜春明，李鸿珠，赵雅君，龚永生，杜友爱，郭益民. 多胺代谢与心肌缺 血再灌注损伤关系的实验研究. 中华心血管病杂志2008；36（4） ：346-349. 4. Liping Han, Changqing Xu, Chunming Jiang, Hongzhu Li, Weihua Zhang, Yajun Zhao, Li Zhang, Yanqiao Zhang, Weiming Zhao, Baofeng Yang. Effects of polyamines on apoptosis induced by simulated ischemia/reperfusion injury in cultured neonatal rat cardiomyocytes. Cell Biology International 2007; 31(11): 1345-1352.（SCI，IF=1.8） 5. 韩丽萍韩丽萍，徐长庆，姜春明，李鸿珠，孙轶华. 精胺减轻大鼠在体心肌缺血-再灌注损伤的作用 及机制.中国病理生理杂志2007；23（5） ：839-843. 6. Chun-ming Jiang， Li-ping Han，Hong-zhu Li, Yingbo Qu, Zhuoran Zhang, Rui Wang, Chang-qing Xu, Weimi