液相色谱-串联质谱法测定牛奶中6种甲状腺拮抗剂残留.pdf

第 4 1 卷 2 0 1 3年 2月 分析化学 ( F E NX I HU Ax u E) 研究 报告 C h i n e s e J o u r n a l o f An a l y t i c a l Ch e mi s t r y 第 2期 2 532 57 DOI ：1 0 3 7 2 4 S P J 1 0 9 6 2 0 1 3 2 0 6 4 9 液 相 色谱 串联 质 谱 法测 定 牛 奶 中 6种 甲状 腺 拮抗 剂 残 留 邱元进 林永辉 杨 方 张 琼 苏芝娇 ( 福建 出入境 检验 检疫局 ， 福州 3 5 0 0 0 1 ) 摘要建立了牛奶 中甲巯咪唑 、 硫脲嘧啶 、 甲基硫 氧嘧啶 、 丙基 硫氧 嘧啶 、 苯基 硫氧 嘧啶和 2 一 巯基苯并 咪唑 6种甲状腺拮抗剂残留的液相色谱- 串联质谱分析方法。样品经乙腈沉淀蛋白后 ， 上清液以衍生剂 4 碘苄溴 在 p H=8 0下衍生 2 h ， 衍生液调节 至 p H： 3 _0 ， 以乙酸 乙酯提取 。溶剂挥 干后 以 2 0 甲醇复溶 ， Oa s i s H L B固 相萃取小柱净化 ， 4 mL 5 0 甲醇一 乙腈溶液洗脱， L u n a C 色谱柱分离， 乙腈和 5 mmo l L乙酸铵溶液( 含 0 _2 甲酸) 进行梯度洗脱， 电喷雾正离子模式电离( E S I ) ， 多反应监测( MRM) 模式检测， 内标法定量。结果表明： 牛奶中6种目标物在优化条件下分离良好， 响应值高， 峰形尖锐对称 ， 在 51 0 0 p g k g范围内呈 良好的线性关 系， 相关系数 r 均大于 0 9 9 ； 检出限为 0 1 40 3 2 t g k g ， 定量限为 0 4 81 1 g k g ； 1 0 ， 2 0和 5 0 t g k g添加水 平的平均回收率为 8 2 8 1 1 3 6 ， 相对标准偏差 2 A 一1 4 3 。 关键词 液相色谱一 串联质谱( L C MS MS ) ；甲状腺拮抗剂； 4 - 碘苄溴； 残留 1 引 言 ： 甲状腺拮 抗剂 ( T h y r o i d a n t a g o n i s t s ， T A s ) 是抑 制 甲状腺 功能类 药物 的总称 ， 主要包 括 甲巯 咪 唑 ( T A P ) 、 硫脲嘧啶( 2 - Th i o u r a c i l ， T U) 、 甲基硫氧嘧啶( MT U) 、 丙基硫氧嘧啶( P T U) 、 苯基硫氧嘧啶( P h T U) 、 2 一 巯基苯并咪唑( MB I ) 等。此类药物曾作为饲料添加剂被广泛使用 ， 其主要作用是通过抑制 甲状腺激素 分泌 ， 增大动物的皮下组织 、 肌肉和肠胃对水分的吸收 ， 达到增重的目的。但 T A s 具有致畸和致癌作用 ， 食用残 留此类药物的食品存在巨大的安全风险。因此 ， 欧盟早在 1 9 8 1 年即禁止此类药物用于动物产品 。 T As 类药物极性强 ， 在反相色谱 中保留较弱 ， 很难 与杂质分离 ； 且分子量小 ， 质谱检测 噪音高 ， 硫脲 嘧啶及同系物 同时存在多种互变异构体p _ ， 以上因素均影响药物提取效率 ， 并且在 色谱分离过程中易形 成肩峰或分裂峰 ， 干扰检测 。液相色谱法 检测灵敏度过低 ，而液相色谱一 串联质谱法 踟 则只在简单 基质 中干扰较少。G B T 2 1 3 1 0 - 2 0 0 7 剐采用液相色谱一 串联质谱法检测动物源性食 品中 6种 T A s残留。 但 T AP ， T u， MT U和 MB I 的测定下限离欧盟要求 的 1 0 t g k g相去甚远口 钔， 并且提取过程中需加入对 人体危害极大的巯基乙醇作为提取助剂。 由于直接检测 T A s困难 ， 研究者通过衍生化反应改善 T As 检测灵敏度 ， 目前此类方法 主要有气相 色谱法 m 和液相色谱一 串联质谱法 卜” 】 。气相色谱法检测硫脲嘧啶同系物通常需要两次衍生化反应将 巯基和羟基封端 ， 反应需溶剂转换 ， 费时费力。液相色谱一 串联质谱法仅需反应一次 ， 灵敏度高 ， 快速简 便。本研究利用 T As中的硫醇基在弱碱性条件下与 4 一 碘苄溴 ( 4 - I B B r ) 发生亲核取代反应 ， 生成硫醚 ， 建立了牛奶 中 6种 T As 残留的超高效液相色谱 串联质谱检测方法 。