脱氧核糖核酸电致化学发光传感技术的研究.pdf

第4 1 卷 2 0 1 3年 1月 分析化学 ( F E N XI H U AX UE ) 特约来稿 Ch i n e s e J o u rna l o f An a l y t i c a l Ch e mi s 仃 y 第 1 期 19 特 约 来 稿 ! ! ； ； ： ： 嬲 DOI ：1 0 3 7 2 4 S P J 1 0 9 6 2 0 1 3 2 0 7 7 6 脱 氧核糖核 酸电致化学发光传感技术 的研 究 张 帆 陈 红 何 品刚 方禹之 ( 华东师范大学化学系，上海 2 0 0 2 4 1 ) 摘要电致化学发光( E C L ) 由电化学反应直接或间接引发 ， 具有灵敏度高、 选择性好、 易实现实时化和集成 化、 可进行原位检测的优点， 为生命科学进入到分子水平研究提供了有力的方法。脱氧核糖核酸( D NA) 研究 是生命科学领域中极为重要的内容， 特定 D NA序列的定量检测在法医鉴定、 疾病预防、 环境监测等领域 ， 尤 其是对疾病的早期准确诊断及治疗具有重要意义。D NA E C L传感技术 ， 被认为是最有发展前景的一类 D NA 分析方法， 是当今生物学和医学领域的前沿性研究课题。本文重点评述了国内近 5年 D NA E C L传感技术的 研究工作， 最后对其研究前景进行了展望。 关键词电致化学发光 ； 脱氧核糖核酸；信号扩增； 评述 1 引 言 电化学发光( E C L) 是 由电化学反应直接或间接 引发 的化学发光现象 。通过电极对含有化学发光 物质的体系施加一定的电压或通过一定的电流 ， 使得电极产物之间或电极产物与体系中其它外加共反 应物之间发生化学反应 ， 从而产生化学发光 ； 或者发光物质在 电极上直接发生氧化还原反应后 ， 产生的 某种中间态物质因其具有不稳定性发生分解 ， 从而引发发光现象。E C L是 电化学和化学发光相结合 的 产物 ， 因此也兼具二者的优点 ， 如灵敏度高、 选择性好 、 易实现实时化和集成化 、 可进行原位检测等 。此 外 ， E C L还能与多种技术( 如高效液相色谱、 毛细管电泳及流动注射等) 联用 】 。 在 E C L研究中， 特别受到科学家们关注的是 E C L生物传感的研究， 其应用领域不断被拓展， 特别 是在临床医学检验方面。 目前 ， 临床中免疫 、 肿瘤标记物等检测均采用联 吡啶钌 E C L检测技术 。脱 氧核糖核酸( D N A) 作为遗传信息的承担者， 在生命科学和临床分析中有着重要意义。早在 1 9 9 0年， B a r d课题组 “ 就利用 E C L技术研究 了 D N A 与联 吡啶钌佴 关吡啶锇 的相互作用 ， 对 E C L信号分子在 D NA序列分析中的应用研究进行 了探讨 。近年来 ， D N A一 电致化学发光 ( D NA- E C L) 传感技术备受关 注。本文主要对这一研究领域在国内的发展和本课题组 的相关工作进行了综述。 2 DN A E C L传感技术 D N A E C L传感技术是根据单链 D N A( s s D N A) 杂交反应前后 E C L信号的变化发展的。自1 9 9 1 年， B la c k b u r n等 首次利用 R u ( b p y ) ； 的 E C L信号进行免疫和 D N A探针杂交分析， 并将其应用于临 床诊断以来， 将 R u ( b p y ) ； 及其衍生物标记在 D N A上， 通过 E C L进行 D N A序列的测定得到了广泛研 究。B a r d 课题组在这方面做了大量工作( 图 1 ) 13 ,14 。本课题组【1 以 L ( 4 一 氨基丁基) 乙基异鲁米诺 ( A B E I ) 为探针 D NA的标记物 ， 利用 E C L检测技术可准确识别 出三碱基错配序列 ， 对互补序列的响应 达到 3 0 x 1 0 一 mo l L 。以羧基二茂铁标记的 s s D NA为探针 ， 通过测定羧基二茂铁对鲁米诺 双氧水体系 的 E C L催化信号 ， 同样也能很好地识别三碱基错配序列 。 大多数 D N A E C L传感技术采用的是直链型 D N A探针。近年来 ， 分子信标作为一种具有茎环特殊 结构的 s s D N A分子口 ， 越来越多地用于化学、 生物学和医药学领域中的 D N A和蛋白质等生物分子识 2 0 1 2 7 - 1 4收稿 ； 2 0 1 2 9 - 2 6接受 本文系国家 自然科 学基金 ( No 2 1 0 7 5 0 4 2 )资助项 目 E - ma i l ： p g h e c h e me c n u e d u e l l 2 分 析 化 学 第 4 1 卷 别 。由于分子信 标 的茎 部是完全 互补 的碱基 对， 目标 D N A若想与分子信标杂交， 使其开环， 需要 克服碱基对之 间的静 电作用。因此 ， 对 目标序列 的 互补程度就有较高的要求 ， 进而提高 了检测 的选择 性。