伦尔欣对糖尿病大鼠肾小球血管细胞外基质表达的干预作用

1 / 11 伦尔欣对糖尿病大鼠肾小球血管细胞外基质表达的干预作用 作者：李强翔，龚汉仁，何美英，尹书东，谢晓云，孙志香 【摘要】 目的 观察伦尔欣对糖尿病大鼠肾小球细胞外基质表达的干预作用。 方法 利用链脲佐菌素腹腔注射法诱导建立 型糖尿病大鼠模型，将实验用SD 大鼠随机分正常对照组、糖尿病组和伦尔欣 治疗 组。治疗 16 周，观察治疗后晚期糖基化终末产物、丙二醛、超氧化物歧 化化酶、内生肌酐清除率 、 24h 尿蛋白排泄率 ；免疫组织化学检测肾 小小球细胞外基质的表达 。结果 造模组大鼠均 出出现肾脏功能损害； 伦伦尔欣能降低糖尿病大 鼠鼠的晚期糖基化终末产 物物、丙二醛、 24h 尿 白白蛋白排泄率和 型胶 原原的表达，增加超氧化 物物歧化酶和内生肌酐清 除除率，硫酸乙酰肝素蛋 白白表达显著升高。结论 伦尔欣通过调节肾小 球球细胞外基质表达发挥 对对糖尿病肾病大鼠肾脏 的的保护作用。 【关 键键词】 伦尔欣；糖 尿尿病模型；细胞外基质 Interventio n of Luner xin on the expressio n of glome rulus extr acellularm atrix in s treptozoto cininduce d diabetic nephropat hy rats AB STRACT: Ob jective T o observe the regula tory effec t of Luner xin on glo merulus ex tracellula r matrix o f streptoz otocin ind uced diabe tic rats. 2 / 11 Methods D iabetic ne phropathy in rats wa s induced by intrape ritoneal i njection o f streptoz otocin. TThe rats w ere alloca ted to nor mal contro l group, m odel group , and Lune rxin group for 1week s. After tthe treatmeent, blood advanced g lycosylati on end pro duct level , malonald ehyde (MDA ), erythro cuprEin (S OD), urina ry albumin excretion rate of t he4 hours, and clear ance rate of creatin ine, as we ll as coll agen and HSPG were determine d by in si tu immunoh istochemis try in dif ferent gro ups. Resullts Diabet es mellitu s and rena l function lesion oc curred in the two mo del groups . Lunerxin could imp rove the g eneral sta te, and de crease adv anced glyc osylation end produc ts, blood urea nitro gen, serum creatinin e, urinary albumin e xcretion r ate of thee4 hours an d the expr ession of collagen . It incre ased clear ance rate of creatin ine and ex pression o f heparan sulfate pr oteoglycan in the ki dney signi ficantly a t the same time. Con clusion L unerxin ha s certain protective effect on the kidne y by regul ating the expression of glomer ulus extra cellular mmatrix. 