衍生化产物分子构型单一 ， 稳定性 高 ， 峰形尖锐对称 ； 极性降低 ， 在色谱中与杂质分离较好 ； 分子量增大 ， 远离质谱高噪音区， 并且 由于卤代 衍生物易离子化 ， 可显著增强 目标物的响应值和选择性。本方法快速简便 、 专属性强 、 灵敏度高 ， 为其它 动物源性食 品中 T As 类药物检测提供 了实用的方法。 2 实验部分 2 1 仪器与试剂 P r o mi n e n c e U F L C高效液相色谱仪( S h i ma d z u公 司) ； A P I 4 0 0 0 QT R A P三重 四级杆质谱仪 ， 配电喷 2 O 1 2 - 0 6 - 2 1收稿 ； 2 0 1 2 1 0 _ 3 0接受 本文系国家质检总局科技计划 ( No 2 0 1 2 I K 0 3 3 ) 资助 E ma i l ：x mu h 1 6 3 c o m 分 析 化 学 第 4 l 卷 雾离子源( AB S c i e x公司) ； I M3涡旋振荡器( I KA公司) ； O a s i s H L B固相萃取小柱 ( 6 0 m g 3 mL， Wa t e r s 公司) ； 0 2 2 g m有机系滤膜( 津腾公司) ； 数显恒温水浴锅 H H一 6 ( 国华 电器有限公司) 。 甲巯咪唑 ( 1 - Me t h y l - 2 一 me r c a p t o i mi d a z o l ， t a p a z o l e ， T AP ) 、 硫脲嘧啶( 2 - T h i o u r a c i l ， T U) 、 甲基硫氧嘧啶 ( 6 - Me t h y l - 2 一 t h i o u r a c i l ， MT U) 和丙基硫 氧嘧啶 ( 6 - P r o p y l - 2 t h i o u r a c i l ， P T u) ，均购 自 D r E h r e n s t o r f e r 公 司 ； 苯基硫氧嘧啶 ( 6 - P h e n y l 一 2 一 t h i o u r a c i l ， P h T U) 、 2 巯基苯并咪唑 ( 2 - Me r c a p t o b e n z i mi d a z o l e ， MB I ) 以及 内标物 5 , 6 一 二 甲基_ 2 一 硫氧嘧啶( 5 ， 6 - D i me t h y l - 2 一 t h i o u r a c i l ， D MT U) ， 均购 白 S i g ma 公司；所有标准品纯度 均 t9 5 。4 碘苄溴 ( 4 - I o d o b e n z y l b r o mi d e ， 4 - I B B r ， 纯度 9 5 ， 梯希爱上海化成有 限公 司) ； 乙酸铵 ( 优级纯 ， A c r o s 公司) ； 乙酸乙酯 、 乙腈、 甲醇 、 甲酸( 色谱纯， Me r c k公司) ； 其它试剂均为国产分析纯； 实 验用水为 Mi l l i Q s y n t h e s i s 系统制备的超纯水 。 2 2 标准溶液配制 标准储备液配制 ： 将 T A P， T U， MT U， P T u， P h T U和 MB I 用甲醇分别配制成 1 0 0 m g L的标准储备液。 分别准确量取 5 mL上述标准储备液至 1 0 0 mL容量瓶内， 以甲醇定容 ， 此混合标准工作液浓度为 5 mg L 。 将 D MT U用甲醇溶解 ， 配制成 1 0 0 mg L的内标储备液。取 1 mL内标储备液 ， 甲醇稀释至1 0 0 mL， 即为 1 m g L内标工作液 。 2 3样 品处理 称取 5 g ( 精确到 0 0 1 g ) 试样于 5 0 mL具塞塑料离心管中， 准确加入 0 1 mL内标工作液， 涡旋混合 3 0 S ， 加入 5 m L乙腈 ， 涡旋混合 3 0 S 后， 以4 5 0 0 r mi n离心 5 mi n ， 移取上清液至另一个具塞离心管中， 加入 2 0 m L磷酸盐缓冲溶液( O 1 m o l L， p H= 8 0 ) ， 涡旋混匀， 加入 0 5 mL 4 - I B B r的甲醇溶液( 5 m g mL ) ， 置于 4 0水浴中避光振荡衍生 2 h ； 取出 ， 冷却至室温后， 以 3 7 H C 1 调节 p H：3 0 + 0 1 ， 4 0 mL乙酸乙酯分两 次提取 ， 合并有机层 ， 3 5 q C 下旋转蒸发除去溶剂， 以 1 mL甲醇溶解残渣后 ， 加入 4 mL水 ， 待净化。 