在分子信标的末端标记上E C L信号分子钌 化合物 ， 当与 目标 DN A杂交后 ， 分子信标 的茎环结 构转换成线性双链结构 ， 标记有 钌化合物 的探 针末 端远离 电极表面 ， 导致 E C L强度降低 ( 图 2 ) ， 2 4 1 ， 碱 基错配序列与完全互补序列 的信号有非常明显的区 别 。Wu等 利用 C C O 电极 固有 的阴极 E C L特 性 ， 将标记有二茂铁分 子的分子 信标 固定在电极表 面， 发展了无试剂型 D N A E C L传感技术 。完全互补 _ _ 一 S o l i d s u b s t r a t e 一 I mmo b i l i z a t i o n la y e r I !i I i i I l li S in g l e s tr a n d D N A 图 1 E C L检测 DN A杂交的原理图 1 F i g 1 S c h e ma t i c d i a g r a m o f DNA h y b ri d i z a t i o n d e t e c t i o n u s i n g E C L( R e p r i n t e d w i t h p e r mi s s i o n f r o m A me r i C a 1 C h e mi c a l S o c i e t y ) 序列的加入使得 E C L信号增强， 单碱基错配序列的信号强度约为完全互补序列的7 0 。 图2 D N A E C L传感技术用于 D NA杂交检测的示意图 F i g 2 S c h e ma t i c d i a g r a m o f D N A E C L s e n s i n g f o r t h e d e t e c t i o n o f D N A h y b r i d i z a t i o n ( R e p ri n t e d w i th p e rm i s s i o n f r o m S p r i n g e r ) 3 纳米材料在 D N A E C L传感技术中的应用 纳米材料被认为是跨世纪材料研究领域的热点。在 D NA E C L传感技术中， 纳米材料的应用也越 来越普遍 。纳米材料主要是利用 D NA E C L标记物进行信号扩增 ， 以提高灵敏度 ， 以及利用纳米材料在 电极表面固定 E C L活性分子 ， 通过提高其有效浓度使得检测灵敏度进一步提升。 3 1 纳米材料应用于 D N A- E C L标记物 将纳米材料作为 E C L信号分子或者纳米材料与E C L信号分子的复合物， 通过化学键合作用， 直接 或间接地连接在 D NA的末端 ， 可对 目标 s s D N A进行定量测定。 量子点( Q Ds ) 是一种新兴的发光材料 ， 具有独特 的光电性质。因此， 量子点作为一种新 型的 E C L 发光体也受到越来越多 的关注。在量子点 E C L体系应用 于 D NA等生物分 子的分析研究 中， H u a n g 等f 2 6 】 以亲和素标记的 Q Ds 作为 E C L信号分子 ， 若生物素标记的捕获 D N A能够与 固定在金电极表面的 探针 D N A杂交形成 d s D N A， Q Ds 就能通过生物素与亲和素的特异性结合而 固定在 d s D N A上 ， 产生 E C L信号 ， 检出限为 1 0 p mo l L， 同时还有较 高的选择性 ， 以及方法简单 、 操作便利 、 省时等优势 。Hu 等2 在纳米孔金叶电极表面发展了一种新型的量子点 E C L检测方法。在该方法中， 目标 D N A与固定 在电极表面的捕获 D N A杂交 以及氨基修饰 的探针 D NA杂交形成 “ 三 明治结构” ， 3 巯基丙酸包裹 的 C d Y e Q D s 通过酰胺键标记在“ 三明治” 结构的末端， 以 s ， 0 i 一 为共反应物， 可检测出 5 1 0 m o l L目标 D N A， 重现性良好。为了提高检测的灵敏度， 海洪等 使用了量子点双标记法， 将 F e O A u 磁性纳米 粒子和 Q D s 分别标记在捕获探针和信号探针上， 通过它们与目标 D N A之间的杂交反应， 在磁控玻碳电 极表面构建“ 三明治结构” ， 实现了对目标序列的高灵敏检测； D i v s a r 等 合成了 C d S Q D s 与聚酰胺 胺 树状分子的纳米复合物， 以此来进行 E C L信号的扩增， 并以分子信标为探针 D N A， 几乎实现了单个 目 标 D N A分子的检测 ， 线性范围宽达 7个数量级( 图 3 ) 。 