乙型肝炎病毒耐药新位点的研究.doc

上海交通大学硕士学位论文乙型肝炎病毒耐药新位点的研究姓名：邓俊申请学位级别：硕士专业：内科学（传染病）指导教师：张欣欣20090501 上海交通大学硕士学位论文乙型肝炎病毒耐药新位点的研究乙型肝炎病毒耐药新位点的研究摘要目的：建立并应用体外表型分析技术对乙型肝炎病毒（HBV）可能的耐药新位点进行研究。本文主要分为两个部分，第一部分分析核苷（酸）类药物治疗慢性乙型肝炎过程中出现的 HBV耐药变异模式及其特点，并从中得到可能的耐药变异新位点。第二部分则是对所发现的新位点进行体外表型分析。材料与方法：第一部分对 2005年 9月到 2007年 6月送检的 227份慢性乙型肝炎患者血清标本，应用 Trugene试剂盒抽提、扩增 HBV基因组聚合酶逆转录酶(RT)区，PCR产物经过 CLIP反应后加到 MicroCel 500电泳胶板中电泳，应用 GeneObjects软件获得样本的序列，分析其突变，并应用 SPSS15.0软件进行统计分析。第二部分在上述研究结果的基础上，选择出现频率最高的未知变异，利用定点突变技术构建带有特定点突变的 HBV重组质粒，将其转染肝细胞系后并进行体外表型测定。结果：在 227份标本中有 111份（49.0）发现已知耐药位点（rtM204V/I，rtL180M，rtV173L，rtV207I，rtN236T，rtA181V/T等）变异，其中明确用药史的共 75例。在拉米夫定和阿德福韦序贯治疗的患者中出现多重耐药变异的概率较高，为 25.0%（4/16），而在先用拉米夫定后联合阿德福韦治疗的 16例患者中未发现后续阿德福韦耐药变异。在其他位点的变异V 上海交通大学硕士学位论文乙型肝炎病毒耐药新位点的研究中，以 rtS256C、rtA222T和 rtL229V出现频率较高。通过初步建立的HBV体外表型分析系统研究发现，拉米夫定对单独含有 rtS256C突变的重组质粒的 IC50值为 0.710.49umol/l，较野生株质粒增高约 4.44倍，当它伴随其他变异出现时，HBV对拉米夫定的敏感性增减不一。阿德福韦酯对带有 rtI233V突变的重组质粒的 IC50值为 1.690.52umol/l，较野生株升高 6.50倍。结论：在核苷（酸）类药物治疗慢性乙型肝炎过程中，出现的变异模式复杂，对已使用拉米夫定的患者，换用阿德福韦酯可导致多重耐药变异。rtS256C变异在某些情况下能轻度降低HBV对LMV的敏感性，而rtI233V变异单独出现即可使阿德福韦酯对 HBV的 IC50增高 6倍以上而导致临床耐药。体外表型分析技术可为临床耐药原因的确定、及时处理耐药、合理选择药物提供依据。关键词肝炎病毒，乙型，核苷（酸）类药物，变异，耐药VI 上海交通大学硕士学位论文乙型肝炎病毒耐药新位点的研究STUDY ON NEW ANTI-VIRAL RESISTANTMUTATIONS OF HEPATITIS B VIRUSABSTRACT Objective: To construct and use in vitro phenotypic analysis technology for investigating the potential new anti-viral resistant mutations of HBV to nucleoside analog .The study involved two parts. Part one was to observe and analyze characteristics of mutation patterns within hepatitis B virus (HBV) P gene RT region in patients who received nucleoside analog treatment and whether there are new mutation points. Part two was mainly concerned about in vitro antiviral phenotypic analysis of potential resistant mutations to nucleoside analog as LMV and ADV. Methods: In the first part, viral DNA was extracted by Trugene kit from 227 serum samples of chronic hepatitis B patients from