锌和维生素e对ⅰ型糖尿病大鼠心肌凋亡促进因子smac表达的作用.doc

锌和维生素E对型糖尿病大鼠心肌凋亡促进因子Smac表达的作用锌和维生素E对型糖尿病大鼠心肌凋亡促进因子Sa表达的作用_论文_临床医学论文_医药学论文【摘要】目的：探讨锌和维生素E对型糖尿病大鼠心肌凋亡因子Sa表达的作用及对糖尿病大鼠心肌细胞保护作用的机制。方法：按体重将大鼠随机分为对照组(10只)和实验组(40只),实验组动物采用腹腔注射链脲左菌素(streptzti【摘要】 目的：探讨锌和维生素E对型糖尿病大鼠心肌凋亡因子Sa表达的作用及对糖尿病大鼠心肌细胞保护作用的机制。方法：按体重将大鼠随机分为对照组(10只)和实验组(40只),实验组动物采用腹腔注射链脲左菌素(streptztin， STZ)，60g/kg一次注射，制备糖尿病大鼠模型。将40只实验组大鼠按血糖值参考体重分为4组:糖尿病对照组,糖尿病补锌组,糖尿病补VE组,糖尿病补Zn+VE组。6周后将各组大鼠处死,切取心室肌组织,免疫组织化学染色,观察各组心肌组织Sa的表达, HPIAS2000图像分析系统测定Sa在各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。 结果：对照组心肌细胞内Sa呈阴性表达, 糖尿病对照组心肌细胞内Sa呈阳性表达;糖尿病补锌组和糖尿病补VE组心肌细胞内Sa呈弱阳性表达;糖尿病补Zn+VE组心肌细胞内Sa呈阴性表达。图像分析结果显示：糖尿病补Zn+VE组与糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补VE组之间Sa的平均光密度及阳性面积率的差异有性意义(P 0.05);糖尿病补Zn+VE组与组之间Sa的平均光密度及阳性面积率的差异无性意义(P 0 05)。 结论： Zn和VE联合使用可减低糖尿病大鼠心肌细胞凋亡的作用。 【关键词】 锌; 维生素E; 糖尿病; 心肌; Sa; 统计分析糖尿病是常见的遗传倾向的葡萄糖代谢和内分泌障碍,是性或性胰岛素分泌引起的。近半个世纪来,糖尿病患病率和死亡率有上升趋势,在我国已继心血管疾病、肿瘤之后列第3位的常见病、多发病和慢性非传染性疾病1。糖尿病在病理组织形态上主要是胰岛损伤,胰岛素或所引起。近年来,国内外许多学者临床和流行病学调查,周密设计的基础和实验,对糖尿病的病因较多的认识,但对原发性糖尿病的病因仍然不清楚23。 Sa是王晓东等2000年在线粒体中的蛋白,可释放到胞浆中凋亡的细胞凋亡和增殖的平衡是生物个体生长发育的基础,细胞增殖过度和(或)细胞凋亡受阻是肿瘤过程中的机制。Sa是近期的促凋亡蛋白,在凋亡信号刺激下与细胞色素(yt)一同从线粒体中释放,可并活化apaf1并解除凋亡抑制蛋白(IAPs)对aspase3、7、9的抑制作用而作用46。 Zn 机体必需的微量营养元素,是体内200多种蛋白酶的金属配基,其含量的势必有利于酶活性的。Zn 对细胞保护作用的途径,是基于控制过氧化作用。VE 天然抗氧化成分,对维持体内自由基平衡,机体发育,保护细胞膜稳定作用7。锌和维生素E是抗氧化剂并细胞保护作用。 本应用免疫组织化学方法观察了锌和维生素E联合应用对高血糖引起的心肌细胞凋亡的保护作用，旨在探讨两者对糖尿病大鼠心肌的保护作用。 1 材料与方法 1 材料 昆明种SD大鼠50只,雄性,体重180200g ,武汉大学医学院实验动物中心,饲养1后实验。 1.2 方法 1.2.1 动物模型及分组 按体重随机分为对照组(10只)和实验组(40只) ,各组大鼠禁食12h 后,实验组大鼠以60g/kg的剂量一次性腹腔注射STZ溶液(用0.1l/ L、pH 4.4 的枸橼酸盐缓冲液在冰浴下配制成11g/l的STZ 溶液),对照组大鼠(N)注射等体积的枸橼酸盐缓冲液。观察动物饮水、进食及尿量等情况。一周后,采尾静脉血测血糖,以血糖浓度 16.6l/ L ,饮水量 40 l/ d ,尿糖强阳性( + + + + + + + )的大鼠糖尿病大鼠。将选取糖尿病大鼠40只按血糖值参考体重分为4组:糖尿病对照组,糖尿病补锌组,糖尿病补VE组,糖尿病补Zn+VE组。各组动物均喂饲人工合成饲料,配方:酪蛋白20 % ,玉米淀粉65% ,植物油8% ,纤维素1% ,混合维生素1% ,混合无机盐5%。混合维生素和无机盐配方参见文献5,合成饲料控制锌浓度为20g/kg。