第 1 期 张 帆等： 脱氧核糖核酸电致化学发光传感技术的研究 毒 二瓣 QDs Na n o c o mp o s i t e A u N P s ， 、 | T a r g e t _ GC De n d r i me r C d 2 i o n p a i r QD s Na n o c o mp o s i t e _ GC GC GC 图3 以量子点树状纳米复合物为标记物在 E C L传感平台上超灵敏检测 D N A的示意图 】 F i g 3 S c h e ma t i c r e p r e s e n t a t i o n o f u l t r a s e n s i t i v e DNA d e t e c t i o n O il EC L s e n s i n g p l a t f o r m l a b e l e d wi t h q u a n t u m d o t s( Q Ds ) 一 d e n d r i m e r n a n o c o m p o s i t e( R e p r i n t e d w i t h p e r mi s s i o n fi o m t h e R o y a l S o c i e t y o f C h e mi s t r y ) 以金纳米颗粒作为D N A E C L标记物， 使得 D N A E C L传感技术的灵敏度显著提高。Wa n g等p 。 应 用金纳米颗粒作为标记有 R u ( b p y ) ， ( d c b p y ) NHS的探针 D NA的载体 ， 对 目标 D N A进行了检测， E C L 信号明显放大 ， 对 目标 DN A的检 出限为 5 0 1 0 一 mo l L。C h a i 等 在探针 D N A上面标记了鲁米诺功 能化 的金纳米颗粒 ， 通过“ 三明治” 结构的构建检测 目标 D NA。金纳米颗粒的 E C L信号放大作用实现 了具有高灵敏度的 D N A检测和结核杆菌的检测 】 。S h a n等 利用 C d S ： M n纳米晶膜作为 E C L发光 体， 金纳米颗粒既作为E C L的猝灭剂， 又作为增强剂， 两者分别固定在分子信标的两端， 以此构建 E C L 传感平台检测 目 标 D N A。该方法具有极高的灵敏度， 检出限低至 5 0 a mo l L 。结合等温循环放大技术， 检测灵敏度得到进一步提升， 下降了一个数量级 】 ， 并可用于单核苷酸多态性 的检测_3 5 。 掺杂R u ( b p y ) j 的S i O 纳米颗粒， 因为在S i O 纳米颗粒中包含有大量的R u ( b p y ) ； ， 且 S i O 表面 可以方便地进行功能化 ， 修饰氨基 、 巯基 、 羰基等基 团， 实现与生物分子 的连接 ， 因此也是一种理想的 D NA E C L纳米标记物 。本课题组 合成了掺杂 R u ( b p y ) 的 S i O 纳米颗粒 ， 首次将其作为 E C L活 性分子用于特定 D NA序列的识 别。S i O， 纳米颗粒对 E C L信号 的放大 ， 使得该方法具有很高 的灵敏 度， 对互补序列的检出限可达到1 O x l O m o l L ( 图4 ) 。S u n等 将掺杂R u ( b p y ) ； 的S i O 纳米颗粒 标记在电极表面的探针 D N A上 ， 高离子强度使探针 DN A形成茎环结构 ， 与 目标 D NA杂交后 ， 分子信 标再次开环形成双链结构， 纳米颗粒与电极之间的距离由近到远， 导致 E C L信号由强变弱， 检出限仅为 5 0 x l 0 mo l L 。该课题组在金电极表面， 通过捕获D N A、 目标 D N A和掺杂 R u ( b p y ) 的 S i O 纳米颗 粒标记的探针 D N A之间的杂交反应， 形成交联结构， 从而使纳米颗粒贴近电极表面， 产生 E C L信号， 最 低可检测1 0 x l 0 mo l L目标 D NA J 。 碳纳米管( C N ) 也可用作为 D N A E C L纳米标记物 ， 例如 L i 等4 0 将碳纳米管作为探针 D NA和钌 化合物的载体， 构建“ 三明治” 传感体系， 对目标 D N A进行了杂交检测。因为碳纳米管承载了大量的钌 化合物， 使得信号明显放大， 对目标 D N A的检出限可达 9 0 x 1 0 m o l L 。 3 2 纳米材料应用于 E C L活性分子的固定 在电极表面固定 E C L活性分子能够节约试剂， 提高有效浓度， 进而提高分析物的灵敏度和选择性。 同时， R u ( b p y ) 的泄漏对 E C L的灵敏度和稳定性有着较大的影响。因此， 人们尝试用各种新型材料 辩一 4 分 析 化 学 第 4 l 卷 A 图4 ( A) 掺杂 R u ( b p y ) 的S i O 2 纳米颗粒标记的寡居核苷酸探针示意图； ( B ) 掺杂 R u ( b p y ) ； 的 S i O 纳米颗粒标记的寡居核苷酸探针用于 D NA杂交的 E C L检测示意图 F i g 4 S c h e ma t i c r e p r e s e n t a t i o n o f( A) R u ( b p y ) d o p e d S i O 2 n a n o p a r t i c l e s( S N P s )l a b e l e d o l i g o n u c l e o t i d e s p r o b e s a n d( B ) E C L d e t e c t i o n o f D N A h y b r i d i z a t i o n b a s e d o n t h e R u ( b p y ) 2 十 _ d o p e d S N P s l a b e l e d o l i go n u c l e o t i de s pr o be s 口 和固定方法提高检测 的灵敏度和稳定性。