September 2005 to March 2007. The RT region of HBV P gene was amplified by PCR followed the sequence analysis by GeneObjects software. In the second part, we employed site-directed mutagenesis to constructed recombinant HBV replication competent plasmid containing the mutations which were determined in part one. In vitro phenotype testing was performed after transient transfection of hepatocyte-derived cell lines cells with recombinant wild and mutant HBV clones. Results: Resistant mutations which have been reported was found in 111 case（49）among 227 samples, 75 cases were known about their therapy VI I 上海交通大学硕士学位论文乙型肝炎病毒耐药新位点的研究history. The incidence of multi-drug resistance in lamivudine adefovir sequential therapy is 25% (4/16), much higer than lamivudine and adefovir combination in which no multi-drug resistance was found. For the mutations which have not been reported before, rtS256C、rtA222T and rtL229V were more frequent than others. Results of in vitro susceptibility of HBV mutants to antiviral drugs indicated the vector containing the single rtS256C mutant remained sensitive to LMV, with a 4.44-fold change in IC 50 values, compared to the wt plasmid. When it was accompanied with other mutations, the change was varied. The variant with the rtI233V mutation exhibited a 6.5-fold susceptibility decrease to ADV, as compared to the corresponding wild HBV. Conclusion: The patterns of mutation were complicated in nucleotide analogue treated patients. Switching to adefovir in lamivudine resistant patients may lead to multi-drug resistance. Our observations suggest that the emergence of a single substitution at position rt233 is sufficient to induce resistance to ADV and the rtS256C mutation leads to slightly reduced sensitivity to LMV in some conditions. In vitro antiviral phenotypic analysis technology can provide evidence to determine the causes of clinic resistance、handle the resistance in time and conduct to choose