小型波长检测型表面等离子体共振分析仪的设计与研制.pdf

第 3 9 卷 2 0 1 1 年 l 0月 分析 化学 ( F E N X I H U A X UE ) 仪器装 置与实验技术 Chi n e s e J o u r n a l o f An a l yt i c a l Ch e mi s t r y 第 1 O 期 1 5 3 7 1 5 4 2 小型波长检测型表面等离子体共振分析仪的设计与研 制 孙 颖 曹彦 波 王 兴华 张寒琦 于爱 民 宋 大千 ( 吉林 大学 化学学院， 长春 1 3 0 0 1 2 ) 摘 要 小型波长检测型表面等离子体共振 ( S P R ) 分析仪采 用固定光的入射角， 监测 共振波长 变化的测量模 式， 可进行多波长 同时测量 。设计并组装 了 S P R分析仪 中的微型光 纤光谱 仪， 采用 光导纤 维输入被 测光， 固 定 全息衍射光栅分光， 线阵 C C D光 电传感器检测， 可检测 的波长范 围是 5 0 0 -9 0 0 n m , 分辨率 0 2 3 n m。 自行 编 制了控制传感器数据采集和处理 的计算机 软件， 采 用信号 强度对 波长 ( 实 际谱 图中的横 纵坐标 ) 收 集实验 数 据 。S P R分析仪不仅小型化， 且具有 良好 的分析性 能， 可用于定量分析生 物分 子间相互 作用的研究， 对人免疫 球 蛋 白( I g G ) 进行 了实 时检测， 采用 3 种 不同的方法所得到人 I g G的最低 浓度 达到 0 1 5 mg L ， 并对仪器 的稳定 性 、 样 品的生物 活性 等因素进行了考察 。 关键词 表面等离子体共振 ；微型光纤光谱仪 ；波长检测型 1 引 言 表面等离子体共振( S P R ) 是入射光在两相界面处发生全 内反射时 的消失波， 可以引发金属表面 的 自由电子产生表面等离子体子_ 10 。在入射角或波长为某一适 当值 的条件下， 表面等离子体子与消失波 的频率 和波数相等， 二者将发生共振， 入射光被吸收， 使反射光强度急剧下降， 在反射光谱上反射光强度 最低点所对应的波长为共振波长 。当金属薄膜表面介质折射率不 同时， 共振波长也不同_ 3 。 目前 ， 应 用 的 S P R商 品仪 器基 本是 角度 调制 型， 测量 的角 度范 围有 限， 仪 器本 身也 比较 昂贵 。本 研究基于光栅有 的高光谱分辨率和光纤的高光传输能力， 且采用光纤可使仪器的设计更加方便， 构型更 加紧凑， 宜于仪器的小型化， 成功研制了多波长 同时检测型 S P R分析仪 。本仪器体积小， 重量轻， 波长 范 围很 宽， 可 用于 定量 分析 ， 特别适 于 分子 间相互 作 用 叫 、 生 物 分子 与 药 物分 子相 互 作用 l_ l仉 1 门 的研 究 。 设计并组装了与 S P R分析仪相匹配的检测器微型光纤光谱仪， 采用光导纤维输入被测光， 固定全 息衍射光栅分光， 线阵 C C D光 电传感器检测 。本仪器既可以应用于 S P R仪器作为检测单元， 也可以应 用 于其 它 光谱分 析 领域 。 2 S P R分析仪的设计 与研 制 2 1仪器 结构 多波长同时检测型 S P R分析仪如图 1 a 所示， 仪器由光源、 导光系统、 S P R传感元件 、 流通池 、 微型光 纤光谱仪和数据处理系统组成 。选用卤钨灯作为光源， 从光源发 出的白色光经过由 2 个 透镜和 1 个偏 振 片构 成 的平行 偏振 光管 后 变成平 行偏 振光 ， 通 过平 行偏 振光 管 的 出射 端狭 缝， 以一定 的角 度 照射到 棱 镜 的侧 面上 ， 经折 射后 光线 到达 棱镜 的底 部 ( 预先 用 S n e l l 定 律计 算 出保 证 光线 在 此界 面 发 生全 内反 射 的入射 角度 ) ， 底部 的外 侧镀 一层 5 0 n m厚 的金 属 薄膜 ， 流通 池 密封 在 其上 面 。光 线 在棱 镜 与金 属 的界 面处发生全 内反射， 然后从棱镜的另一个侧面折射出去， 通过下一个透镜聚焦耦合进入微型光纤光谱仪 进行分光检测。波长检测型 S P R分析仪可 以实现多波长 同时检测， 且检测 的波长范围不受限制， 这样 不仅使传感器表面被检测物质量的范围不受 限制， 即折射率变化的范围不受限制， 而且非常有益于生物 分子与药物分子 、 分子与组织( 如细胞) 间相互的作用的研究。 