在这些材料中， 纳米材料在 E C L活性分子的固定方面展现了 许多优 良的性能 ， 如 良好的传导性 、 超大表面积 、 独特的催化特性等。通过纳米材料固定 E C L活性分子 拓宽 了 D N A E C L的应用前景 。 本课题组通过金纳米颗粒固定 R u ( b p y ) ； ， 利用二茂铁( F c ) 对 R u ( b p y ) j 的E C L信号的高效猝 灭 ， 结合分子信标 ( MB) 的茎环结构建立了一种可控固相 R u ( b p y ) E C L膜。首先 ， 将 R u ( b p y ) 与金 纳米颗粒掺杂， 并将其偶联到金电极上 ， 再通过 Au s键将标记有 F c的分子信标 固定在 E C L膜上 ( 图5 ) 。目 标物的加入可以很好地改变分子信标的构象， 使得F c 和电极表面R u ( b p y ) ； 的距离发生变 化， 进而改变修饰电极的 E C L强度， 实现对 目标物特异性、 高灵敏的测定。这些 目标物包括 目标 DNA4 、凝血酶 。 州、 T 4 D N A连接酶 和小分子腺苷 。 一S H C H 2) r _N H 2 C itr a te c a p p e d A u N P s R u ( b p y )+ j S H - ( C H 2) ( ) H 一 叠 R u ( b p y ) 3 - A u NP s c o p o s i t e 删 图5 F c MB R u ( b p y ) ； 一 A u N P s 电极的制备过程示意图： ( A) 金电极表面R u ( b p y ) ； A u N P s 修饰的 发光基底 ； ( B) F c MB R u ( b p y ) 23 一 Au N P s电极 的猝灭层 F i g 5 S c h e ma t i c r e p r e s e n t a t i o n o f t h e p r e p a r a t i o n o f t h e F c me l e c u l a r b e a c o n( MB) 一 R u ( b p y ) 一 A u N P s e l e c tr o d e ： ( A)L u mi n e s c e n t s u b s tr a t e o f R u ( b p y ) A u NP s o n A u e l e c t r o d e ； ( B)Q u e n c h i n g mo n o l a y e r o f f e r r o c e n e r F c ) 一 MB R u ( b p y ) 23 一 A u NP s o n A u e l e c tr o d e We i 等 将 S iO ， 包裹 R u ( b p y ) ； 壳核式纳米颗粒修饰在玻碳电极上， 通过层层 自组装技术进行 D N A等生物分子的固定， 由于空问位阻效应以及共反应物的扩散控制， E C L信号强度随着生物分子的 固定而降低。该课题组又报道了一种基于 C N T s N a fi o n R u ( b p y ) j 复合膜修饰电极的无需标记的 D N A E C L传感技术 ， 可对 3 0 4 x l O mo l L鲑鱼精 d s D NA及 3 9 3 x l O 。 mo l L单碱基错配 p 5 3基因序 第 1 期 张 帆等： 脱氧核糖核酸电致化学发光传感技术的研究 列进行检测( 图6 ) 。T a o等 在玻碳电极表面修饰 了一层多壁碳纳米管一 聚苯乙烯磺酸钠 有机改性硅 酸盐复合膜来固定 R u ( b p y ) ； ， 青鱼精 d s D N A的检 出限为 2 O 1 0 g m L。本课题组 用多壁羧基化的 碳纳米管( C O O H- MWNT s ) 进行 R u ( b p y ) 的固定 ， 经聚吡咯膜把 MWN T s R u ( b p y ) ； 混聚体与金纳米 颗粒标记 的 D N A分析物相连 ， 将葡萄糖脱氢酶参与 的专一性酶促反应与高灵敏 的 E C L反应偶联 ， 建立 一 种直接 、 准确的固相 E C L检测人类 p 5 3肿瘤抑制 基因的方法 。 4 磁颗粒在 D N A E C L传感技术中的 应 用 磁颗粒是一种较好的生物物质的载体 ， 已广泛应 图 6 玻碳电极修饰和 D N A E C L检测过程示意图 F i g 6 S c h e ma t i c i l l u s t r a t i o n o f g l a s s y c a r b o n e l e c tro d e mo d i fi c a t i o n a n d DNA E CL d e t e c t i o n p r o c e d u r e s ( R e p r i n t e d wi t h p e r mi s s i o n f r o m E l s e v i e r ) 用于 D N A、 蛋白质 、 酶、 细胞等多种生物物质的分离与纯化。