3 / 11 KEY WORDS: Lu nerxin; di abetic mod el; extrac ellular ma trix 细胞外基 质质 (extracell ular matri x, ECM)散在 分分布于肾小球，是肾小 球 球基底膜的重要组成成 分 分。 型胶原(coll agen , C ) 与糖尿病肾纤维化 关关系密切，硫酸乙酰肝 素素蛋白 (heparan sulfate p roteoglyca n, HSPG)已 被被证明对保持电荷屏障 有有重要作用，故两者成 为为实验 研究 的重点 和和热点。 目前 ，糖 尿尿病肾病 (diabet ic nephrop athy, DN)的的诊疗进展迅速，糖基 化化终产物 (advanc ed glycati on end pro ducts, AGEEs)的形成和氧化应 激激在糖尿病肾病发病中 的的作用已逐渐被重视 1 2，并且在动物 实实验 应用 盐酸氨胍 特特异抑制 AGEs 的形 成成，延缓糖尿病肾病的 发发生、 发展 起到一 定定的效果。但是，由于 其其毒副作用大，未能进 入入临床。有报道葛根素 ( puerarin)在在抑制 AGEs 产生的 同同时还可减少AGEs 的的产生 3，故我们 通通过免疫组化染色观察 伦伦尔欣 (葛根素 )对肾 小小球细胞外基质 型胶 原原、 HSPG 表达的干 预预，从而探讨葛根素对 糖糖尿病肾病的保护作用 的的 机制。 1 材料 与与方法 实验动物 雄性 SD 大鼠 40 只只， 2 月龄左右，体重 2200-250g，清 洁洁级；由湖南农业大学 动动物部提供。实验期间 自自由饮水，摄食饲料为 中中南大学动物中心提供 的的混合饲料，适应性喂 养养 1 周后进行实验。室 温温 18-28 ，相对 湿湿度4 / 11 62%-80%。 仪器和试剂 美美国强生手持式快速全 血血葡萄糖测试仪， FJ XX 型免疫细胞记数 仪仪，日丽 7170 型自 动动生化仪，链脲佐菌素 ( streptozot ocin, STZ, Sigma, Co . USA)，伦尔 欣欣注射液 (湖南益侨制 药药有限公司生产，批号 ： XX0612)；丙 二 二醛 (malonald ehyde, MDAA) 和 超 氧 化 物 歧 化酶 ( erythrocup rEIn, SOD) 试剂盒 (南京建成生 物物公司 )；晚期糖基化 终终末产物 (advanc ed glycosy lation end products, AGEs)ELISSA 试剂盒购 自美 Gen elab 公司 (Lot No 17998) ， SP 免疫组化染 色色试剂盒、兔抗鼠 型 胶胶原抗体、兔抗鼠硫酸 乙乙酰肝素蛋白多糖抗体 由由北京莱博生物实验材 料料研究所提供。 方方法与分组 动物建 模模：大鼠预养 1周后， 空空腹 12h，腹腔注射 SSTZ 柠檬酸钠缓冲 液液 (STZ0mg/kg 体重。 STZ 在柠檬 酸酸钠缓冲液中的质量分 数数为 )。对照组注射等 量量柠檬酸钠缓冲液，依 据据 72h 后尿糖 ，静脉采血测血糖 (怡 成成全血葡萄糖测试仪 )，血糖 /L 者，确定 模模型建立。除去造模失 败败及死亡大鼠，将 20 只只糖尿病鼠纳入本实验 。分组： 正常对照组 (CN 组 10 只 )；糖 尿尿病鼠随机分为 糖尿 病病组 (D组 10 只 )和 伦尔欣治疗组 (D+P 组 10 只 )。伦尔欣 治治疗组每只腹腔注射伦 尔尔欣 80mg/(kgd) ，均连续给药 16 周。 各组5 / 11 为了避免酮 症症和维持糖尿病鼠的生 存存， D 组、 D+P 组隔 日日腹腔注射长效胰岛素 2 -4u，并断尾取血 测测大鼠血糖，使血糖波 动动在 25mmol/L 左左右，实验共 16 周。 标本采集 第 116 周实验终止时，各 组组大鼠在禁食的基础上 ，用代谢笼收集 24h 尿尿，测定尿白蛋白 (UAAE)含量，动物经乙 醚醚麻醉后股动脉放血 5mmL 测大鼠糖基化终末 产产物、丙二醛、超氧化 物物歧化酶、血肌酐， 计计算 内生肌酐清除率 。