自行 设计并组装 的波长检 测型 S P R分析仪 如 图 1 b所示， 仪 器 的外 型尺寸为 4 2 c mX 3 2 c mX 1 3 c m。 2 0 1 1 0 6 - 3 0 收稿 ； 2 0 1 1 一 O 8 2 0接受 本文系 国家 自然科学基金委仪器专项重点项 目( No 2 0 7 2 7 0 0 3 ) ， 国家 自然科学基金项 目( No 2 1 0 7 5 0 4 9 ) ， 教育部新世纪优秀人 才资助项 目 ( N o NE C T - 1 0 - 0 4 4 3 ) 和吉林省科技发展计划项 目( No 2 0 1 1 0 1 6 2 ) 资助 *E - ma i l ： s o n g d q j l u e d u c n 分 析 化 学 第 3 9卷 2 2光 源 F l 。w 采 用 固定波 长 、 改 变 入 射 角 为 测 量 方 式 的 S P R 仪 器和装 置 多采用 He Ne 激光 器 ( A 一6 3 2 8 n m) 做光L i 源 。发光二极管 ( L E D) 也被用作 S P R的光源， 波长 多选 择 为 7 6 0 n m。对 于 波 长 检 测 型 S P R传 感 装 置， 最理 想 的光源应 是 可 以发 射各 种波 长 光 的连续 光 源， b 而且 强度 不 随 波长 而 改 变， 并 具 有 足 够 的强 度 和 稳 定性 ， 但 实 际 上很 难 找 到 这 种 光 源 。在 各 种 连 续 光 源 中， 白炽灯 光源 是最廉 价 易得 的， 并 且 具 有足 够 稳 定 的发 光 强度， 其 中， 卤钨灯 就很 适于 做 S P R研 究 的 膜 。加 工 了 3种不 同牌号 ( 中 国) 的棱 镜，T a b l e 1 T y p e s a n d r e f r a c t i v e i n d i c e s o f o p t i c a l g l a s s s t u d i e d 其 相近 折射 率 光 学 材 料 的牌 号 和折 射 率 值对 照见 表 1 。 从 耐用 的角 度 考虑 ， 选 用 K 9光 学 玻 璃 做为 棱镜 材 料 。棱 镜 的形 状 为 半 球 形 时 最 理 想 ， 它 可 以保 证 与 半 球 形 底 面成 0 1 8 0 。 角 的入射光线均与界面垂直， 反射光的损失小， 且进入棱镜后光线的角度不变， 但半球形 的棱镜 加工费用较高 。本研究选择容易制作的直角等腰三角形棱镜， 其边长尺寸为 2 7 c m1 7 c mX 1 7 c m。 许多金属都可以作为 S P R传感元件 的金属膜， 而金和银是两种应用较普遍的金属， 并且银膜的灵 敏度 高于 金膜 。表 2 列 出了金和 银作 为 S P R传 感 部位 金 属膜 的性 能 比较 。两 种 金 属 膜 在使 用 过 程 中 各有特点。金膜的优点是稳定性好， 不易氧化； 与玻璃的粘接性好， 不易脱落； 不与反应体系中的各种无 机离子发生反应， 从而不影响生物体系的测定结果 。金膜的缺点是价格略高， 灵敏度稍差。银膜的优点 是灵敏度高， 价格低 ； 缺点是与玻璃的粘着性不好， 易脱落 ； 溶解生物样品的缓 冲溶液基本为磷酸盐缓冲 液( P B S ) ， 其中含有无机离子 c r， 而过多的 c 1 一 会损害银膜 。因此， 对于大多数生物体系的 S P R研究， 不宜选择银膜作为基底传感膜。 分 析 化 学 第 3 9卷 与暗 电压之 比) 分 别 为 3 0 0和 3 3 3 ； 采 用美 国 An a l o g D e v i c e s ( 模 拟 器件 ) 公 司生产 的 AD 9 2 2 0型 A D转 换 器作为电子器件， 其最大转换速率为每秒 1 0 M 次， 转换精度为 1 2位并具有溢 出指示功能， 最大功耗低 于 2 5 0 m W ； 采 用 美 国 A t me l ( 爱 特 梅 尔 ) 公 司 生 产 的 A T 9 1 S A M7 S 6 4型 微 处 理 器，该 处 理 器 采 用 A R M7 T D MI 处理器核心， 高性能 3 2位精简指令集架构， 具有低性能 功耗 比和嵌入式电路仿真功能， 运 行 频率 可达 5 5 MH z ， 并 且具 有 U S B 2 0 全 速 接 口和大量 其它 接 口。 