Mi a o等5 1 利用包裹 R u ( b p y ) B( C F ) 的 聚苯 乙烯微球标记探针 s s D NA， 与附着在磁颗粒表面的 目标 s s D NA杂交 ， 磁场分离后 ， 甲腈溶出聚苯 乙 烯微球包埋的R u ( b p y ) B ( C F ) ， 检测其 E C L信号， 进而进行 D N A的定量分析， 具有很高的灵敏 度 。S h e n等 将磁纳米颗粒固定在“ 三明治” 结构的顶端 ， 尿 素的加入使得探针 D NA和 目标 D NA发 生解链 ， 从而释放出磁颗粒。将 R u ( b p y ) ； 连接在磁颗粒上， 利用磁铁富集到金电极表面进行 E C L信 号检测， 检出限为 1 2 f m o l L目标D N A。将碳纳米管包覆在 R u ( b p y ) ； 修饰的磁颗粒上， 检测灵敏度进 一 步提高， 可对 3 1 0 。 m o l L目标 D N A进行检测【5 3 。Z h o u 等 报道了一种通过等位基因特异性寡核 苷酸连接法和基 于磁颗粒 的 E C L检测技术 ， 对 基 因组 D N A 中点 突变进 行分 析 的新 方法。两条 由 R u ( b p y ) ； 和生物素标记的探针序列与突变 目标物完全互补， 在其存在时， D N A连接酶可以将两个探 针连接在一起 ； 若有等位基因错配存在 ， 连接就不会发生。连接产物 由磁颗粒捕获并进行 E C L测定。 结合滚动循环扩增技术 ， 他们对点突变 5 5 进行了超灵敏的检测 ， 检出限为 2 a mo l 突变链。 聚合酶链式反应( P C R) 是一种分子生物学技术 ， 用于放大特定 的 DN A片段 ， 可看作生物体外 的特 殊 D NA复制。在 电致 化 学发 光一 聚合 酶 链 式反 应 ( E C L P C R)的研 究 中， 邢 达课 题 组做 了大量 工 作_5 6 ” 。他们采用 R u ( b p y ) ； 标记的上游引物和生物素标记的下游引物对目的片段进行 P C R扩增， 再通 过生物素与链霉亲和素包被的磁珠连接， 将生物素标记的D N A片段收集到检测池中， 利用 E C L P C R的方 法对旋转酶 B基因进行分析 ， 从而实现海鲜 中副溶血孤菌的检测。另外， 他们在 P C R扩增之后 ， 采用限制 性 内切酶 Mv a I 对扩增产物进行酶切 ， 由于只有野生型样品能被切断 ， 以此实现对胰腺癌组织中的 K r a s 癌基因和对 H r a s 致癌基因的点突变分析。他们还发展 了一种基于纳米磁性 引物 的 E C L P C R方法用 于基因组检测 ， 在这个方法中 ， P C R过程和 E C L检测直接在磁性纳米颗粒表面进行 ， 磁颗粒既作为原位 P C R引物的固定 ， 又用于原位 E C L检测 中 P C R产物的富集 ， 具有快速、 特异性好和灵敏度高的优势 。 5 DNA- E CL传感技术 的拓展 D N A - E C L传感技术不仅能够对 D N A序列进行分析检测， 而且， 近年来 D N A E C L传感技术已拓 展到对金属离子、 有机小分子 、 蛋 白甚至细胞的识别检测 。对蛋 白质和有机小分子等的检测主要基于核 酸适配体 E C L传感技术； 对金属离子的分析主要是基于金属离子与特定 D N A序列之间的相互作用。 5 1 核酸适配体 EC L传感技术 核酸适配体 ( A p t a m e r ) 是通过 S E L E X 技术筛选出来 的一段由 2 06 0个碱基组成 的单链寡聚核苷 酸 ， 可以和特异性 的目标分子结合 ， 形成一些稳定 的三维空间结构 ， 如 G一 四分体 、 发夹 、 假结 、 凸环等。 这些可以发生特异性结合的 目标分子包括蛋 白质 、 有机小分子 、 离子、 核酸 、 甚至整个细胞等。当 目标分 子存在时， A p t a m e r 会在其作用下折叠成特殊的二级结构。与 D N A E C L生物传感相 比， A p t a m e r E C L 6 分 析 化 学 第 4 l卷 传感是将识别元件从并无其它特殊功能的 s s D NA变换成 A p t a me r ， 它 的特异性和广泛性大大拓宽了其 应用 范 围 。常 见 的 目标 分 析 物包 括 凝 血 酶 、 溶 菌 酶 、 药 物 小 分 子 引 、 三磷 酸腺 苷 ( A T P ) 、 腺苷 、 细胞 等。 文献 7 2 ， 7 7 1 1 用“ 三明治” 结构对凝血酶进行了检测 ， 首先将 A p t a me r 1固定在金纳米颗粒表面 ， R u ( b p y ) 标记 的 Ap t a me r 2和凝血酶与其形成“ 三明治 ” 结构 ， 基于金纳米颗粒的信号放大作用实现 了凝血酶的高灵敏检测。