取左侧肾脏反复灌洗 至至发白，剔除包膜，横 断断切 取约柱状体2 块， 置置于 (多聚甲醛在磷酸 盐盐缓冲液中的质量分数 为为 )多聚甲醛 (含 1 1 000 焦碳酸二乙酯 ) 中固定 12h，石蜡 包包埋，连续切片。 观察指标 生化 指指标：用全自动生化仪 测测血肌酐： AGEs 应 用用竞争性 ELISA 法 ； MDA 采用硫代巴比 妥妥酸法；SOD 采用黄 嘌嘌呤氧化物酶法； 尿 白白蛋白排泄率 (urin ary albumi n excretio n, UAE)：收 集集 24h 尿液，用二甲 苯苯防腐，混匀后取 2mL 用免疫细胞记数仪测 定定； 肾小球滤过率(g lomerular filtration rate, GFRR)：以内生肌酐清除 率率为代表， GFR (尿尿肌酐 尿量 ) 血肌 酐酐。 免疫组化检 测测的操作步骤 见北 京京莱博生物实验材料研 究究所实验指南。免疫组 化化结果的图像 分析 采采用计算机显微图像处 理理系统，在 400 放大 倍倍数下每张片子随机选 取取6 / 11 10 个视野区，对杂 交交信号结果进行灰度扫 描描，以其平均相对灰度 值值作为表达量的值 (用 均均数 标准差表示 )。 免疫组化结果的定 性性判别方法 在显微 镜镜下根据着色程度按以 下下标准判定结果： 阴 性性 (-)：无黄色； 弱弱阳性 (+)：淡黄色 ； 阳性 ( )：黄色 ； 强阳性 ( )：深 黄黄色或黄褐色。 统统计学处理 测定数 值值皆以 s 表示，利用 软软件进行组间方差分析 ，两组间比较用独立样 本本 t 检验，多组间比较 采采用方差分析和 q 检验 。 2 结果 .1 药物对大鼠糖基化 终终末产物、丙二醛、超 氧氧化物歧化酶、尿白蛋 白白排泄率、肌酐清除率 的的 影响 结果显 示示：造模成功的大鼠血 清清糖基化终末产物、丙 二二醛、尿白蛋白排泄率 较较正常组明显升高，超 氧氧化物歧化酶、内生肌 酐酐清除率下降，差异显 著著 (P .2 药药物对 大鼠肾小球 CI、 HSPG表达的影响 HE 染色结果显示 ：光镜检查各组大鼠肾 小小球及小管间质未见明 显显的病理改变；模型组 大大鼠肾组织可见肾小球 明明显增大，肾小球细胞 增增生，散在肾小管上皮 细细胞肿胀变性、脱落， 肾肾小球毛细血管基底膜 弥弥漫性增厚。用药组中 上上述病理改变均有不同 程程度的 减轻。 转贴于 论论文联盟 http:/ 免疫组化结果显 示示：与糖尿病相比，正 常常组状态下肾小7 / 11 球着色 浓浓集，在肾小球系膜细 胞胞、血管内皮细胞及少 量量肾小管上皮细胞胞外 均均可见棕黄色颗粒颜色 加加深且数量增多，肾小 球球血管细胞外 基质 HSPPG 表达显著上调，呈 强强阳性， CI 表达呈阴 性性，经灰度值测定两组 间间差异有显著性差异 (P 表1 各 组组大鼠糖基化终末产物 、丙二醛、超氧化物歧 化化酶、尿白蛋白排泄率 、肌酐清除率的变化的 比比较 Table 1 Changes o f Serum ad vanced gly cosylationn end produ cts, malon aldehyde, erythrocup rEin, urin e albumin, and clear ance rate of creatin ine in dif ferent grooups *P 图 1 Collag en 免疫组化的图 片片 Immunohis tochemical analysis for CI exp ression inn glomeruli of rats ( 400) A: control gr oup; B: D group; C: D+P group 图 2 HSPG 免疫 组组化的图片 analy sis for CI and HSPG expression in glomer uli of rat s (400) A: control group; B: D group; C : D+P grouup 表 2 免疫组 化化各组大鼠肾小球 CI、 HSPG表达的灰度 值值的比较 Table Changes o f immunohi stochemica l optical density CI and HSPG in differe nt groups 8 / 11 *P 3 讨 论论 我国糖尿病肾病有 逐逐渐增多的趋势，对糖 尿尿病患者生活质量和寿 命命有很大的 影响 。 