微 型光纤 光谱 仪采 用 紧凑 的 C z e r n y - T u r n e r 光 路设 计 以减 小光 学 平 台 尺寸 。入射 光 由一 个标 准 的 S MA9 0 5 光纤接 口进入光学平台， 经球面反射镜 1 准直， 然后由平面光栅分光， 经由球面反射镜 2聚焦到 线 阵 C C D检测 器上 。 微型光纤光谱仪的电学设计 目标是低功耗 、 稳定可靠和抗干扰 能力强。在电学设计时采用 了以下 方式 ： ( 1 ) 电路 中的强 、 弱 电和交 、 直流 电分 开走线 ， 以避 免彼 此 问 的干 扰 ； ( 2 ) 各 芯 片 的电源 电路 中均 加 入滤 波 电容进 行滤 波 ； ( 3 ) 采 用质 量优 良的元器件 。 微型光纤光谱仪的外壳和内部光学底座拟采用铸铝材料铸造成型， 光学部件与电学器件分腔放置。 在光 学 腔 中， 分 光器件 和线 阵 C C D检 测器 被牢 固地 固定在 光学 底座 上， 腔 内无 任何 其它 电子元 件 ； 所有 的 电路和 电学 器件被 隔离 在 电学腔 中 。这 样， 既 提 高 了光 学系统 的稳 定性 和 电学系统 的抗 干扰 能力， 又 使光 学部件 和 电学器 件 的调试过 程互 不干 扰 。 微型光纤光谱仪采用的是嵌入式系统 固件设计， 嵌入式系统固件的主要功能有 ： ( 1 ) 通过处理器的 多个 I O端 口控 制仪 器 的各 种逻 辑状 态 ； ( 2 ) 通 过处 理器 的地址 线 和数据 线读 取 A D转 换 器转 换 出 的数 字信号， 并进行一定的预处理( 如判断是否溢出等) ； ( 3 ) 通过微处理器的 U S B接 口接受 P C机发出的命 令， 并向 P C机传送光谱数据 ； ( 4 ) 通过仪器跳线的设置判断并启动 自升级功能。 2 6数据 处理 系统 自行编制了控制传感器数据采集和处理的计算机软件， 采用信号强度对波长( 实际谱图中的横纵坐 标 ) 收 集实验 数据 。计 算机 程序从 数据 采集 卡端 口读 取信 号 强度， 一 定 时 间 间隔 内读 取多 次， 以平 均值 作为强度值， 由多个数据点组成一副谱图。利用控制软件在谱图上选择一个可用的数据范围， 在数据范 围内对横纵坐标的数值进行六次多项式拟合， 以拟合结果和实际数据点的相对标准偏差最小 为拟合终 点， 从 而 可以得 到一个 六 次 曲线 函数 。接着 ， 计算机 程序对 该 函数进 行求 导数 处理， 得到 一 个五 次 函数， 这时令函数中 y一0 ， 就可以得到一个五次方程， 求得的 x值就是得到六次拟合函数取极值 ( 一定区间 范围内的最大值 、 最小值) 时对应的横坐标。采用二分法可 以对该五次方程进行求解， 以两次二分值 的 差 值 和二者平 均值 的比值 小 于 l 0 为 求 解 终 点 。将 这 个 值代 人 拟合 得 到 的六 次 函数， 可 求 得 纵 坐标 值 。如果 该 函数有 多个 极值， 可 采用 多段 区间分别 求 解 的方 法逐 个 得到 极 值 的坐 标 。这样 就 可 以得 到 实验 所需 的最 低点及 其对 应 的强度值 。 3结果与讨论 3 1人 I g G的检 测 分别采用金膜以及 A u纳米粒子和 A u A g合金纳米粒子修饰的金膜作为传感器的基底膜， 检测人 I g G与其抗体 的结合。在室温下， 首先通过共价结合将兔抗人 I g G固定在生物传感 器的表面， 再将 P B S 缓冲溶液稀释的不同浓度的人 I g G分别加入到流通池中， 使抗原能够与 固定在生物传感器表面的抗体 结合 。抗原 与 固定在 表 面的抗 体结合 的量 可 由共 振 波长 的变化 测得 。 在室温下， 兔抗人 I g G连接在生物传感器表面以后， 不同浓度的人 I g G分别注入到流通池 中， 实时 记 录 由于抗 体一 抗原 免疫 反应所 引起 共振 波 长 的变 化 。 图 3 显 示 了共 振 波 长 变化 与 人 I g G浓 度 之 间 的 关系。基于 Au 膜的传感器检测到人 I g G的浓度范围是 1 2 5 2 0 0 m g L； 基 于 Au纳米粒子修饰的传感 器所检测到人 I g G的浓度范围是 0 3 0 2 0 0 mg L ； 基于 A u A g合金纳米粒子 的传感 器所检测到人 I g G 的浓度范围是 0 1 5 4 0 0 mg L。