本课题组7 4 1 在直立碳纳米管阵列电极表面 ， 通过 电化学沉积壳聚糖 的方法将 C d S Q Ds 进行固定 ， 氨基修饰的 A p t a me r 通过戊二醛固定在 Q Ds 膜上 ， 以此进行凝血酶的 E C L检测 ， 检 出限为 5 1 0 m o l L ， 具有快速、 特异性和稳定性好、 灵敏度高等优势。J i e 等 将 C d S e Z n S Q D s 连接 在树状分子上 ， 以 Q Ds 树状分子为 E C L信号分子进行细胞分析。他们将 Ap t a me r固定在 电极表面， 并 与修饰在 Q D s 树状分子上的探针 D NA杂交 ， 加入细胞以后 ， 细胞与 A p t a me r 的特异性结合释放 出 Q Ds 树状分子 ， E C L信号由强变弱。结合基于磁颗粒的循环放大技术 ， 进一步提高了检测灵敏度 。 5 2 DN A- E C L传感技术用于金属离子的检测 近年来 ， 由于 D NA序列与金属离子之问的高特异性相互作用， 发展了一种金属离子检测新方法。 通过钌化合物标记的富含胸腺嘧啶( T) 和胞嘧啶( C) 的 D N A序列 ， 可以对 H g 和 Ag 进行检测 ， 它 们分别与双链 D N A 中的 T T错配和 C C错 配有着特殊的亲和力 ， 可形成 T Hg T和 C A g + - C复合 物 。H g 和 Ag 的加入使得 D NA的构象发生变化 ， E C L强度也会发生相应的变化。此外 ， 还可 以 通过 D N A酶传感技术对 P b 进行检测。首先将标记有钌化合物的酶链固定在电极表面， 通过杂交反 应形成双链 D N A。加人 P b 后 ， D NA酶就会催化双链 D NA的水解分裂 ， 导致 E C L响应发生 变化 ， 实 现了 P b 的高灵敏检测( 图3 ) 。为了提高检测的灵敏度和选择性， Z h u 等 叭 将掺杂 R u ( b p y ) ； 的 S i O ， 纳米颗粒标记在 s s D N A上； L i 等1 将 R u ( b p y ) ； 标记的H 识别双链 D N A序列固定在磁颗粒 表面 ， 然后进行磁性富集 ； Ma等 以树状分子作 为 R u ( b p y ) 的载体 ， 再对 Hg 特异性识别序列进行 标记。 在金属离子的 E C L检测中， E C L活性分子除了标记在 D NA序列上 ， 还可以嵌入 d s D N A 的双螺旋 结构中。Y u a n 等 叫以嵌入d s D N A中的R u ( p h e n ) r作为E C L信号分子进行H 检测， 发展了无需标 记的 E C L传 感 技 术。当加 入 H g 时 ， T H g T的 生成 会 使 得金 电极 表 面形 成 “ 三 明治 ”结 构 ， R u ( p h e n ) 1 就会嵌入 d s D NA中， E C L强度 由小变大 ， 检出限可达 0 2 5 n mo l L 。 6 DNA- E CL传 感技术的展 望 DN A E C L传感技术作为一种简便 、 灵敏 的分析技术 ， 在临床 医学 、 遗传工程 和抗癌药物的筛选等 方面都有着广泛应用。因此 ， D NA E C L传感技术备受关注。D NA E C L传感技术未来发展将会从以下 几个方面进行展开 ： ( 1 )新型 高效 E C L信号分子的研 制 研究者将力求能够得 到高效的 E C L信号分 子 ， 例如采用新型的纳米材料和多 E C L信号分子标记等 ， 以寻找能在标记 E C L信号分子时更好地保持 生物活性的同时获得更灵敏的 E C L信号；( 2 )E C L信号分子 固定技术的开发 目前报道的 E C L 固相 电极存在着使用有效期较短 、 稳定性较差 、 溶液状态下 E C L灵敏度相对偏低等缺点。因此 ， 发展高灵敏 度和长寿命的 E C L固定技术仍将是一个发展方 向。同时 ， 探索无需探针 D N A在电极表面固定 ， 直接在 溶液中进行杂交识别的均相 D N A杂交电化学生物分子识别技术， 也是 D N A E C L传感技术中的方向之 一 ；( 3 )多目标 D NA 同时识别 多 目标 D N A同时识别对疾病诊 断检测具有十分重要 的意义， 因此能 够进行多 目标物同时检测的阵列 D NA E C L传感技术也将会成为未来重要 的发展 方向之一；( 4 )E C L 与各种分析技术的联用 联用技术 的使用会扩大各个子技术 的应用范围 ， 使其表现出更好的分析性能； ( 5 )E C L分析仪的小型化E C L传感技术广泛用于医疗卫生检测 、 生化分析领域 ， 发展微型 E C L仪器 对推动我国生命科学和医药卫生科学领域的发展 ， 以至对国民经济建设 和国家安全都具有重要意义。 随着研究的深人 ， D N A E C L传感技术必定会在基因突变检测 、 药物筛选及药物作用机理研究等方 面发挥更加重要的作用。 