the reasonable drug. Key Word Hepatitis B Virus, Nucleoside analog, Mutation, Resistance VI I I 上海交通大学硕士学位论文乙型肝炎病毒耐药新位点的研究符号说明Hepatitis B virusHBVHBeAgORFRT乙型肝炎病毒乙肝病毒 e抗原开放读码框Hepatitis B e antigenOpen Reading FrameReverse transcriptaseCovalently closed circular DNARelaxed circular DNADouble strand DNASingle strand DNALamivudine逆转录酶cccDNArcDNAdsDNAss DNALMV共价闭合环状 DNA松弛环状 DNA双链 DNA单链 DNA拉米夫定Adefovir DipivoxilEntecavirADV阿德福韦酯ETV恩替卡韦TelbivudineLDT替比夫定50% Inhibiting concentrationAlanine amino transferaseIC50 半数抑制浓度谷丙转氨酶ALTTyrosine-Methionine-Aspartate-AspartateYMDD酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸 上海交通大学硕士学位论文乙型肝炎病毒耐药新位点的研究上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日I I I 上海交通大学硕士学位论文乙型肝炎病毒耐药新位点的研究上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密。（请在以上方框内打“”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日I V 上海交通大学硕士学位论文乙型肝炎病毒耐药新位点的研究引言乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一种全球性疾病。据统计，全世界 HBV感染者（HBsAg阳性）超过 2.8亿1,我国约占 9300万。多数携带者无症状，其中 1/3可进一步发展出现肝损害的临床表现。目前我国有乙肝患者 3000万。HBV属嗜肝 DNA病毒科，和逆转录病毒一样，它利用逆转录酶来复制自己的基因组，模板是被称为前基因组 RNA的 RNA中间体。HBV基因组 DNA是一环状的部分双螺旋结构,长约 3.2kb。其中的 2/3为双螺旋结构，1/3为单链，即 DNA中的两条链不等长。长链的 5端与 3端无共价连接，而是与一种蛋白质共价相连。长链的5端以 250-300对碱基互补结合。长链为负链，短链为正链。短链的长度视病毒而异，一般长约 1.6-2.8kb,约为长链的 2/3。短链之间的空隙可由病毒颗粒中的 DNA聚合酶充填。乙肝病毒是目前已知的感染人类最小的双链 DNA病毒。为了能在细胞内独立复制，病毒在很小的基因组中尽量容纳大量的遗传信息。因而 HBV的基因组结构显得特别精密浓缩，充分利用其遗传物质。HBV含 4个部分重叠的开放读码框 (ORF)，即前 S/S区、前 C/C区、P区和 X区。前 S/S区编码大 (前 S1、前 S2及 S)、中 (前S2及 S)、小 (S) 3种包膜蛋白；前 C/C区编码 HBeAg及 HBcAg；P区编码聚合酶；X区编码 X蛋白。所有这些 ORF都在负链上，其中 S基因完全重叠于聚合酶基因中，X基因与聚合酶基因、C基因重叠，C基因与聚合酶也有重叠2。HBV基因组结构严密,组织高效,在已知的病毒中是罕见的。HBV侵入人体后，与肝细胞膜上的受体结合，脱去外膜（envelope），穿入肝细胞质内，然后脱去衣壳 (capsid)，部分双链环状 HBV DNA进入肝细胞核内，在宿主酶的作用下，以负链 DNA为模板延长正链，修补正链中的裂隙区，形成共价闭合环状 DNA (cccDNA)，然后以 cccDNA为模板，在宿主 RNA聚合酶 II的作用下，转录成几种不同长短的 mRNA，其中 3.5kb的 mRNA含有 HBV DNA序列上全部遗传信息，称为前基因组 RNA。后者进入肝细胞质作为模板，在 HBV DNA逆转录酶作用下，合成负链 DNA；再以负链 DNA为模板合成正链 DNA，形成子代的部分双链环1 上海交通大学硕士学位论文乙型肝炎病毒耐药新位点的研究状 DNA，最后装配成完整的 HBV，一部分再进入细胞核补充消耗的 cccDNA,另外一部分则在内质网中装配外膜，形成成熟的病毒颗粒向细胞外分泌3。