以上实验结果表明纳米粒子在修饰 S P R传感器中具有的显著优势 。 3 2仪器 的稳定 性 为了测试传感膜的稳定性， 多次对于 同一浓度的 I g G与其抗体 的免疫结合进行检测。若传感器金 第 1 0 期 孙 颖 等 ： 小型波长检测 型表面等离子体共振分析仪 的设计与研制 1 5 4 1 膜表面未固定抗体时， 共振波长为 ， 固定抗体后， 共 振 波 长为 。 ， 。 一 即为 固定 抗 体 的最 大位 移 值 。 以此固定抗体 的传感器用 于检测抗 原， 检测一定次 数 后， 将 抗 原 洗 脱，此 时 共 振 波 长 为 ， 位 移 值 为 A ； t i i -A ， ( A 2 一A A i ) A 2 1 0 0 即为传感膜稳定性 变 化 的百分 率 。实 验 结 果 表 明， 在 对 人 I g G 进 行 检 测 的 2 4 h内， 固定在 传 感膜 上 的抗 体有 少 量 的流 失， 稳 定 性约 降低 2 。检 测持 续 4 d后 ， 传 感 膜 的稳 定 性 约 降低 4 。 随着 时 间 的 推 移， 传 感 膜 活 性 降 低， 主要是 由于在 检测 过 程 中缓 冲 溶 液将 少 部 分 的抗 体 冲掉 而造成 的 。 同时， 生 物 试 剂 自身 的 活 性 也 会 随 时 间的推移 而 略有 下 降， 但 这 些 因 素对 于 检 测 的影 响可 忽略不 计 。 3 3 小结 研 制 了 以固 定 入 射 光 角 度， 监 测 共 振 波 长 变 化 为操作 模 式 的 S P R 分 析 仪， 仪 器 结 构 简 单 、 造 价 适 中 、 宜 于普 及， 特别 适 于 分子 问相 互作 用 的研 究 。应 图 3 共振波长变化 与人 I g G浓度 的关系 曲线 ( a ) 基 于 A u A g 合金 纳米 粒子的传 感器 ； ( b )基 于 A u 纳米粒 子修饰的传感器 ； ( c )基于金膜 的传感器 F i g 3 Re l a t i o ns h i p be t we e n t he s h i Rs o f r e s o na nt wa ve l e n g t h a n d c o nc e n t r a t i o n s of h u ma n l g G( a )t h e bi o s e ns o r ba s e d o n Au Ag a l l o y n a n o c o mp os i t e s ；( b) t he bi o s e ns o r b a s e d o n Au n a no p a r t i c l e s ；( c )t he bi os e ns o r b a s e d o n Au 61 m 用 S P R技术 生 物样 品无 需 标 记， 且 具 有 能 实 时监 测 反应 动 态 过 程 、 灵 敏 度 较 高 、 无 背景 干 扰 等 特 点 。 S P R分析仪的研制对 S P R方法和仪器的发展及应用具有一定意义。 Re f e F e nc e s 1 Ho mo l a J ，Ye e S S，Oa u g l i t z GS e n s o r s a n d Ac t u a t o r s B，1 9 9 9，5 4 ( 1 - 2 ) ：31 5 2 C HE N J i a E r( 陈佳 洱 ) Pl a s mo n P h y s i c s ( 等 离子 体 子 物理 学 ) B e i j i n g ( 北 京 ) ：S c i e n c e P r e s s( 科学 出版 社 ) ， 1 99 4：1 2 O Sa l a mo n Z，Angu s M a c l e od H ，Tol l i n GBi o c hi mBi o ph ys Ac t a，1 99 7，1 3 31( 2)：1 1 7 1 29 Go p i n a t h S C BS e n s o r s a n d Ac t u a t o r s B ，2 0 1 0，1 5 0 ( 2 )：7 2 2 7 3 3 Ab d i c h e Y N，Ma l a s h o c k D S，Pi n k e r t o n A，P o n s J An a 1 