第 1期 张 帆等： 脱氧核糖核酸电致化学发光传感技术的研究 7 Re f e r e n c e s 1 XU G u o B a o ，D O N G S h a o J u n C h i n e s e， A n a 1 C h e m ， 2 0 0 1 ， 2 9 ( 1 ) ： 1 0 3 1 0 8 徐国宝， 董绍俊分析化学， 2 0 0 1 ， 2 9 ( 1 ) ： 1 0 3 1 0 8 2 L I Ha i J u a n ，H A N S h u a n g ， H U L i a n Z h e ， X U G u o B a o C h i n e s e A n a 1 C h e m ， 2 0 0 9 ， 3 7 ( 1 1 ) ：1 5 5 7 1 5 6 5 李海娟， 韩 双，胡连哲， 徐国宝分析化学， 2 0 0 9， 3 7 ( 1 1 ) ：1 5 5 7 1 5 6 5 3 We i H，Wa n g E K L u m i nes c e n c e ， 2 0 1 1 ， 2 6 ( 2 ) ： 7 7 8 5 4 Mi a o W J C h e m R e v ， 2 0 0 8 ， 1 0 8 ( 7 ) ： 2 5 0 6 2 5 5 3 5 H u L Z ， Xu G B C h e mS o c R e v ， 2 0 1 0 3 9 ( 8 ) ： 3 2 7 5 3 3 0 4 6 J i e G F ，L i u P， Z h a n g S S C h e mC o m mu n ， 2 0 1 0 ， 4 6 ( 8 ) ： 1 3 2 3 1 3 2 5 7 X u K ，H u a n g J R， Y e Z Z ，Y i n g Y B ，L i Y B S e n s o r s ， 2 0 0 9， 9 ( 7 ) ： 5 5 3 4 5 5 5 7 8 L i J ， G u o S J ， Wa n g E K R S C A d v a n c e s ， 2 0 1 2， 2 ( 9 ) ： 3 5 7 9 3 5 8 6 9 WA N G Y o n g H o n g ，H E X i a o X i a o ，WA N G K e Mi n ，S U Q i a n ，C HE N Z h i F e n g ，Y A N G e n P i n g C h e m J C h i nes e U n i v e r s i t i e s ，2 0 1 23 3 ( 6)：1 1 6 2 1 1 6 6 王永红，何晓晓， 王柯敏， 苏 婧 ， 陈智峰， 晏根平高等学校化学学报， 2 0 1 2 ， 3 3 ( 6 ) ：1 1 6 2 1 1 6 6 1 0 C a r t e r M T， B a r d A J B i o c o n j u g a t e C h e m ， 1 9 9 0 ，1 ( 4 ) ： 2 5 7 2 6 3 1 1 R o d r i g u e z M，B a r d A J A n a 1 C h e m ， 1 9 9 0 ， 6 2 ( 2 4 ) ： 2 6 5 8 2 6 6 2 1 2 B l a c k b u r n G F，S h a h H P，Ke n t e n J H，L e l a n d J ，Ka mi n R A，L i n k J ，P e t e r ma n J ，P o we l l M J ，S h a h A，T a l l e y D B C h e m，1 9 9 1 ，3 7( 9)：1 5 3 41 5 3 9 1 3 X u X H， B a r d A J A mC h e m S o c ，1 9 9 5 ，1 1 7 ( 9 ) ： 2 6 2 7 2 6 3 1 1 4 M i a o W，B a r d A J A n a 1 C h e m ， 2 0 0 3， 7 5 ( 2 1 ) ： 5 8 2 5 5 8 3 4 1 5 Y a n g M L ，L i u C Z ，Q i a n K J ， He P G， F a n g Y Z A n a l y s t ， 2 0 0 2 ，1 2 7 ( 9 ) ： 1 2 6 7 - 1 2 7 1 1 6 Y A N G Mi n L i ， G A O L o u J u n ， H E P i n G a n g ，F A N G Y u Z h i C h i nes e A n a 1 C h e m ， 2 0 0 5 ， 3 3 ( 1 0 ) ： 1 4 6 9 - 1 4 7 2 杨敏丽， 高楼军， 何品刚， 方禹之分析化学， 2 0 0 5 ， 3 3 ( 1 0 ) ： 1 4 6 9 1 4 7 2 1 7 We i F ，S u n B， L i a o W，O u y a n g J H， S h e n g Z h a o X B i o s e nsB i o e l e c t r o n ， 2 0 0 3， 1 8 ( 9 ) ：1 1 4 9 1 1 5 5 1 8 T s o u r k a s A，B e h l k e M A，R o s e S D， B a o G N u c l e i c A c i d s R e s ， 2 0 0 3 ， 3 1 ( 4 ) ： 1 3 1 9 1 3 3 0 1 9 Mi r a n d a C a s t r o R， d e 1 o s S a n t o s 。 