免疫磁珠阴性选择法检测非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞.doc

中国协和医科大学（北京协和医学院）博士学位论文免疫磁珠阴性选择法检测非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞姓名：朱一鸣申请学位级别：博士专业：临床医学指导教师：李泽坚;郭惠琴20070101 摘感性不高在内的几个缺点。本研究拟探索一种新方法的可行性，即免材料与方法选取瘤细胞是可行的方法。免疫磁珠阴性选择法富集肺癌细胞的回收率约 关键词循环肿瘤细胞免疫磁珠免疫细胞化学非小细胞肺癌 瓵 甪 ，猳，浚琣瑆 琻琻 瓵 再，是指存在于患者血液循环中的肿瘤细胞。关于募窃刈钤绯鱿衷，、逆转录多聚酶链式反应現渲校琁是目前目前国际上对于拿粕胁煌骋唬缬行咴谖恼轮惺褂肅也煌浦涞囊庖宄幸恍畋穑热鏘即“游离肿瘤细胞”，不但包括血液循环系统中存 和计数方面的可靠性比椒吆芏啵隝方法相比具有自动化程度高的优点，但是它不能提供细胞形态学方面的信息，而且敏感 樵洞R频幕颊咴蟾硪环矫妫琁期非小细胞肺癌颊呷杂谐年内复发，且复本研究旨在探索一种新的针对腃检测方法，选取北京协和医院可手术：细胞肺癌患者作为研究对象，利用购陀獗昙堑腃雇齀法鉴定送猓狙芯炕雇齋试验测试了该方法的敏感性。 主要实验试剂珹狢单抗，咎峁一，牛血清白，甇琀;旌弦宁波新芝琀一脚踏式负压吸引器虾接梦鞒，荧光显微镜珿一疪，条形磁力架和桶形 电热恒温水浴箱一憬嘁狄潜矶，计移液管，离心管，载玻片与盖玻片，蚊式镊，蜡笔，占位待查患者有部分血样在术中实体上取自病变肺叶的肺静脉。 以及固定细胞。 将真空采血管内的血样转入新的干燥离心管中，记录 清至崆嵴鸬蠢胄墓苁钩恋硇【龋苤行邪紫赴剖蚶胄墓苤屑覣液至。洗涤完毕，用加样枪将磁珠全部移入离心管中，将离 管中加入潭将载玻片置于的谙赴洗蚩滓岳谌旧两胂赴，再置于室内操作。将稀释孵育后，载玻片用疨溶液漂蜗次，再加 诒瓯厩巧细遣琁微镜下，显蓝色，显绿色，显红酥时却笥，光镜下可见完整的细 既肴胱榛颊呋咀柿虾虲检测结 笛槎韵蠡咀柿表琓例，琋琋例，琁 霞瑟愆辩蛾震篓震鬻麓鬟嚣鬻震瑟瑟鬻麓戮鬟黧瀚岁恶性肿瘤鬣黧篓瑟黉砖撼嚣蓊震震黧麓麓缀缀覆黧戮篱蒸鍪鬟霪蓊麓霪鬟薹鬣：鳞鹾鬻蓊蒸麓震戮黧鬻嚣鬣震黧黧篱鬻鳞麟戮黧瀚震鬻蚕构蛾嚣露鬟笺黧鬟嚣鬈翟翟鬈嚣戮薹弘至溺 数量恶性舯瘤爹霪鍪黔黪恶性肿瘤 中肺时标本血；箭头所指细跑显示，患者女性斡岁病理为错构瘤，覆良性病变可以含套上皮成分，样本为术中肺时标本区； 细隐属于含有上皮成分的细胞但错构瘤说明：良性病变术中血样觳庋粜月实哟吮砜淳捍，但是良性病变术中血样 矸制谟胧踔醒Q鵆检测结果篓霪 ，砝嘈陀胧踔醒Q鵆检测结果病理类型鳞癌羹霪混合型癌用非参数检验之列联表的精确检验法，对鳞癌和腺癌的差异性进行检甋试验结果 影响。用软件进行统计分析。描述性统计见表。表驹小时内进行检测时，不同条件之间下的回收率与磁珠孵育前与磁珠孵育前垂詈。墨们霞率曲线形态很近似，峰值鄂回收率出现的高频段在钓铷左右；扶曲 与磁珠孵育前露纂篾滋绷叠鬣羹鬟鬈函。礴盈荔墓鬈譬酾。颤蒌鬣薹薹懑总计数。左锇半边显示在实验西始时郎加入靶细胞瞬获德的回收率右俩半边为在磁珠孵育前拥入靶细跑爨获得的回收率，在实验开始时蕊入和磁珠褥育前加入耩做出的靶镪瞻的回收率一频率酋线形态摄近似，峰值即回收率出现的高频段。均在左右，而频率的峰值也均处于比较接近；扶益线的走势来看都较眼扶正态分布，综上扶酉象上直观观察，在实验开始融加入靶细瞻与磁珠孵育翦加入靶细胞对靶细胞的回收率的分布影响并不很明显， 一霉瞄双因素固定模型分析结果：异，因此样本贮存时间在小时的情况下对回收率无显著影响。 靶细胞的回收率没有显著影响，不具交互作用。讨另一部分是检测，也包括血中游离和细胞内，但以、杂交为主要手段。亚细胞水平检测的优点是敏感性高，这与其检测手段是泄兀琍能够将微量信息迅速放大，但是随之而来的问题是特异性不高。