荔枝漆酶基因的克隆与表达分析

园 艺 学 报 2012，39（5） ：853860 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao 收稿日期：收稿日期：20120111；修回日期：修回日期：20120428 基金项目：基金项目：国家现代农业产业技术体系专项（nycytx-32-6） ；国家自然科学基金项目（30961740） * 通信作者 Author for correspondence（E-mail：fdabo ） 荔枝漆酶基因 LcLac 的克隆与表达分析 刘保华 1.2，肖 茜2，冯 超2，孙进华1，王家保1,* （1中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海南儋州 571737；2海南大学农学院，海南儋州 571737） 摘 要：摘 要：为了探明荔枝漆酶基因 LcLac 的表达与果皮褐变之间的关系，通过筛选妃子笑荔枝果 皮 cDNA 文库和 3-RACE 技术， 克隆获得了荔枝 LcLac 全长 cDNA 序列 （EU 527187.1） 。 该序列全长 1 779 bp，5-UTR 长 26 bp，3-UTR 长 52 bp，含一个 1 701 bp 的完整开放阅读框，编码含 566 个氨基酸残基的 多肽。该氨基酸残基序列与欧亚槭树等物种的漆酶蛋白相似性较高。荧光定量 PCR 结果表明，LcLac 在 荔枝花中表达量最高，果肉中表达量最低。在采后贮藏前期，随 LcLac 表达量上升果皮褐变指数升高， 且褐变指数较高的妃子笑果皮中 LcLac 表达量高于褐变指数低的紫娘喜果皮。贮藏中后期严重 褐变果皮中 LcLac 表达量比贮藏前期低。采后贮藏前期果皮中 LcLac 的上调表达可能对其褐变起促进作 用。 关键词：关键词：荔枝；果皮褐变；漆酶；基因；克隆；表达 中图分类号：中图分类号：S 667.1 文献标识码： 文献标识码：A 文章编号： 文章编号：0513-353X（2012）05-0853-08 Cloning and Expression Analysis of the Laccase Gene from Litchi chinensis LIU Bao-hua1,2，XIAO Qian2，FENG Chao2，SUN Jin-hua1，and WANG Jia-bao1,* （1Environment and Plant Protection Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Danzhou，Hainan 571737，China；2College of Agriculture Hainan University，Danzhou，Hainan 571737，China） Abstract： The relationship between postharvest browning and the expression of laccase gene （LcLac） in litchi pericarp was discussed in this work. The LcLac was cloned fromFeizixiaoby screening cDNA libraries and 3-RACE. The full-length cDNA sequence of LcLac was 1 779 bp in length， contained a 26 bp 5-UTR，a 52 bp 3-UTR and a 1 701 bp open reading frame（ORF） ，which encoded a 566 amino acid polypeptide. The deduced amino acid sequence of LcLac had high identities with laccase protein from Acer pseudoplatanus. RT-PCR analysis revealed differences among the expression of LcLac，showing the highest and lowest levels，respectively，of transcripts in flower and pulp. During the early stage of postharvest storage，the browning index of pericarp increased along with the increasing expression of LcLac. Moreover，the expression of LcLac was higher in pericarp of Feizixiao（higher brown index）than Ziniangxi（lower brown index）. The expression of LcLac was decreased in severe browning pericarp during the middle and late stage of postharvest storage. The results suggested that the up-regulated expression of laccase gene in pericarp at early storage stage may contribute to the postharvest pericarp browning. 