用 3 mL甲醇、 3 m L水活化 H L B固相萃取小柱 ， 将上述待净化液上样 ， 依次用 5 mL水 ， 5 m L 2 0 ( ) 甲醇淋洗并抽干 ， 4 m L 5 0 ( ) 甲醇一 乙腈洗脱 ， 收集洗脱液 ， 4 0下氮气浓缩至约 0 5 mL， 加 水定容至 1 0 m L， 经 0 2 2岬 滤膜过滤后 ， 供液相色谱 串联质谱分析 。 2 4 实 验条件 2 4 1 色谱条件P h e n o me n e x l u n a C 】 8 色谱柱 ( 1 5 0 n ll T l x 2 0 i r l n l ， 3 p m) ； 流速 ： 0 3 mL mi n ； 柱温 ： 3 5 ； 进样量 ： 1 0 ； 流动相 ： A相为 0 2甲酸 5 m mo l L乙酸铵溶液 ， B相为乙腈。梯度洗脱程序 ： 0 2 mi n ， 2 0B ； 2 4 mi n， 2 0 9 5 B； 45 mi n， 9 5 B ； 56 mi n ， 9 5 2 0 B； 6 1 0 mi n， 2 0B。 2 4 2 质谱条件电离模式 ： 电喷雾 电离正离子模式 ( E S I + ) ； 检测方式 ： 多反应监测 ( MR M) ； 电喷雾 电压( I S ) ：5 0 0 0 V， 气帘 气 ( C u r t a i n g a s ) ： 0 1 7 2 MP a ， 雾 化气 ( G a s 1 ) ：0 3 4 5 MP a ， 辅助 气 ( G a s 2 ) ： 0 3 4 5 MP a ， 离子源温度( T E M) ： 5 0 0 o C。其它条件见表 1 。 表 1 6种 T A s 及 D M T U保留时间和质谱参数 T a b l e 1 R e t e n t i o n t i m e s a n d m a s s s p e c t r o m e t r i c p a r a m e t e r s o f s i x t h y r o i d a n t a g o n i s t s ( T A s )and 5 ， 6 - d i m e t h y l - 2 一 t h i o u r a c i l ( D M T U ) ： Q u a n t i t a t i v e i o n 第 2期 邱元进 等 ： 液相色谱一 串联质谱 法测定牛奶 中 6种 甲状腺拮抗剂残 留 2 5 5 3 结果与讨 论 3 1 样品处理方法优化 本研究 以正交试验为基础 ， 对衍生溶液 p H值 、 提取液 p H值及洗脱溶剂选择等对实验结果影响较 大 的因素进行优化 ， 每个 因素选取 4个变量 ， 每个变量进行 3次平行实验 ， 所得结果以平均值计 ， 以同种 化合物的最大值作为 1 0 0 ， 计算各个化合物的相对 回收率并作 图。 牛奶中含有大量蛋 白质 ， 可能会对 目标物提取产生影响。本研究将 乙腈沉淀蛋 白后的上清液和未 处理的牛奶分别进行衍生化反应后 ， 按优化方法实验 ， 发现牛奶经蛋 白沉淀处理后 ， 6种 T As响应值均 有提高， 其中 P T u和 P h T U响应值提高约 1 0倍 。因此本研究选择 乙腈沉淀蛋 白后再进行衍生化处理 。 衍生化反应需在弱碱性条件下进行 ， 分别选取 p H为 7 5 ， 8 0 ，8 5和 9 0的磷酸盐缓冲液进行实验。 如图 1 所示 ， 在 p H= 8 0时， 6种化合物相对回收率均大于 8 0 。因此 ， 选择衍生化反应的最佳 p H值为 8 D 。 调节衍生化反应后的待提取溶液 p H值是一项关键性工作 ， p H值过低 ， 可能将杂质带人待净化溶 液 中； 而 p H值过高则可能不利于后续提取步骤 的进行。本研究将待提取液的 p H值分别调节至 1 0 ， 2 0 ， 3 0和 4 0进行实验 ， 如图 2所示 ， p H值变化对 MT U和 P T U相对 回收率影响较大 ， 宜选择 p H=3 0 为最佳平衡值。 