血清谷丙转氨酶.ppt

血清谷-丙转氨酶 (ALT)活性的测定,EXPERIMENT 4,（改良Mohun法）,实验目的,学习酶学基本原理 学习ALT活性的测定 酶学基本原理 一、酶活力 指酶催化化学反应的能力，也即酶催化某一化学反应的反应速度； 检查酶的存在用它催化的反应能不能发生来测定； 酶的活力易受到温度、PH、激活剂、抑制剂等因素影响，故测定酶活性时应保持环境因素稳定。,酶反应速度,VE测定的原理： 1、测定一定量的底物转 变成产物的时间； 2、测量单位时间内 底物的减少量S/t 产物的增加量P/t 注：测反应的初速度 （5%的SP的区域）,P,t,P/tv,或,测定方法,化学法 比色法 荧光法 NADH在340有蓝白色荧光，而NAD没有 电化学法 同位素法,二、酶活力单位及比活,酶的活力单位 U：特定条件下1min内将1mol底物转化为产物所需要的酶量。（国际单位） 临床可以用约定成熟的惯用单位表示。 比活 每毫克蛋白含有的E的活力单位数 U/mg蛋白 转换数 每秒每个酶分子转换底物的微摩尔数 mol/s,ALT活性测定的方法很多，主要有两类：一是卡门氏(Karman)分光光度法，二是比色测定法。,卡门氏(Karman)分光光度法的原理如下：,由于NADH在波长340nm处有特异的吸收峰，因此ALT的活性可通过NADH的消失量，即根据340nm处光密度值的减少量间接作出定量测定。ALT活性的K洲an氏单位的定义是：在分光光度法规定的条件(karman分光光度计，25，340nm，光径1km)下，1毫升血清每分钟使光密度值降低0.001时为1单位。这一方法特异性高，不受限制和干扰，因而准确性高。但是此法除加入ALT底物外，还需加人LDH和NADH，又需用分光光度计，因此不易为一般临床化验室推广。,比色测定法目前国内采用三种方法，即金氏法(King法)、穆氏法(Mohun法)和赖氏法(Reitman一Frankel法)。其原理完全相同。,此外，这三种方法中所用试剂、操作步骤及作用温度等均完全相同。不同之处在于作用时间：King法60min，Mohun法和ReitmanFrankel法30min。因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同。King法单位定义是：每100ml血清在37条件下与底物作用60min，生成1微克分子丙酮酸为1单位。Mohun法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37条件下与底物作用30min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。ReitmanFrankel法的单位是根据比色法所得光密度值与分光光度法作对比测定求得，因此其单位值与Karman单位相同。本实验采用Mohun法。,【试剂】,(1)500gml：精确称取丙酮酸钠(A.R)62.5mg溶于少量磷酸盐缓冲液(0.1molL，pH=7.4)中，转移至100ml容量瓶内，再以此缓冲液稀释至满刻度，混匀后贮存于冰箱。 (2)200gml：取(1)液40.0ml置100m1容量瓶中，以磷酸盐缓冲液(o.1molL，pH=7.4)稀释至刻度线，混匀后贮存于冰箱。,1标准丙酮酸液,上述(1)、(2)液均不宜久存，应临用前配制。,(1)0.1molL磷酸二氢钾溶液：称取KH2PO4(A.R)13.614g，用重蒸馏水溶解后转人1000ml容量瓶中，再用重蒸馏水定容至刻度，摇匀。 (2)O.1molL磷酸氢二钠溶液：称取无水Na2HPO4(A.R)14.196g，用重蒸馏水溶解后转入1 000ml容量瓶中，再用重蒸馏水定容至刻度，摇匀。,2磷酸盐缓冲液(0.1molL，pH=7.4),取(1)液2份与(2)液8份混合，即得0.1molL，pH=7.4的磷酸盐缓冲液。,3ALT底物液,精确称取-酮戊二酸29.2mg，DL-丙氨酸1.78g，用O.1moIL pH=7.4磷酸盐缓冲液50ml溶解后，再以磷酸盐缓冲液加至约80ml，再用1molL NaOH调至pH=7.4，然后加氯仿1ml防腐，最后以磷酸盐缓冲液定容至100ml，冰箱保存可用一周。