HBV的复制极其活跃，在外周血中，病毒颗粒的半衰期约为 1天，即每天约有50的病毒颗粒被更新，据统计每天约有 1011病毒颗粒被释放入血4。而被 HBV感染的肝细胞半衰期则因人而异，从 10天到 100天不等。肝细胞内的 cccDNA也有较长的半衰期，根据数学模型分析，排除宿主的特异性免疫反应以及病毒变异的影响，需要进行 14年的抗病毒治疗才能完全清除患者肝细胞内的 cccDNA，而 cccDNA以及被感染的肝细胞的长期存在也决定了乙型肝炎的抗病毒治疗是个长期的过程，无法一蹴而就5。HBV这种独特的复制方式为其提供了至少两个选择性优势。首先，HBV cccDNA作为最主要的转录模板非常稳定。其次，HBV的逆转录酶缺乏校正活性，因此在体内复制过程中将产生大量的核苷酸的错配。由于 HBV基因在复制过程中不断产生天然变异，从而在未经治疗的 HBV感染者体内常常形成一群基因序列十分相似、但不完全等同的病毒株组成的准种（quasispecies）。在内源性（宿主免疫应答）和外源性（抗病毒药物）选择压力下，复制适应性最强的准种将被选择出来成为优势株，这就是耐药变异株的产生过程。核苷（酸）类药物耐药的发展至少取决于以下六个因素：（1）病毒复制的数量和速率；（2）病毒聚合酶的保真性；（3）药物的选择压力；（4）肝脏内 HBV复制空间总量；（5）耐药病毒株的复制适应性；（6）药物的基因屏障。病毒复制的数量和速率HBV高复制导致的病毒高更新率使得慢性感染者血清中的循环病毒浓度常常大于 1081010病毒颗粒/毫升。假定循环中的病毒半衰期为一天，每天新产生的病毒颗粒也要超过 10116, 7。HBV有着 3200个核苷和碱基对的基因组，聚合酶错配率为 10-4至 10-5/碱基/循环，这便导致了循环病毒总体中含有大量带有突变的基因组（准种），2 上海交通大学硕士学位论文乙型肝炎病毒耐药新位点的研究因此每天每个碱基都可能发生变化。然而 ,HBV基因组中以框移读码方式重叠的ORF结构可限制最终产生有活力的突变体的数量。病毒聚合酶的保真性HBV突变率大约为 1.4至 3.210-5氨基酸置换/位点/年8，约为其它 DNA病毒的 10倍，与 RNA病毒如逆转录病毒相当。与细胞聚合酶不同，HBV聚合酶是逆转录酶，缺少校正活性。因此，由于 HBV准种池的存在，进行抗病毒治疗之前就有可能存在带有一个或两个与耐药有关突变的变异株9。药物的选择压力与耐药相关的变异在治疗过程中被选择出来的机率取决于药物的效力。这种机率可以用钟形曲线来表示10。因此，低抗病毒效力的药物并不会对病毒施加明显的选择压力，耐药株出现的风险也不高。反之，由于变异依赖病毒复制9，彻底抑制病毒复制的药物几乎不给变异产生的机会。由于单药疗法只在单一的靶位点不同程度地发挥抗病毒作用，所以它有着较高的机率选择出耐药变异。理想的治疗方案能在病毒生命周期的不同阶段抑制病毒，从而能显著减少耐药发生的风险。在药物选择压力存在的情况下,只有病毒复制存在才可发生耐药。肝脏中 HBV复制空间总量HBV的复制空间是肝脏容纳新的转录模板或 CCCDNA分子的潜力11, 12。这表明病毒变异株的最终接收依赖于原始野生病毒株的损耗，并受着其他因素如病毒复制适应性和肝细胞的增殖和更新的影响11, 12。在正常肝脏中，肝细胞的更新很慢，半衰期约为 100天7。在炎症活动和中毒时，半衰期会减少到 10天以下。在完全感染的肝脏中,新生的 HBV CCCDNA分子只有在生成未感染的肝细胞时才可合成,而未感染的肝细胞可通过肝脏的正常生长、肝细胞的增殖和更新或感染的肝细胞中野生型病毒的 CCCDNA的消失而获得13。耐药病毒株的复制适应性3 上海交通大学硕士学位论文乙型肝炎病毒耐药新位点的研究复制适应性可定义为在自然选择压力下生成子代的能力,它不是以产量来衡量病毒复制能力,而是可通过体外共感染竞争试验来测定。有临床研究显示了对拉米夫定耐药 HBV的复制适应性的研究。Thibault等14首先报道了对拉米夫定耐药 HBV在患者之间的传播性 ;另一些研究小组发现在停药后至少三个月 ,拉米夫定耐药株可作为共同优势株与野生型 HBV共存15,而在停药约一年后 ,则作为非优势株与野生型HBV共存16。基因屏障核苷（酸）类药物的基因屏障是指主要耐药变异所需核苷酸突变的数目。对左旋核苷类如 LMV和无环硫酸盐类药物如 ADV,只需一个突变。例如，rtM204I导致LMV耐药，而 rtN236T造成 ADV耐药。