8 糌 回 言 碍 匠 图 1 衍生化反应溶液 p H值对 T As 相对回收率的影响 图 2 待提取溶液 p H值对 T A s相对 回收率的影 响 ( n = 3 ) ( n = 3 ) F i g 1 I n fl u e n c e s o f p H o f d e ri v a t i v e s o l u t i o n o n T As r e l F i g 2 I n fl u e n c e s o f p H o f e x t r a c t e d s o l u ti o n o n T As r e l a a t i v e r e c o v e r i e s( n = 3 ) fi v e r e c o v e ri e s ( n = 3 ) 1 T AP； 2 TU； 3 M TU； 4 P TU； 5 P h T U； 6 M BI 1 T AP； 2 TU； 3 M T U； 4 P TU； 5 P h T U； 6 M BI 对 比了将衍生化后的溶液酸化处理后直接固相萃取柱净化和 乙酸 乙酯提取后净化发现 ， 若不以乙 酸乙酯提取 ， 直接 固相萃取柱净化 ， 甲巯咪唑衍生物回收率低于 2 0 ； 两种处理方式对其它 5种 目标物 的回收率几乎无差别。 待净化液经 Oa s i s HL B固相萃取小柱净化后 ， 需用洗脱溶剂将其洗脱 。实验表 明， 5 m L 甲醇很难 将极性稍弱的 P T u衍生物 P T u B I和 P h T U衍生物 P h T U B I 洗脱 ； 5 mL乙腈可完全洗脱 P T u B I ， 但 P h T U- B I 仅能洗脱 约 8 5 ； 而 5 mL 5 0 甲醇一 乙腈溶液可将 目标物完全洗脱 。由图 3可知 ， 1 m L 5 0 甲醇 乙腈溶液即可将 9 0 的 目标物洗脱 ， 4 mL 5 0 甲醇。 乙腈溶液可将 目标物完全洗脱 。 3 2 线性 方 程 、 方 法 灵敏度 及精 密 度 称取 5 g的阴性牛奶 ， 分别准确加入 1 0 0 k t L内标工作液 ， 0 ， 2 5 ， 5 0 ，1 0 0 ， 2 5 0和 5 0 0 g L混合标准 工作液 ， 按 2 _3节和 2 4节处理后 ， 即为 0 ， 5 ，1 0 ， 2 0 ， 5 0和 1 0 0 t g k g的校正标准溶液曲线。 在选定的实验条件下 ， 以峰面积( Y ) 为纵坐标 ， 质量浓度 ( ， g g k g ) 为横坐标作图。结果表 明， 6种 T As 峰面积与浓度在 51 0 0 t g k g范围均呈 良好 的线性关系 ， 相关系数 r 0 9 9 。以信噪 比 S N= 3作 为方法的检出限( L O D) ， S =1 0作为方法 的定量 限( L O Q) ， 得 出牛奶 中 6种 T As的 L O Ds 为 0 1 4 0 3 2 k t g k g ， L OQ s 为 0 4 81 1 g g k g ( 表 2 ) o 2 5 6 分 析 化 学 第 4 1 卷 表 2牛奶 中 6种 T A s 测定线性方程 、 相 关系数 、 检 出限 和定 量限 Ta bl e 2 Li n e a r e q ua t i on s ， c o r r e l a t i o n c oe ffic i e n t s ，l i mi t o f d e t e c t i o n s a nd l i mi t o f q u a nt i t a t i on s o f s ix TAs i n mi l k y ： p e a k a r e a ； ： l n a s s c o n c e n t T a t io n( p , g k g ) ； l i n e ar r a n g e ： 51 0 0 , g k g 8 斟 雹 0 1 2 3 4 5 洗脱溶液的体积V o lu mn s o f e l u t e s o l v e n t ( mL 1 图 3 6种 T As 及 内标物 D MT U的洗脱 曲线 图 Fi g 3 El ut i o n c u r v e s o f s i x TAs an d i nt e rna l s t a nd ard 以阴性牛奶为基质 ， 在 1 0， 2 0和 5 0 g k g的添 D MT U 加水平下进行添加回收实验， 每个水平平行测定6次 ， 平均 回收率在 8 2 8 1 1 3 6 之间， 相对标准偏 差 ( R S D) 在 2 4 1 4 3 之间， 符合残留分析的要求 ， 结果见表 3 。 