若出现混浊则应弃之不用。,42,4一二硝基苯肼溶液,5.0.4mol/L NaoH,称取2,4-二硝基苯肼(A.R)100mg，加入约200ml 1molL HCI，加热使其溶解，冷却后再以1molL Hcl定容至500ml。此液贮于棕色瓶内，置冰箱保存可用半月。,【操作】,1制备标准曲线,取干燥洁净试管8支，编号，按表加入各试剂。,取干燥洁净试管9支，编号，在18号管中依次加入上述稀释的18号丙酮酸标准液0.1ml，在9号管中加人0.1molL，pH=7.4磷酸盐缓冲液0.1mI，再下表操作。,各管混匀，置37水浴保温20min，取出加0.4molL NaOH混匀，于lOmin后在30min内用520nm波长比色，用空白管(第9号管)调节零点，测定各管吸光度值。以各管吸光度值为纵坐标，各管中丙酮酸含量为横坐标，绘制标准曲线。,实际应用时，将测定管吸光度减去对照管吸光度，然后从标准曲线上查出其相应的丙酮酸含量(g)，代入公式计算：,2酶活性的测定,实验数据及结果 ALT（A1-A2）/（A3-A4）20/2.51/0.1 Mohun单位的定义： 每ml血清在37、PH7.4下与底物作用30min，每生成2.5g丙酮酸为1 Mohun单位。 (1)血清标本不宜溶血，且最好在采血之当日进行测定。 (2)在操作时应准确掌握E作用时间、温度及试剂的pH 。 (3)若所得吸光度读数超过标准曲线的直线部分，表示酶活性过高需将样品稀释后再行测定。,【注意事项】,临床意义,ALT主要分布于肝、肾细胞、心肌细胞等组织细胞内，血清中的含量很低，当病变使细胞膜通透性增高或细胞破坏时，则血清ALT含量明显升高。该项检验可作为疾病诊断和预后判断的指标之一。ALT显著增高见于各种急性期肝炎及药物中毒性肝细胞坏死，中等程度增高见于肝癌、肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞，低等程度增高见于阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。,实验讨论,为什么设定标准空白和测定空白？ E活性的表示方法有哪些？ E活性测定的原理是什么？,在终止酶反应后，呈色反应中不仅产物丙酮酸能与2，4-二硝基苯肼形成苯腙而呈色，而且底物-酮戊二酸也能反应而呈色，尽管二者在500520nm处光吸收有较大差异，但这种非特异性的呈色反应对测定结果影响较大，所以比色法使用的底物浓度很低，与最适底物浓度相差甚远。在两种底物浓度中尤显偏低的是-酮戊二酸（2mmol/L）,在此浓度下酶促反应只能达到最大反应速度65%左右，由于底物浓度的明显不足使的酶促反应产生丙酮酸的量与酶活性间不能呈现良好的线性关系。2，4-二硝基苯肼本身在碱性溶液中也能显色，为了降低空白读数，反应时不得不使用较低的2，4-二硝基苯肼（1mmol/L）,相当于反应液中酮酸的浓度（丙酮酸和-酮戊二酸总浓度为2mmol/L）的1/2。按反应方程式，一分子酮酸与一分子2，4-二硝基苯肼生成相应的苯腙，但至少有半量的酮酸没有与2，4-二硝基苯肼作用，在酶反应后丙酮酸和-酮戊二酸与2，4-二硝基苯肼形成苯腙呈色存在着一个人们无法控制的机率问题，据信这是赖氏法重复性差的主要原因。另外，2，4-二硝基苯肼浓度低也是使显色反应的工作曲线弯曲的原因之一。,赖氏法在终止酶反应后，呈色反应中不仅酶作用产物丙酮酸能与2，4-二硝基苯肼形成苯腙而呈色，而且底物-酮戊二酸也能与2，4-二硝基苯肼形成苯腙而呈色，尽管二者在500520nm处光吸收有较大差异，但这种呈色反应的非特异性对测定结果的影响是不可忽视的，所以赖氏法使用的底物浓度很低，与酶促反应的最适底物浓度相差甚远。在两种底物浓度中尤显偏低的是-酮戊二酸（2mmol/L）,在此浓度下，酶促反应只能达到最大反应速度65%左右，由于底物浓度的明显不足使的酶促反应产生丙酮酸的量与酶活性间不能呈现良好的线性关系。2，4-二硝基苯肼本身在碱性溶液中也能显色，为了降低空白读数，反应时不得不使用较低的2，4-二硝基苯肼（1mmol/L）,相当于反应液中酮酸的浓度（丙酮酸和-酮戊二