Al v a r e z P， L o b o Ca s t a fi 6 n M J ， Mi r a n d a Or d i e r e s A J A n a 1 C h e m， 2 0 0 7， 7 9 ( 1 1 ) ： 4 0 5 0 4 0 5 5 2 O L i J w J ，C h u Y Z ，L e e B Y H， X i e X L S N u c l e i c A c i ds R e s ， 2 0 o 8 ， 3 6 ( 6 ) ： 1 1 7 2 1 J e n k i n s D M，C h a mi B ，K r e u z e r M， P r e s t i n g G，A l v a r e z A M， L i a w B Y A n a 1 C h e m ， 2 0 0 6， 7 8 ( 7 ) ： 2 3 1 4 2 3 1 8 2 2 R a d i A E， A c e r o S t n e h e z J L， B a l d r i c h E ，O S u l l i v a n C K A m C h e m S o c ， 2 0 0 5， 1 2 8 ( 1 ) ：1 1 7 1 2 4 2 3 Z h a n g J ， Q i H L ，L i Y，Y a n g J ， G a o Q， Z h a n g C X A n a 1 C h e m ， 2 0 0 8， 8 0 ( 8 ) ： 2 8 8 8 2 8 9 4 2 4 Y a o W，Wa n g L ， Wa n g H Y， Z h a n g X L， L i L Mi c r o c h i m A c t a ， 2 0 0 9 ，1 6 5 ( 3 _ 4 ) ： 4 0 7 4 1 3 2 5 Wu A H， S u n J J ， Z h e n g R J ，Y a n g H H，C h e n G N T a l a n t a ， 2 0 1 0 ， 8 1 ( 3 ) ： 9 3 4 - 9 4 0 2 6 Hu a n g H P ，L i J J ，T a n Y L ，Z h o u J J ， Z h u J J A n a l y s t ， 2 0 1 0， 1 3 5 ( 7 ) ：1 7 7 3 - 1 7 7 8 2 7 H u X F， Wa n g R Y，D i n g Y， Z h a n g X L ， J i n W R T a l a n t a ， 2 0 1 0 ， 8 0 ( 5 ) ： 1 7 3 7 1 7 4 3 2 8 H A 1 H o n g ， Y A N G F e n g ，L I J i a n P i n g C h i nes e A n a 1 C h e m ， 2 0 1 2 ， 4 0 ( 6 ) ： 8 4 1 8 4 6 海 洪， 杨 峰， 李建平分析化学， 2 0 1 2 ， 4 0 ( 6 ) ： 8 4 1 8 4 6 2 9 D i v s a r F ， J u H X C h e m C o m mu n ， 2 0 1 1 ， 4 7 ( 3 5 ) ： 9 8 7 9 9 8 8 1 3 0 Wa n g H， Z h a n g C X， L i Y， Q i H L A n a 1 C h i m A c t a ， 2 0 0 6 ， 5 7 5 ( 2 ) ： 2 0 5 2 1 1 3 1 C h a i Y， T i a n D Y，Wa n g W， C u i H C h e m C o m mu n ， 2 0 1 0 ， 4 6 ( 4 0 ) ： 7 5 6 0 - 7 5 6 2 3 2 J i a n g J ，C h a i Y，C u i H R S CA d v a nce s ， 2 0 1 1 ， 1 ( 2 ) ： 2 4 7 - 2 5 4 3 3 S h a n Y， X u J J ， C h e n H Y C h e m C o m mu n ， 2 0 0 9 ，( 8 ) ： 9 0 5 9 0 7 3 4 Z h o u H， L i u J ， X u J J ， C h e n H Y C h e m C o m mu n ， 2 0 1 1 ， 4 7 ( 2 9 ) ： 8 3 5 8 8 3 6 0 3 5 Z h o u H， L i u J ， X u J J ， C h e n H Y A n a 1 C h e m ， 2 0 1 1 ， 8 3 ( 2 1 ) ： 8 3 2 0 8 3 2 8 3 6 Z h a o X J ， T a p e c - D y t i o c o R，Wa n g K M，