杂质带来的干扰、基因的非法转录、修饰后假基因的干扰以及扩增中非特异性标记物的使用会造成假阳性，而肿瘤细胞的异质性可导致假阴性结果。由于这些因素影响，在亚细胞水平检测到的结果并不能真正反映肿瘤患者体内肿瘤的微观状态，因为肿瘤的行为都是以细胞为基础的。例如，肿瘤细胞破裂后释放入血中的而恰有可能是患者接受化疗，肿瘤细胞被杀死的结果。另一方面， 琁，其然后利用磁场分离磁珠，这样可以去除血样中的绝大部分白细胞， 免了肿瘤异质性对富集敏感性的影响。而且，由于富集过程中没有抗原抗体反应触动肿瘤细胞，不会激活肿瘤细胞的信号传导，所以经过富集过程后肿瘤细胞的特性不会发生变化，有利于得到肿瘤细胞后进行多种下游应用。由此看来，该方法的敏感性和特异性应该相比更好，而且应用前景也更广泛。并不影响募剖牵齋试验发现，该方法富集魑狢的标记物，用为基础的综合鉴定法。我们选用 同标记。特异性染细胞核，在荧光显微镜下呈蓝色，这样可，因而会与一结合，在荧光显微镜下 验，而是为了与病理相互补充，更好地判断患者的病情。率很低，其原因可能有以下几个方面：性的，只有在某些特定的时刻或者某些特定的事件触发下才会发 周血样检测难粜月士赡芑岷艿汀L岣逤的检出率，可以通过多时间点分次采血，或者扩大采取血样的体积的方法。 与肿瘤的分期、病理类型、患者的特点等有关：由于目前斐雎首畹停嘉伟检出率比较低，可能 和齀 管上皮样肉瘤阳性是否因为该种肉瘤细胞可以表达目前我们尚不清楚。试验中，靶细胞数小时和小时检测的靶细胞回收率分布峰值所对应的回收率 研究不同步骤加入靶细胞对于回收率的影响，其目的是探讨在回收率约为左右，亦即整个富集过程中丢失了靶细胞的左右，主要发生在于免疫磁珠去除白细胞的过程中。进一步分析，最有可能丢失的步骤是在磁场中分离磁珠的过程。我们用的是桶形磁力架，将离心管置入其中央后，离心管中的磁珠在磁场作用下向管壁运动至贴壁，这个过程是比较快的，约数十秒钟即可完成。在大量磁珠带着结合的白细胞向管壁运动的过程中，很有可能把体积较大的肿瘤细胞一起带走，而导致靶细胞丢失。因此，在磁场中分离免疫磁珠时，进一步稀释离心管中样本悬浊液的浓度可能能在一定程度上减少靶细胞丢失。当然，在样本与免疫磁珠孵育的过程中，在垂直混合仪上的翻滚混匀也有可能造成靶细胞丢失。 还有很多值得改进之处，因此该方法的敏感性有显著提高的可能 小结免疫磁珠阴性选择法富集结合免疫细胞化学法鉴定检测 瓵 琓 瓺甕 ；：珽 琇琙 猻瓺珿甌 ；猻： 琑珻疭 一、微转移的分子标志物由于癌是上皮组织肿瘤，故而癌细胞具有上皮组织特异性蛋白，基因， 目前多选择敏感性和特异性均比较高的监测方法，或联合几种方免疫组织化学技术 魇较赴际流式细胞技术可用于定量测定肿瘤细胞数目，快速而准确，常用因此，对于肿瘤细胞含量很少的样本，现多采用免疫磁性技术，将细上皮肿瘤抗体拇胖楦患疦患者外周血中的肿瘤细胞， 预后价值俊扔肅和寺】固蹇笴腎法胸膜腔内微转移指在常规检查未发现胸膜渗出液，但在术中胸膜腔灌洗液中发现有肿瘤细胞。等对例行手术切除的颊呓行啬还嘞匆褐琢鱿赴觳椋琁期患者阳性，诨颊阳性，且结果阳性的患者生存期明显较短，说明灌洗液肿瘤细胞阳性的患者预后较差，研究者认为应该提高其肿瘤分 参考文献甋；： 甌 ；猻 篠 ；：猻琎； 甇 甇齂巧琋 琓 甁 ；琋刀琩甆 循环肿瘤细胞检测的意义与外周血循环肿宰R最大直径胞团是否与血管壁或淋巴窦壁接触或组织，停留并定殖于此，即穿透血管壁或淋巴管壁并在局部在局部 在肝脏微循环中存活并“外渗”创秆9鼙诨蜓q急诮敫巫橹，定于两个因素，即单个瘤细胞能否启动生长，以及微转移灶能否继续循环中的破坏以及“外渗”失败并不是转移失败的主要原因，因为到 二、外周血循环肿瘤细胞的检测方法 密度梯度离心是一种常用的分离细胞的方法，但是该方法特异性较差，肿瘤细胞也可能丢失。相比之下，免疫磁性分离技术则具有高作为载体的免疫磁珠表面偶联特定抗体，通过这些抗体与细胞特异性结合，免疫磁珠具有超顺磁性，即在磁场中具有磁洼而离开磁场后磁性消失，结合了特定细胞的磁珠在磁场中回收，从而分离出这些细胞。免疫磁性技术分离细胞的策略则包括阳性筛选、阴性筛选以及