854 园 艺 学 报 39 卷 Key words：Litchi chinenesis；pericarp browning；1accase；gene；cloning；expression 荔枝（Litchi chinensis Sonn.）果实采后会快速褐变，降低其商品价值（陈维信 等，2003） 。采 后生理学研究证实，酶促褐变是引起荔枝果皮褐变的主要原因，其中酚氧化酶在酶促褐变过程中起 主要作用（Jiang et al.，2004；Wang et al.，2010） 。采后衰老过程中，果皮细胞膜质过氧化逐渐加剧 （肖茜 等， 2011） ， 细胞区室化解除 （Huang et al.， 2005） ， 使多酚氧化酶 （PPO） 和过氧化物酶 （POD） 等酚类氧化酶与底物及 O2接触，氧化酚成醌，后者自发聚合形成褐色物质，导致果皮褐变（Wang et al.，2010） 。PPO 与 POD 也可直接或间接氧化花色素苷，最终生成褐色物质（Jiang，2000；Zhang et al.，2005） 。 漆酶（1accase）是一种重要的酚氧化酶，由于首次从日本漆树（Rhus venicifera）的汁液中分离 而得名（代海兵和王涵，2008） ，全称为对二酚： （双）氧氧化还原酶，又名酚酶、多酚氧化酶和 漆酚氧化酶等，是一种含铜的糖蛋白氧化酶，属于铜蓝氧化酶蛋白家族的一员（Wan et al.，2006） 。 漆酶催化 二酚、苯二胺和抗坏血酸等物质的氧化，使之生成相应的苯醌和水（胡平平和 付时雨，2001） 。李明启和嚴君灵（1963）发现荔枝果皮的多酚氧化酶对邻苯二酚和对苯二酚具有显 著的氧化活性，与漆酶性质类似。有关荔枝漆酶分子生物学的研究尚未见报道。 本研究中克隆了荔枝漆酶基因， 并分析其序列特征， 探讨果皮褐变与漆酶基因表达之间的关系， 为进一步揭示果皮褐变机制提供基础。 1 材料与方法 1.1 材料 2010 年 56 月，自中国热带农业科学院试验基地采摘妃子笑和紫娘喜荔枝八成熟果 实。采摘后 3 h 内运回实验室，挑选成熟度相对一致，无病虫害和无机械伤的果实，用 1 g L-1扑海 因浸泡 3 min，自然晾干（约 10 min） ，裸置于塑料盒内，单层摆放，果实相互之间无挤靠，加盖并 留 1 cm 缝隙（孙科源 等，2011） ，在（25 1）贮藏。采后每天取样 1 次，测量果皮褐变指数， 直至果皮完全褐变。 每次取样均小心剥离果皮，使之不粘连果肉和果汁，液氮速冻，70 冰箱保存备用。每 20 个果为 1 次重复，重复 3 次。 剥取采收当天（0 d） 妃子笑果实的果皮、果肉和种子，摘取该品种半木质化春梢及其幼叶、 未开放花蕾和种子实生苗的吸收根，经液氮速冻，70 冰箱保存备用。 1.2 方法 1.2.1 果皮褐变指数的测定 参考 Scott 等（1982）的分级法统计果皮褐变指数。褐变面积占总面积 0 1/4 的为 1 级果；占 总面积 1/4 1/2 的为 2 级果；占总面积 1/2 3/4 的为 3 级果；占总面积 3/4 全果为 4 级果；全褐 果为 5 级果。 褐变指数 = （1 级果数 1 + 2 级果数 2 + 3 级果数 3 + 4 级果数 4 + 5 级果数 5）/（调查总果数 5） 。 1.2.2 引物设计与试剂 根据妃子笑荔枝果皮 cDNA 文库设计接头引物 PTR（王家保 等，2009） ，根据漆酶基因保 守序列设计引物 Lit-Lac，用已建立的果皮 cDNA 文库库液为模板，扩增获得 cDNA 序列片段；依据 5 期 刘保华等：荔枝漆酶基因 LcLac 的克隆与表达分析 855 该片段序列设计 3-RACE 引物 Lac-race-outer 和 Lac-race-inner 扩增获得 3端序列。拼接后，在拼接 序列的完整阅读框（ORF）内设计荧光定量引物 RT-Lac-F 和 RT-Lac-R；依据发表的 -actin 基因 （DQ990337.1）设计 cDNA 模板质量检测引物 -actin-F、-actin-R 和荧光定量引物 RT-actin-F、 RT-actin-R。引物由大连宝生物公司合成，溶解后均稀释到 20 mol L-1。所用引物序列见表 1。 DNase （RNase Free） 、 RNA 酶抑制剂 （Ribonuclease Inhibitor） 、 Ex Taq DNA 聚合酶、 pMD18-T Vector、 3-Full RACE Core Set Ver.2.0、 5-Full RACE Kit 和 SYBR GreeScript RT-PCR Kit 均购自大 连宝生物工程有限公司；M-MLV 逆转录酶购自 Invitrogen 公司，其它生化试剂均为国产分析纯。