表 3 牛奶 中 6种 T A s 的平均 回收率和相对标准偏差( R S D) T a b l e 3 A v e r a g e r e c o v e r i e s( 。 )and r e l a t i v e s t a n d a r d d e v i a t i o n s( R S D s )o f s i x T A s i n mi l k Co 怡 mp o 物 un 麓 s c m p。un ( g ) ( ) L ， 。 J 1 0 1 0 75 4 4 l 0 8 98 2 4 TAP 2 O 1 O1 -9 59 P TU 2 0 l 0 29 4 2 5 O 1 01 2 1 O 2 5 O 8 2 8 5 _5 l 0 9 7A 1 43 1 0 9 26 6 2 TU 2 O 1 01 7 5 8 P h TU 2 O l 1 36 5 4 5 0 98 -3 8 6 5 0 9 0 1 6 4 1 0 91 8 2 9 1 0 1 0 02 6 3 M U 2 O 8 9-3 6 1 MBI 2 0 1 0 3O 4-6 5 0 9 72 8 8 5 O 1 O 22 5 3 图 4为牛奶 中6种 T As 及 内标 D MT U的 MR M 色谱 图， 外标均为 1 0 t g k g ， 内标为 2 0 t g k g 。 3 3 实 际样 品分析 选取市场上销售的各品牌纯牛奶共计 1 1份 ， 以 阴性牛奶分别添加混合标准工作液至各 T As 浓度分 别为 0 ， 5 ， 1 0 ， 2 0 ， 5 0和 1 0 0 g k g ， 并将所有牛奶样 品加入 2 0 g k g内标后 ， 采用本方法进行分析检测 ， 其 中一份检出甲巯咪唑 ， 一份检出 2 - 巯基苯并咪唑 ， 检 出值均略低于下 限。 分析结果表 明， 本方法快速简便 、 灵敏度高 、 抗 干扰强 ， 满足兽药残留分析的要求 ， 可作为常规方法 对牛奶 中甲状腺拮抗剂进行 日常批量分析检测。 4 5 5 0 5 5 6 0 6 5 7 0 7 5 8 0 Re t e n t i o n t i me ( mi n ) 图 4 牛奶中添加 6种 T A s 及 D MT U的 MR M 色谱 图 F i g 4 M RM c h r o ma t o g r a ms o f mi lk s a mp l e s p i k e d wi t h s i x TAS an d i n t e r n a l s t a n dard DM TU Re f e r e ne e s 1 I n t e r n a t i o n a l A g e n c y f o r R e s e a r c h o n C a n c e r ， h t t p ： m o n o g r a p h s i a r c f r E N G C l a s s i fi c a t i o n i n d e x p h p 2 C o mm i s s i o n o f t h e E u r o p e a n C o m m u n i t i e s O f fic a l J o u r n a l o f t h e E u r o p e a n C o m mu n i t i e s ， 1 9 8 1 ， 8 1 6 0 2 E E C 3 R o s t k o ws k a H，S z c z e p a n i a k K，No w a k M J ，L e s z c z y n s k i J ，K u B u l a t K，P e r s o n W B A m C h e mS o c ，1 9 9 0， 1 1 2 ( 6 ) ： 2 1 4 7 2 1 6 0 第2期 邱元进等：液相色谱一 串联质谱法测定牛奶中6种甲状腺拮抗剂残留 2 5 7 B u i c k R K，B a r r y C ， T r a y n o r I M， Mc C a u g