克隆化rhBMSCs在体外向角膜上皮祖细胞的诱导分化.doc

中山大学博士后学位论文克隆化rhBMSCs在体外向角膜上皮祖细胞的诱导分化姓名：袁静申请学位级别：博士后专业：眼科学指导教师：葛坚20070101 合作导师：葛坚教授骨髓问充质干细胞，是指骨髓中一群具有向成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、肌腱细胞等多种细胞分化潜能的多能干细胞。由于其取材容易、在体外易分离和扩增培养，在长期培养过程中，始终保持其多向分化潜能，遗传背景稳定，自体移植可避免免疫排斥反应，是组织工程学和创伤愈合研究中的理想种子细胞，在医学领域具有广泛的应用前景。在最近几年内，一系列令人振奋的研究报道突破了传统认为荒芸缗卟惴只墓鄣悖乜砹薓向三个胚层的分化潜能。本研究就芊裣蚪悄掀赴只鞒醪教剿鳎教諱应用于眼表组织工程的可能性。目的：着嘌宓祝赥体系中与恒河猴角膜缘上皮细胞非接触性共培养，分三组进行诱导实验：嘌河和胎牛血清构成；榕嘌涸贏组培养液的基础上添加；榕嘌涸贐组培养液的基础上添 阴性、弱阳性、跣裕籆组增加、倍、；镃的表达较结论：利用芏忍荻壤胄慕岷咸诜掷隡，联合克隆筛选法培养，可以得了思路。关键词： ：， 甋 琲 ， 、 甀琁， 一，一 皃， 生物角膜移植是治疗角膜盲的理想方法。现在角膜移植所需的材料主要来自自体角膜缘、同种异体角膜及人工角膜。自体角膜缘来源于患者自身，移植后无排斥反应，可永久成活，是最理想的角膜移植材料，但从患者健康眼直接取角膜组织进行移植，会出现供眼损伤的危险，且无法适用于双眼角膜病患者。而同种异体角膜移植因其移植后免疫排斥反应和来源短缺等因素限制了这种方法的疗效。人工角膜研究很早，一直徘徊在临时覆盖物的阶段。近几年，组织工程的兴起激发了人们的研究兴趣，尤其是干细胞和组织工程的飞速发展，使生物角膜有可能成为治疗角膜盲的有效途径。生物角膜的核心问题是获得具有生物活性的种子细胞来源，干细胞领域中应用广泛而又颇受争议的骨髓间充质于细胞特别引人注目。的条件下可诱导细胞向特定方向分化。自从等最早在体外发现诱导煞只龀晒窍赴椭鞠赴岳础；盏糓分化出神经元样细胞； 由中山眼科中心动褐罩梗吹次，重悬后按比例分瓶进行传代培养，并标记为细 细胞扫描电镜观察：将代培养的细胞制成单细胞悬液，以察细胞表面结构并进行拍照。于装逯孔中预先置有防脱片剂处理过的盖玻片，用于细胞化学鉴定妫 匦赴赴旱稳雔的的冷乙醇流式细胞术检测细胞表面抗原：消化离心收集传代培养的，洗涤危的多向分化潜能实验：将代培养的细胞制成单细胞悬液，以玠，“胎牛血清；向内皮细胞诱导组：。胎牛血清；向神经样细胞诱导组：含 培养后，连续传至第代，细胞核型稳定。 传至代仍能保持一定增殖速度，未出现明显衰老征象。贴壁筛选法，是最初建立【埃饕肕易贴壁的性质，将贴壁细胞 仍未超出正常生理性渗透 的骨髓闻充质细胞。在对的多向分化诱导试验中，从形态及特殊染色方面初步观察证实了所培养细胞的多向分化能力，能向成骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞及神经细胞诱导分化。表明我 材料与方法赴爸饕J约梁推鞑模汉愫雍颩经克隆化培养后增殖能力强，遗传学稳定，选共孵育细胞的准备培养基和基质材料的准备 昙堑目寺疢接种至预先铺有着嘌逯校琋嘌：静置 验证是否有交叉同源性后才使用，作为诱导细胞的分化鉴定。组织切片用纯丙酮室温固，用相应的荧光标记二抗。跤，吹酉赴，细胞呈梭形，形态保持良好。标记早期，细胞形态呈荧光环状，培养数天后，细胞中荧光颗粒增多，荧光增强，细胞核未染荧光。例一昙茄粜月饰角膜缘上皮细胞原代培养：酶消化法收集的角膜缘上皮细胞在倒置显微镜下可见细胞呈圆形，晶莹透亮，接种小时后大多数贴壁。细胞聚集成片生长，天融合，此时可见细胞呈多角形，镶嵌排列，局部可以见到克隆状生长。融合后局部细胞可呈复层 扫描电镜下可见羊膜基质面为丝状胶原纤维，较疏松；透射电镜下可见羊膜基质板层纤电镜观察：扫描电镜观察椤组可见丝状胶原纤维上细长梭形细胞，细胞表面有短、跣图籑在基质微环境中培养天后，免疫组化显示三组诱导细胞的组织切片标志物表达情况分别为：镮垦粜浴阴性；椤组谋泶锝螦组降低籅组、：、 一定诱导作用，但效果不明显，而樵蛴胛从盏嫉腗表达水平无明显差异，诱导好，能有效地观察细胞在基质微环境中的诱导分化情况。 在一定浓度范围内，訠具有促增殖作用，当浓度过高时，可能激发了不同的信痬认翬对诱导细胞抑制其增分化、形态结构及再生和衰老等；脂多糖甧，是革兰氏阴性细菌 学观察，流式细胞分析和免疫组织化学等方法，分析姆只榭觯=玀应用 一、诱导实验的不足之处和改进方法：加用体内诱导研究，迸一步明确诱导分化细胞的功能。信服的资料，本实验所得到的不同结果是否是体外诱导过程豹人为因素造成，抑或人们对成体干细胞分化研究的最终目的是把干细胞运用到与疾病治疗密切相关的 ， ，：甕：瓸琂琑甊 琍甀猟，琀， 甊 ： ，：，路艳蒙，傅文玉，朴英杰等人骨髓间充质干细胞的超微结构电子显微学报，珿 福琌珺 ；瓻甁， ：，琄畃 、赴銰疓谡枷赴芷诒戎捣直鹞、 、 图：基质材料的观察 染色阴性，仅细胞核染蓝色荧光；篗 图：羊膜基质上生长的盏己蟊泶飅襂的免疫组织化学检测，分别为椤组、橛盏己驝昙堑腗染色。 图：荧光，橄月躺猓馇慷热酰珻组呈较强绿色荧光；图： 图： 在此博士后工作结束之际，我衷心地感谢： 个人简介华中科技大学同济医学院附属协和医院眼科俅惨窖中山大学干细胞中心亢，一至今主持猴自体骨髓问充质干