对环戊皖类成员 ETV来说，至少需要 3个变异。rtM180L和 rtM204I加上 rtI169、rtS184、rtS202和 rtM250中的一个，表明 ETV有着更高的基因屏障17。其他因素影响抗病毒治疗的宿主因素包括过往用药史、患者顺应性、宿主基因因素（如先天性代谢缺陷）和通过一系列细胞内磷酸化（肝细胞内的补救酶类） 18有效地将核苷类药物转化为其活性代谢物的能力。另外，作为 HBV复制过程中的关键一环，cccDNA对传统疗法一般不敏感19。目前我国共有四种核苷（酸）类药物被批准用来治疗 HBV感染，按照它们的化学结构，可分为三组。第一类是左旋核苷类药物包括拉米夫定（LMV）和替比夫定（LdT）。第二类为无环磷酸盐类，阿德福韦酯（ADV），第三类为环戊皖类药物恩替卡韦（ETV）。核苷（酸）类药物在治疗初期，往往能够获得比较好的疗效，包括HBV DNA的下降、ALT的复常以及肝组织学的改善等。但随着治疗时间的增加，往往出现病毒耐药株，从而导致治疗的失败。一般来说，病毒耐药变异可分为两种，主要耐药变异和代偿性耐药变异。主要耐药变异是指一个氨基酸的替换而导致对于某种抗病毒药物的敏感性下降，而代偿4 上海交通大学硕士学位论文乙型肝炎病毒耐药新位点的研究性耐药变异是指一个氨基酸的替换能够补偿因主要耐药变异而导致的病毒聚合酶活性的功能缺陷（如复制适应性）。例如，拉米夫定耐药相关变化发生在 204位密码子，相对应的氨基酸由酪氨酸甲硫氨酸天冬氨酸天冬氨酸（ YMDD基序）变为YVDD或 YIDD（甲硫氨酸被缬氨酸或异亮氨酸取代），即 rtM204V/I。这一改变可导致在表型测定中病毒对于拉米夫定的敏感性下降 100倍以上。而与拉米夫定耐药相关的最常见的代偿性变异则为 rtL180M（亮氨酸被甲硫氨酸所取代），它能恢复HBV聚合酶因 rtM204V/I变异而降低的复制适应性20。在临床工作中，有时出现核苷（酸）药物治疗初始有效，然而随着治疗时间的延长，患者出现病毒学反跳或外周血 HBV DNA载量不再下降，但 HBV DNA逆转录酶区测序又未发现已经被证实的耐药变异。是否在已知耐药变异位点之外还存在着新的耐药位点？本文在对这类患者进行分析的基础上，选择出现频率较高的突变位点，利用定点突变技术，构建带有相应变异的 HBV重组质粒。将其转染肝细胞株，进行体外表型分析，计算 50药物抑制浓度（IC50）以鉴定该变异是否为耐药相关变异。5 上海交通大学硕士学位论文乙型肝炎病毒耐药新位点的研究第一部分核苷（酸）类耐药患者中乙型肝炎病毒逆转录酶区基因变异类型及其特点分析随着核苷（酸）类抗病毒药物的临床广泛应用，HBV RT区的变异形式日趋复杂，且有些患者虽然没有检测到常见的耐药变异，但是出现病毒学反跳或治疗效果不佳。目前耐药相关的变异模式有哪些？是否在已知耐药变异位点之外还存在着新的变异位点？我们对此进行了研究。1.材料与方法1. 1患者及标本来源对自 2005年 9月至 2007年 3月在瑞金医院感染科临床病毒实验室送检的 227份慢性乙型肝炎患者血清标本进行 HBV RT区基因分析，其中男性患者血清标本 198份，女性患者血清标本 29份。基因型组成：B型 69例(30.4),C型 158例（69.6）。年龄 1773岁，平均（4011）岁。患者均接受过核苷（酸）类药物治疗，其中有75例有完整的核苷（酸）类治疗病史记录，单用拉米夫定（Lamivudine，LMV）28例、阿德福韦酯（Adefovir Dipivoxil，ADV）11例、LMV和 ADV序贯治疗 16例、LMV和恩替卡韦（Entecavir，ETV）序贯治疗 4例、LMV与 ADV联合治疗 16例,其中序贯治疗和联合治疗均在出现病毒学、甚至生物化学突破时使用。1. 2方法1. 2. 1 HBV DNA定量检测：HBV DNA荧光 PCR定量检测试剂盒购自深圳匹基生物工程有限公司，参照说明书提取 HBV DNA,应用 7300型实时荧光定量 PCR仪（购自美国应用生物系统公司）进行 PCR扩增和定量检测。6 上海交通大学硕士学位论文乙型肝炎病毒耐药新位点的研究1. 2. 2 HBV RT区基因全序列分析:采用德国 Siemen公司 Trugene HBV Genotyping试剂盒，操作过程简述如下：以Qiamp Blood Mini试剂盒(购自德国 Qiagen公司)抽提 HBV基因组，PCR扩增病毒聚合酶 RT区，PCR产物经过 CLIP反应后加到 Microcel 500电泳胶板中电泳，应用Geneobjects软件包根据实时序列数据,结合每一对正向及反向序列,与存储在 HBV基因库的参考序列自动比对从而获得样本的基因型、突变位点和多态性。