h e y W J ， E l l i o t t C T C h r o m a t o g r B， 1 9 9 8， 7 2 0 ( 1 ) ： 7 1 7 9 C h e i n o v y a n t s M S D o l i n k i n A OK h o k h l o v E V A n a 1 C h e m ， 2 0 0 9， 6 4 ( 8 ) ： 8 5 0 8 5 3 Va n d e n B u s s c b e J Va n h a e c k e L，De c e u n i n c k Y， Ve r h e y d e n K，Wi l l e K，B e k a e a K，L e B i z e c B，De B r a b a n d e r H F ， C h r o m a t o g r A， 2 0 1 0， 1 2 1 7 ( 2 6 ) ： 4 2 8 5 4 2 9 3 A b u i n S C e n t r i c h F ， R u b i e s A C o mp a n y o R， P r a t M D A n a 1 C h i m A c t a ， 2 0 0 8 ， 6 1 7 ( 1 ) ： 1 8 4 1 9 1 G B T 2 1 3 1 0 2 0 0 7 D e t e r m i n a t i o n o f R e s i d u e s of T h y r e o s t a t s i n F o o d s t u ffs of A n i ma l O r i g n C MS MS Me t h o d Na t i o n a l St a nd a r d s o f t he Pe o p l e s Re p ub l i c o f Chi n a G B T 2 1 3 1 0 2 0 0 7 动物源性食品中甲状腺拮抗剂残留量检测方法 高效液相色谱一 串联质谱法中国国家标准 Z o u Q H， L i u Y，X i e M X， H a n J i ， Z h a n g L A n a 1 C h i m A c t a ， 2 0 0 5， 5 5 1 ( 1 ) ：1 8 4 1 9 1 Z h a n g L ， “u Y， X i e M X， Q i u Y M C h r o m a t o g r A， 2 0 0 5 ，1 0 7 4 ( 1 ) ： 1 7 P i n e l G，B i c h o n E， P o u p o n n e a u K， Ma u me D， A n d r e F ，L e B i z e c B C h r o m a t o g r A， 2 0 0 5 ， 1 0 8 5 ( 2 ) ： 2 4 7 2 5 2 L o h m u s M，K a l l a s t e K， L e B i z e c B C h r o m a t o g r A， 2 0 0 9， 1 2 1 6 ( 4 6 ) ： 8 0 8 0 8 0 8 9 Va n d e n B u s s c h e J，Ki e b o o m J A L，D e C l e r c q N，D e c e u n i n c k Y，L e B i z e c B，De B r a b a n d e r H F，Va n h a e c k e LJ o u r n a l ofA g r i c u l t u r a l a n d F o o d C h e mi s t r y 2 0 1 1 5 9 ( 1 0 ) ： 5 7 8 6 5 7 9 2 C R L G u i d a n c e P a p e r ( 7 D e c e m b e r 2 0 0 7 ) ， h t t p ： w w w r i v m n l b i b l i o t h e e k d i g i t a a l d e p o t c r l g u i d a n c e 2 0 0 7 p d f De t e r mi n a t i o n o f S i x Th y r o i d Ant a g o n i s t s Re s i d ue