Bi o c h e m，2 0 0 9，3 8 6 ( 2 )：1 7 2 1 8 O Li u X，S o n g D，Z h a n g Q，Ti a n Y，Di n g L，Z h a n g Ho Tr AC，Tr e n d s An a 1 C h e m，2 0 0 5，2 4 ( 1 0 ) ：8 8 7 8 9 3 Su n Y ，Bai Y ，So ng D ，Li X ，W a ng L，Zha n g HBi o s e ns Bi o e l e c t r o n，2 00 7，4( 23)：47 3 47 8 Wa n g I ，S u n Y，W a n g J，Wa n g J ，Yu A，Zh a n g H，S o n g DCo l l o i d s S u r f ，B，2 0 1 1 ，8 4 ( 2 ) ：4 8 4 4 9 0 I U S h a o W u，J I N We i ，ZHANG Yi n g，GAO Ya n g，ZOU Xi a n g Yu，LI Mi n g，M U Yi n g，YAN Ga n g L i n，LUO G u i Mi n ， J I N Q i n Ha n( 吕绍武 ， 金 伟 ，张 莹 ， 高 杨 ， 邹 向宇 ， 李 明， 牟 颖 ，阎岗林 ， 罗贵 民，金钦 汉) C h i n e s e ， An a 1 C h e m ( 分 析 化 学 ) ，2 0 0 8，3 6 ( 2 ) ：2 1 1 2 l 4 L i u X，S o n g D，Z h a n g Q，Ti a n Y，Li u Z，Z h a n g HS e n s o r s a n d Ac t u a t o r s B，2 0 0 6，l 1 7 ( 1 )：1 8 8 1 9 5 L I U Xi a ， S UN Yi n g ， S ONG D a Qi a n ， TI AN Y u a n ， Z HANG Ha n - Qi ， HE Ya n ( 刘 霞 ，孙 颖 ， 宋大 干 ，田 媛 ，张 寒琦 ， 何 彦 ) Ac t a C h i mi c a S i n i c a ( 化 学学报 ) ， 2 0 0 7 ，6 5 ： 2 5 4 4 2 5 4 8 De s i g n a n d De v e l o p m e nt o f M i n i a t u r i z e d W a v e l e ng t h M o du l a t i o n S u r f a c e Pl a s m o n Re s o na nc e An a l y z e r S UN Yi n g，CAO Ya n B o，W ANG Xi n g Hu a ，Z HANG Ha n - Qi ，YU Ai Mi n。S ONG Da Qi a n ( C o l l e g e o f Ch e mi s t r y，J i l i n Un i v e r s i t y，C h a n g c h u n 1 3 0 0 1 2 ) Ab s t r a c t A m i ni a t u r i z e d mul t i wa v e l e n gt h m o du l a t i o n s u r f a c e pl a s m o n r e s o na nc e ( SPR) a na l y z e r was de v e l o pe d by o ur l a b or a t or y The i n c i d e n t a ng l e o f l i gh t wa s f i xe d a nd t he c ha n ge i n t he r e s o na nt u I u q 3 4 5 6 7 8 9 O l l 5 4 2 分 析 化 学 第 3 9 卷 wa v e l e ng t h wa s r e a l t i me m o ni t o r e d Th e m ul t i wa v e l e n gt h me a s ur e m e n t c a n be p e r f o r m e d The mi n o r o p t i c f i b e r s p