1. 3统计学处理:数据采用 SPSS15.0软件分析，组间比较用 Kruskal-Wallis和 SNK方法检验。2.结果2. 1已知耐药位点及其组合模式227份慢性乙型肝炎患者血清标本中有 111份发现了已知耐药位点变异，其中rtL180M+rtM204V变异 35份（31.5）、rtM204I变异 18份（16.2）、rtL180M+rtM204I变异 13份（11.7）、rtV173L+rtL180M+rtM204V变异 9份（8.1）、rtN236变异 7份（6.3%）、rtA181T+rtM204V变异 5份（4.5）、rtA181T+rtM204V变异 4份（3.6）、rtA181V+rtN236T变异 3份（2.7），其余变异详见附表 1。在 111例出现已知耐药变异的慢性乙型肝炎患者中，明确应用核苷（酸）类药物治疗者共 75例，其中单用 LMV的有 28例，单用 ADV的有 11例，LMV和 ADV序贯治疗的有 16例，LMV和 ETV序贯治疗的有 4例，LMV治疗后加用 ADV的有16例。治疗药物不同，其耐药变异模式及发生率也不相同，详见表 1。其余 36例由于病历资料缺失，无法得知其具体应用的核苷（酸）类药物种类。7 上海交通大学硕士学位论文乙型肝炎病毒耐药新位点的研究表 1 75例慢性乙型肝炎患者不同核苷（酸）类药物治疗耐药变异模式及构成比治疗药物病例数变异模式rtL180M+rtM204VrtM204I例数构成比（）单用281242.921.410.67.1LMV63211111rtL180M+M204IrtL180MrtA181V+rtV207IrtV173L+rtL180M+rtV207IrtV173L+rtL180M+rtM204VrtA181S3.63.63.63.6rtA181T+M204I3.6单用11rtN236TrtA181V721163.818.29ADVrtA181V+rtN236TrtA181T+rtN236T9LMV和ADV序贯治疗16rtA181T+rtM204IrtM204I33222118.718.712.512.512.56.3rtL180M+rtM204VrtL180M+rtM204IrtL180MrtV173L+rtL180M+rtM204V+rtA181TrtN236T+rtA181V16.38 上海交通大学硕士学位论文乙型肝炎病毒耐药新位点的研究表 1（续）治疗药物LMV和ADV序贯治疗病例数变异模式例数构成比（）rtA181T16.36.3rtV173L+rtM204V1LMV和ETV序贯治疗4rtL180M+rtM204VrtV173L+rtL180M+rtM204VrtM204I211502525先用16rtL180M+rtM204VrtV173L+rtL180M+rtM204VrtL180M+rtM204IrtV173L+rtM204I+rtM204VrtV173L74211143.625.012.56.3LMV后联合ADV治疗6.3rtM204I6.32.2主要耐药变异模式与 HBV DNA、ALT相关性分析对 75例明确应用核苷（酸）类药物治疗的慢性乙型肝炎患者，按耐药变异模式，取在构成比中占前几位的变异 rtL180M+rtM204V、rtM204I、rtL180M+rtM204I、rtV173L+rtL180M+rtM204V、rtN236T以及 rtA181V等分 6组，用 SPSS 15.0统计软件比较各组在检测耐药变异时的 ALT及 HBV DNA水平，均未发现有统计学意义的差异，见表 2。9 上海交通大学硕士学位论文乙型肝炎病毒耐药新位点的研究表 2检测耐药变异时主要变异模式与 HBV DNA及 ALT水平的关系变异模式ALTa（U/L） H值P值 b HBVDNA(log10 F值P值 dcopy/ml)CrtL180M+rtM204V 33（22，45） 7.328rtM204I0.1975.541.195.671.265.241.385.611.170.1280.98569(52,145)rtL180M+rtM204I 45（23,58）rtV173L+rtL180M 58（34,79）+rtM204VrtN236TrtA181V28（24,28）46（34,46.5）5.400.515.222.5a:ALT用中位数和四分位间距表示； b，:由于各组方差不齐，ALT的统计分析均用Kruskal-Wallis方法检验；C：HBV DNA用均数标准差表示； d：HBV DNA的统计分析用 SNK方法检验。