糖糖尿病肾 病病理特点是 肾肾脏肥大，以系膜细胞 增增大、 ECM 积聚为特 征征 4。糖尿病肾病 的的临床诊断依据是白蛋 白白尿的出现。蛋白尿的 病病理生理机制包括肾小 球球内静水压增高、肾小 球球滤过膜负电荷屏障破 坏坏。糖尿病肾病早期白 蛋蛋白尿 (选择性蛋白尿 ) 的出现是电荷屏障遭 到到破坏的结果。硫酸乙 酰酰肝素蛋白多糖的硫酸 乙乙酰肝素侧链带有大量 负负电荷，是组成肾小球 电电荷选择性屏障的主要 成成分，所以说糖尿病肾 病病患者肾小球基底膜上 大大量硫酸乙酰肝素蛋白 丧丧失可能是导致白蛋白 尿尿的主要原因。 I 型胶 原原是一种重要的血管细 胞胞外基质蛋白， 它使血 管管保持稳定的结构和张 力力。对维持血管壁的完 整整性、粘弹性和通透性 有有重要作用，而在血管 内内皮细胞损伤后，它可 明明显促进血小板的聚集 。 ECM 合成和降解 异异常是糖尿病肾病 发 展展 的重要机制。糖尿 病病状态下 ECM 改变的 机机制可能与下列因素有 关关：高血糖可下调稳定 状状态；蛋白质非酶糖基 化化反应；氧化应激诱导 细细胞因子等。已有充分 证证据表明，人体内持久 的的高血糖状态可导致许 多多结构功能蛋白和核酸 蛋蛋白发生非酶糖基化， 形形成AGEs。氧化应 激激可以促进 AGEs 的 形形成，而 AGEs 在体 内内主要是通过交联、与 受受体相互作用和增加氧 化化应激来发挥多种作用 ，两者相互促进，可能 协协同参与糖尿病肾病的 发发病过程 59 / 11 6。 肾小球 ECM 改变是 糖糖尿病肾病的特征性病 变变，逆转 ECM的改变 对对延缓糖尿病肾病的发 生生、发展起至关重要的 作作用7。动物实验 表表明，氨基胍可下调肾 组组织中 、 型胶原基 因因和纤维连接蛋白的表 达达。新近的 研究 资 料料进一步表明伦尔欣和 经经典的糖基化抑制药氨 基基胍抑制糖尿病大鼠体 内内AGEs 形成的作用 相相似 8。 现代 药药理研究表明，伦尔欣 能能降低血液黏度、解除 血血管痉挛、降血脂、改 善善肾 小球的缺血区血流 ，促进内皮细胞功能， 减减少氧化应激及阻断 AGGEs 等作用。 本课 题题实验结果表明：病程 116 周模型组大鼠 UAE 升高，肾小球 ECM 改改变。由于 AGEs 是 公公认的 DM 血管病变的 致致病因子，因此本研究 检检测了伦尔欣对 DM 大 鼠鼠体内 AGEs 的影响 。结果显示：伦尔欣可 使使大鼠增强 HSPG 表 达达，降低 型胶原的表 达达；增加超氧化物歧化 酶酶、肌酐清除率，降低 UUAE，改善肾功能， 并并降低 MDA、 AGEs ，可能通过抗肾脏氧 化化和蛋白非酶性糖化的 双双重作用达到逆转糖尿 病病微血管早期病变的目 的的。有关伦 尔欣抑制糖 基基化和氧化应激的具体 机机制方面，还有待进一 步步的研究。 基金项目 ：湖南省中医药科研基 金金资助项目 ( 63011) 【 参考 文 献献 】 10 / 11 1Fo rbes JM, T hallas V, Thomas MC, et al. T he breakd own of pre existing a dvanced gl ycation en d products is associ ated with reduced re nal fibros is in expe rimental d iabetes J . FASEB J ,003,17(12 ):176217664. 2Zhan g L, Zalew ski A, Liu Y, et al. Diabetesinduced ox idative st ress and l ow grade i nflammatio n in porci ne coronar y arteries J. Circ ulation,00 3,9;108(4):472 478. 3郭 妍，周