e c t r o me t e r wa s d e s i g n e d a n d d e v e l o p e d Th e t e s t l i g h t wa s i n p u t u s i n g o p t i c a l f i be r；t he ho l o gr a p hi c di f f r a c t i o n g r a t i n g wa s f i xe d f o r s pe c t r o p ho t o m e t r i c；l i ne a r CCD op t i c a l s e D s o r wa s u s e d f o r de t e c t i o nThe wa ve l e ng t h r a ng e t ha t c a n b e d e t e c t e d i s 5 0 0 9 0 0 nm a nd t he r e s o l ut i o n i s 0 2 3 nm The c o m p ut e r s of t wa r e of c on t r o l s e ns o r d a t a a c q ui s i t i on a nd p r oc e s s i n g we r e s e l f - d e v e l o p e dThe e x p e r i m e nt a l da t a we r e c o l l e c t e d wi t h t he s i gn a l s t r e n g t h t o t he wa v e l e n gt h ( t he a c t u a l s pe c t r u m of ho r i z o nt a l a n d v e r t i c a l c o or d i na t e s ) The SPR a na l yz e r i s n o t on l y s ma l 1 ， bu t a l s o ha s go o d a n a l yt i c a l p e r f o r m a n c e f o r q u a nt i t a t i v e a n a l ys i s o f b i o m o l e c u l a r i n t e r a c t i on s t u di e s The huma n i mmu n o g l o b u l i n ( I g G)wa s d e t e c t e d i n r e a l t i me W i t h t h r e e d i f f e r e n t me t h o d s ，t h e l o we s t c o n c e n t r a t i o n o f 0 1 5 mg m L o f h u ma n I g G t h a t c a n b e d e t e c t e d Me a n wh i l e ，t h e s t a b i l i t y o f t h e i n s t r u me n t ， t he e f f e c t o n s a mpl e b i ol o g i c a l a c t i vi t y a n d ot he r f a c t o r s we r e a l s o s t u di e d Ke y wo r d s Su r f a c e pl a s m o n r e s o na nc e a n a l y z e r；M i no r o pt i c f i be r s pe c t r o m e t e r ；W a ve l e n gt h mo dul a t i on ( Re c e i v e d 3 0 J u ne 2 01 1 ；a c c e p t e d 2 0 Au g u s t 2 0 1 1 ) 分析测试学报 2 0 1 2年征订启 事 欢迎 订 阅 欢迎 投稿 欢迎 刊登 广告 国内刊号 ： C N 4 4 1 3 1 8 TH 国际标准 刊号 ：I S S N 1 0 0 4 4 9 5 7 国际刊名化代码 C O D E N： F C E XE S 邮发代号 ： 4 6 1 0