2.3其他变异位点在 RT区的其他位点，也发现了一些未见报道的或未经体外实验证实与耐药相关的变异。在 227例慢性乙型肝炎患者中，出现较多的变异位点分别为 rtS256C 43例(18.9)、rtA222T 20例(8.8)、rtL229V 10例(4.4）。而在出现已知耐药变异的 111例病例中，也常伴随上述变异的出现，其中伴 rtS256C有 28例 (25.2)，rtA222T有 16例（14.4)，rtL229V有 10例（9.0）。在确定用药史的 75例患者中，我们发现 rtS256C 16例(21.3），rtA222T 11例(14.7)，rtL229V 9例(12.0)。在没有发现已知耐药变异的 116名患者中，出现最多的变异是 rtS256C 15例(12.9)和 rtA222T4例(3.4)。10 上海交通大学硕士学位论文乙型肝炎病毒耐药新位点的研究3. 讨论目前研究发现与耐药相关的变异位点包括拉米夫定为 rtM204V/I、rtL180M、rtV173L、rtA181T、rtV207I21-23，其中 rtM204V/I（YMDD变异）被称为主要耐药突变，它的出现可大大降低病毒对拉米夫定的敏感性，而其余的变异则被称为代偿变异,常常与 YMDD变异同时出现，一定程度上能够恢复 YMDD变异病毒的复制能力20。阿德福韦主要耐药相关变异为 rtN236T、 rtA181V/T24;恩替卡韦为rtM250V+rtI169T+rtM204V+rtL180M、rtT184G +rtS202I+rtM204V+rtL180M17等，恩替卡韦耐药突变建立在拉米夫定耐药变异的基础上，称为二次打击模式。本研究发现，在用 LMV治疗后合用 ADV的患者中，未出现 ADV相关位点变异（181及 236位），在 LMV和 ADV序贯治疗的 16例患者中，出现阿德福韦相关位点变异 4例,表明序贯治疗后出现拉米夫定和阿德福韦多重耐药的概率明显增加，这与其他研究相一致。过去认为，rtA181T可以在单用拉米夫定或拉米夫定和阿德福韦序贯治疗中出现，而 rtA181V只在接受 ADV治疗的患者中出现，但最近有研究指出，此变异也可以在接受 LMV治疗的患者中出现，且体外表型测定证实 rtA181V的病毒变异株对 LMV和 ADV联合耐药25-27。本研究也在接受 LMV治疗的患者中发现了 rtA181V变异，并伴随有 rtV207I变异。此外，在曾用过 LMV治疗（无论是单用、合用还是序贯治疗）的患者中发现了 rtL180M（4例）、rtV173L（1例）、rtV173L+rtL180M+rtV207I(1例)变异出现，根据以往的文献报道，这些位点的变异都属于继发性代偿变异，它们只能恢复变异株的复制适应性，而对药物的敏感性并无太大影响，本研究的结果提示这些变异也可能影响病毒对药物的敏感性，尤其是当多个继发性代偿变异同时出现时。HBV发生耐药变异时,患者的临床表现往往轻重不一，存在显著个体差异，导致这一现象的可能原因除了与患者本身肝脏基础病变、免疫应答状态等不同外，是否还与耐药变异的不同组合模式有关？我们对有确定用药史的 75例病例进一步研究后发现，6种主要耐药变异模式在检测时的 ALT及 HBV DNA水平差异均无统计学意11 上海交通大学硕士学位论文乙型肝炎病毒耐药新位点的研究义,提示临床表现可能与耐药变异模式无关，但由于病例数较少，还需进一步研究。HBV复制能力高，且其逆转录酶缺少校正活性，导致复制的错配率较高，每天约有 1010个含错配的病毒颗粒产生。HBV治疗前就存在自发性变异，病毒耐药变异的过程就是药物对病毒变异的选择过程28。在 116例临床表现为耐药而未发现已知耐药变异的患者血清中，检测到 RT区多个其他位出现点突变，其中以 rtS256C及rtA222T出现频率最高，提示这些突变可能影响 HBV DNA的复制能力以及药物敏感性。在出现已知耐药变异的 111例患者中也伴随有这些变异。在有确定用药史的 75例患者中出现了 rtS256C（16例），rtA222T(11例)，rtL229V（9例）变异。曾有文献报道，在患者治疗前的血清中，存在 rtS256C变异的病毒株（13/26,50）,可视作自然产生的多态现象,但它与 LMV长期治疗的疗效相关，不过尚未经体外表型测定证实29。此位点位于 HBV POL的手掌区域，与 204及 180位十分接近，此处的变异可能部分恢复耐药变异株的复制适应性。而 rtA222T和 rtL229V也可能以同种方式影响病毒复制。rtL229V也有研究提及可能与拉米夫定耐药有关，但未经体外实验证实30。