对照组和实验组去离子水;补Zn 组Zn 浓度为20 g/L的含ZnS47H2 去离子水;补VE 组每天以50 g/ kgVE 灌胃;Zn和VE联合补充组在Zn浓度为20g/L的含ZnS4 7H2 去离子水的以50g/ kgVE灌胃。实验期间,密切观察动物进食和饮水量,每周称两次体重,6周后将各组大鼠处死,切取心室壁肌组织,免疫组织化学实验观察。 1.2.2 主要试剂 即用型兔抗鼠Sa单克隆抗体(北京中杉生物技术有限公司); 超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒(福州迈新公司); DAB显色试盒及多聚赖氨酸(北京中生物技术有限公司)。 1.2.3 免疫组织化学SP法检测Sa抗原 主要： 组织切片5 ，常规脱蜡至水，蒸馏水洗; 3%过氧化氢，37孵育10 in以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗45in; 切片采用微波抗原修复(3档，10 in)，PBS洗45in; 羊血清37孵育10 in以非特异性反应; 一抗37孵育1h，PBS洗45in; 生物素标记的二抗，37孵育10 in，PBS洗45in; 链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶复合物37孵育10 in，PBS洗45in; DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应; 苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗阴性对照。 1.2.4 免疫组织化学结果判断 以胞浆棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外，胞浆内无棕黄色反应物。 采用HPIAS2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统(同济千屏影像公司)对Sa的表达定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值该例的测量值(阳性面积率=面积中阳性反应的总面积/面积中细胞的总面积100%)。 1.2.5 统计学 对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNKq检验，检验水准为0.05。 2 结果 对照组心肌细胞胞浆内可见少量的棕黄色颗粒，Sa表达呈阴性, 糖尿病对照组心肌细胞胞浆内可见较多的棕黄色颗粒, Sa表达呈阳性;糖尿病补锌组心肌细胞核和胞浆内可见棕黄色颗粒, Sa表达呈弱阳性，糖尿病补VE组结果与糖尿病补锌组相同;糖尿病补Zn+VE组心肌细胞核和胞浆内可见少量的棕黄色颗粒, Sa表达呈阴性。图像分析结果显示见表1。糖尿病补Zn+VE组与糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补VE组之间Sa的平均光密度及阳性面积率的差异有性意义(P 0.05);糖尿病对照组与糖尿病补锌组、糖尿病补VE组之间Sa的平均光密度及阳性面积率的差异无性意义(P 0 05)，见表1。表1 糖尿病补Zn+VE组、糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补VE组Sa表达的平均光密度和阳性面积率注： 对照组与糖尿病对照组，P 0.05 ; 糖尿病对照组与糖尿病补Zn+VE组，P 0.05。 3 糖尿病是胰岛素分泌或作用的障碍，以高血糖为特征的内分泌代谢性疾病。急性并发症如：酮症酸中毒、高渗性酸中毒、高渗性昏迷;慢性并发症如：糖尿病肾病、糖尿病视膜病变、皮肤病变;神经病变如：周围神经病变、植物神经病变等;还有急性、慢性、局部和全身的感染如：皮肤坏疽、肺结核、胆囊炎、胆结石、肾孟肾炎、外阴感染。糖尿病是一组由遗传和环境因素作用而引起的临床综合症。据流行病学调查估计全球糖尿病患者总数已逾一亿，90%左右为2型糖尿病，其发病机理为胰岛素抵抗为主伴有胰岛素分泌缺陷或胰岛素分泌缺陷为主伴胰岛素抵抗和肝脏葡萄糖产生。2型糖尿病的治疗以口服降糖药为主。糖尿病是严重威胁人们健康的慢性疾病810。 