s i n M i l k b y Li qu i d Chr o ma t o g r a ph y Ta nd e m M a s s S pe c t r o m e t r y Q I U Y u a n J i n ，L I N Y o n g H u i ， Y A N G F a n g ， Z H A N G Q i o n g ， S U Z h i J i a o ( F u j i a n E n t r y e x i t I n s p e c t i o n a n d Q u a r a n t i n e B u r e a u ， F u z h o u 3 5 0 0 0 1 ，C h i n a ) Abs t r a c t A l i q u i d c hr o ma t o g r a p h y t a n d e m ma s s s p e c t r o me t r i c me t h o d wa s e s t a b l i s he d f o r t h e d e t e r mi n a t i o n o f s i x t h y r o i d a n t a g o n i s t s r e s i d u e s i n mi l k i n c l ud i ng t a pa z o l e，2- t h i o u r a c i l ，6 - me t h y l - 2一 t h i o u r a c i l ，6- p r o p y l - 2一 t hi o u r a c i l ，6- p he n z y l - 2- t h i o u r a c i l a n d 2- me r c a p t o b e nz i mi d a z o l e Th e s u pe r n a t e o f s a mpl e wa s d e riv e d wi t h 4- i o d o b e n z y l b r o m i d e( 4 - I B B r )a t p H 8 0 fo r 2 h a f t e r p r o t e i n p r e c i p i t a t i o n b y a c e t o n i t r i l e T h e s o l u t i o n w a s t h e n c he c k e d t o pH =3 0 wi t h HC1 s o l u t i o n a n d e x t r a c t e d wi t h e t h y l a c e t a t e Afte r s o l v e n t e v a p o r a t i o n，r e s i d u e wa s d i s s o l v e d wi t h 2 0 me t h a n o l a q u e o u s P u r i fi c a t i o n wa s c a r r i e d o u t o n a n Oa s i s HLB c a r t rid g e，4 mL 5 0me t h a n o 1 a c e t o n i t r i l e s o l u t i o n wa s u s e d t o e l u t e Se p a r a t i o n s o f s i x a n t a g o n i s t s a n d i n t e r n a l s t a n d a r d we r e p e r f o r me d o n a L u n a C l 8 c o l u m n w i t h mo b i l e p h a s e c o n t a i n i n g a c e t o n i t r i l e a n d 0 2 ( )f o r m i c a c i d 5 mmo l fL a mmo n i u m a c e t a t e a q u e o u s s o l u t i o n i n a g r a d i e n t e l u t i o n mo d e Th e i d e nt i fic a t i o n a n d qu a