本文通过研究发现，核苷（酸）类耐药患者中 HBV RT区耐药变异模式多样，且有相当一部分的患者未发现已知耐药变异，其原因有待进一步研究。本研究病例中各种变异模式在检测变异时的 ALT及 HBV DNA均无明显差异。拉米夫定和阿德福韦序贯治疗的患者与二者联合治疗相比，其出现的耐药模式复杂，且出现阿德福韦耐药变异的概率增大。其它出现频率最高的变异是 rtS256C、rtA222T和 rtL229V，其生物学特性包括对药物敏感性及复制能力的改变有待体外实验的进一步证实。上述结果为临床合理用药及进一步开展耐药机制研究提供了依据。12 上海交通大学硕士学位论文乙型肝炎病毒耐药新位点的研究第二部分HBV体外表型分析技术的初步建立及可能耐药新位点的分析在第一部分研究中，我们在 116例临床表现为耐药而 RT区基因分析未发现已知耐药变异的患者血清中，检测到多个其他位出现点突变，其中 rtS256C(15/116,12.9)及 rtA222T(4/116, 3.4)出现频率最高，而在出现已知耐药变异的 111例患者中也伴随有这些变异，其中 rtS256C（18/111，16.2%），rtA222T（11/111,9.9）。曾有研究发现 rtS256C变异与 LMV长期疗效有关29，但未经体外表型实验确定。此外，最近的研究发现 rtI233V变异可能导致 HBV对 ADV耐药，但尚有争议31-33。在本部分研究中，我们选择了 rtS256C和 rtI233V这两个变异作为研究的靶位点，利用定点突变技术构建含上述突变的 HBV重组复制质粒，然后用体外表型分析技术对其进行验证。1 材料与方法1. 1主要实验仪器DHG-9023A型电热恒温鼓风干燥箱DK-8D型电热恒温水槽上海精宏实验设备有限公司上海精宏实验设备有限公司上海精宏实验设备有限公司江苏太仓华利达实验设备有限公司苏州艾可林净化设备有限公司德国艾本德股份公司GNP-9160型隔水式恒温培养箱HE-201KA/B型气浴培养摇床无菌层流超净台Eppendorf 5415D型高速离心机Eppendorf Mastercycler PCR扩增仪德国艾本德股份公司13 上海交通大学硕士学位论文乙型肝炎病毒耐药新位点的研究FD201稳压稳流电泳仪MiniBis凝胶成像系统BD-93型医用冰箱上海医用分析仪器厂以色列 DNR成像系统有限公司青岛海尔电器有限公司ULT2186-4-v型超低温冰箱美国 Thermo Scientific Revco公司BP221S Sartorius电子天平德国赛多利斯仪器设备公司日本富士公司Fujifilm LAS-100化学发光检测系统1. 2主要试验试剂1. 2. 1质粒及特征：本论文中使用的 pWT质粒由中国科学院上海生物化学和细胞研究所汪垣课题组惠赠，具有氨苄青霉素抗性，重组有 1.2拷贝的 HBV（血清 adr型、基因 C型）基因组，可复制出 HBV的类病毒颗粒。1. 2. 2菌株Top10感受态细胞购自天根公司。1. 2. 3细胞系本文中使用细胞系为人肝癌细胞系 Huh-7，本实验室保存，采用 25cm2的培养皿以单层培养细胞的形式多次传代 ,培养基为含 10%胎牛血清和 2%谷氨酰胺的DMEM培养基(GIBCO公司),在 PSH-300生化培养箱中 37培养。1. 2. 4培养基及配制过程2xYT琼脂平板用于大肠杆菌菌株的培养。其配方为：称取取蛋白胨 16g，酵母提取物 10g，NaCl 5g，琼脂粉 12g置入 1L烧瓶中，加入 0.8L去离子水，充分搅拌溶解。然后用 5N NaOH调节 pH至 7.0,加去离子水定容至 1L。高压灭菌锅内 123C下灭菌 20min，待其冷却至 50c时加入氨苄青霉素至浓度为 60ug/ml，混匀后倒入平板内，待琼脂凝固后放入 4c备用。14 上海交通大学硕士学位论文乙型肝炎病毒耐药新位点的研究SOC培养基SOC培养基用于转化后大肠杆菌菌株的培养。其配方为：蛋白胨 2g,酵母粉 0.5g, NaCl, 0.05g, 250mmol/L KCl溶液 1mL, 1mol/L葡萄糖 2mL,定容至 100mL。然后用 5N NaOH调 pH至 7.0,在 123度下灭菌 20min,然后加入灭菌的1mL 1mol/L的 MgCl2溶液, 4C放置备用。1. 2. 5酶、化学试剂和试剂盒限制性核酸内切酶 XhoI、NcoI、PsTI、EcoRI核酸分子量 Marker DL2000、MarkerPyrobest酶日本 Takara公司日本 Takara公司日本 Takara公司T4 DNA连接酶立陶宛 M