细胞凋亡(App tsis)又称程序性细胞死亡( Prgraed ell death) ,是生理性细胞死亡过程,对机体的、发展,自身稳定起着关键性作用。Sa是新的线粒体蛋白,在细胞凋亡过程中起着作用;当细胞凋亡时,其与细胞色素一起被释放细胞浆11; Sa 解除凋亡抑制蛋白对aspase3、aspase7、aspase9的抑制作用而诱导细胞凋亡。Sa能引发保护性的细胞反应而不致细胞死亡。体外培养结果表明, Sa可引起人类脉平滑肌细胞和内皮细胞的活化,增生。对APK(丝裂原活化蛋白激酶)路径的分析揭示, ERK1、JNK1 ( JunN末端激酶)和APK等激酶都被Sa活化。内皮细胞膜上的Sa也能够活化JAK1 (Janus激酶)信号转导因子和转录激活因子STAT3, 4,进而启动基因的表达。现有证据证明:补体系统的活化在动脉粥样硬化的慢性炎症进展中,起着作用12。新西兰白兔离体心脏表明:非杀伤性补体激活,能够因局部缺血的梗死面积;但结果提示,情况下补体是5a的而起作用的。提示,由免疫球蛋白介导的补体缓慢活化而产生的Sa对充血性心肌病的发展,起着程度的作用。对28 位充血性心肌病患者心肌组织活检的分析证实:心肌细胞上有5b29 复合物的沉积,并且与免疫球蛋白的沉积、心肌细胞TNF2的表达,有的性1315。 Zn 机体必需的微量营养元素,是体内200多种蛋白酶的金属配基,其的势必有利于酶活性的。Zn 对细胞保护作用的途径,是基于控制过氧化作用,其作用机理,是竞争性膜蛋白上的巯基,地抵制它氧化成二硫键,阻止脂质过氧化反应,从而保护细胞膜的稳定性。VE 线的抗氧化保护剂阻止脂质过氧化,在自由基进攻的早期,在生物膜中的自由基瘁灭作用,保护细胞膜中的多不饱和脂肪酸1618。含硒的谷胱甘肽过氧化物酶可在脂质过氧化物破坏细胞膜前就把它们清除掉。VE 天然抗氧化成分,对维持体内自由基平衡,机体发育,保护细胞膜稳定作用。VE 的分子结构上其酚羧基的氢原子可给自由基,使之还原成脂质氢过氧化物阻断生物膜上多不饱和脂肪酸的自身过氧化。并且VE 还可生物膜上,保护生物膜免受自由基的攻击和氧化损伤。VE 能GSH2Px 的活性,并与GSH2Px 协同地终止脂质过氧化及与磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶一起抑制微粒体膜磷脂过氧化19，20。 本实验免疫组织化学方法观察到: 对照组Livin表达呈阴性, 糖尿病对照组Livin表达呈阳性;糖尿病补锌组Livin表达呈弱阳性，糖尿病补VE组结果与糖尿病补锌组相同;糖尿病补Zn+VE组Livin表达呈阴性。图像分析结果显示:糖尿病补Zn+VE组与糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补VE组之间平均光密度及阳性面积率的差异有性意义(P 0.05);糖尿病对照组与糖尿病补锌组、糖尿病补VE组之间平均光密度及阳性面积率的差异无性意义(P 0.05)。Zn 机体必需的微量营养元素,是体内200多种蛋白酶的金属配基,其的势必有利于酶活性的。Zn 对细胞保护作用的途径,是基于控制过氧化作用,其作用机理,是竞争性膜蛋白上的巯基,地抵制它氧化成二硫键,阻止脂质过氧化反应,从而保护细胞膜的稳定性。VE 线的抗氧化保护剂阻止脂质过氧化,在自由基进攻的早期,在生物膜中的自由基瘁灭作用,保护细胞膜中的多不饱和脂肪酸2123。VE 天然抗氧化成分,对维持体内自由基平衡,机体发育,保护细胞膜稳定作用。表明Zn+VE联合作用后可高血糖引起的心肌细胞的凋亡,对心肌细胞起了的保护作用。其确切机制还有待于探讨。【参考文献】 1 Tilg H,shen AR.Inflaatry ehaniss in the regulatin f insulin resistane,l ed,2008,14(34):222231. 2 nzberg H,yers G.leular and anatial deterinants f entral leptin resistane,Nat Neursi,2005,8(5):566570. 3 Rebeka S H , Philip H K, Thas J, et al . 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