荧 光定量 PCR 使用美国 ABI7500 实时定量 PCR 仪。 表表 1 引物及其序列引物及其序列 Table 1 The sequences of all primers 引物 Primer 名称 Name 引物序列（53） Primer sequence（53） 接头引物 Linker primer PTR CTCCGAGATC TGGACGAGC 漆酶同源引物 Homologous primer of LcLac Lit-Lac GTTTGGTTATGTTCGTTGGAAC 3-RACE Lac-race-outer CTGCTTCGCATAATCAATGCTG Lac-race-inner CTCCAGGACAAACAATCGATG -actin-F CAGTGGTCGTACAACTGGTAT cDNA 模板质量检测引物 The primer testing cDNA quality -actin-R ATCCTCCAATCCAGACACTGT 荧光定量引物 Fluorescence quantitative primer RT-Lac-F ATAGCACCACCGTAGCC RT-Lac-R GGAACACTGACGGGATG RT-actin-F TTGGATTCTGGTGATGGTGTG RT-actin-R CAGCAAGGTCCAACCGAAG 1.2.3 LcLac 克隆与序列分析 用改良 CTAB 法提取荔枝叶片总 RNA（王家保 等，2006） 。用 oligo（dT20）引物在 M-MLV 逆转录酶作用下合成 cDNA 第一链。用引物 PTR 和 Lit-Lac 筛选妃子笑荔枝果皮 cDNA 文库， 克隆目的基因 5端序列。以叶片 cDNA 作模板做 3-RACE，克隆获得目的基因 3端序列。用 1.0%琼 脂糖凝胶电泳检测 PCR 结果，割胶纯化目的 DNA 条带，pMD18-T Vector 连接，转化感受态 DH5， LB/Amp 平板培养，蓝白斑筛选。挑取白色菌落 LB/Amp 液体震荡培养 12 h，取 1 L 菌液为模板， 用载体通用引物 RV-M 和 M13-47 进行 PCR 鉴定。将鉴定的阳性样品克隆测序。 对所获序列进行Blastx比对， 并用DNAMAN 6.0和ProtParam软件对所获序列进行序列分析 （Xu et al.，2006；Zhao et al.，2008） ，用 MEGA 4.0 软件分析推导的氨基酸序列与其他物种漆酶氨基酸 序列的同源性。 1.2.4 实时定量 PCR 模板的制备 提取不同取样时期的 妃子笑 果皮、 果肉、 种子、 花、 叶片和根以及 紫娘喜 果皮的总 RNA， DNase处理，纯化后进行电泳和比色法检测，符合质量要求的 RNA 按 M-MLV 说明书逆转录成 cDNA 第一链，取适量作为模板。 1.2.5 LcLac 基因表达分析 每一cDNA模板均分别同时扩增漆酶基因和-actin基因 （内参基因） 。 RT-PCR反应液按照SYBR GreeScript RT-PCR Kit使用说明配制。 各反应组分具体为： 10.0 L 2 SYBR Premix Ex TaqTM ， 0.4 L 50 ROX Reference Dye ，3.0 L 模板（cDNA 第一链稀释 100 倍） ，上、下游引物各 0.4 L （浓度为 20 mol L-1） ，ddH2O 补足体系到 20.0 L。反应程序为：95 预变性 30 s，95 变性 5 s，55 退火 20 s，72 延伸 34 s，40 个循环，溶解曲线分析。扩增完毕后，将反应板收集的数据 856 园 艺 学 报 39 卷 图图 2 逆转录质量检测逆转录质量检测 1 和 2：cDNA 模板扩增；3：DNA 对照； M：DL2000 marker。 Fig. 2 Electrophoresis of RT-quality testing 1 and 2：Amplification of cDNA template；3：DNA control； M：DL2000 marker. 图图 3 LcLac 基因扩增基因扩增 A：扩增筛选荔枝果皮 cDNA 文库；B：3-RACE； M：DL2000 marker。 Fig. 3 Ampification of LcLac A：Screening the cDNA library of litchi pericarp；B：3-RACE； M：DL2000 marker. 图图 1 荔枝果实常温贮藏过程中果皮褐变指数的变化荔枝果实常温贮藏过程中果皮褐变指数的变化 Fig. 1 Changes of litchi pericarp browning index during room temperature storage 添加到研究板进行数据整理，并利用 2- CT 法进行数据分析（Kenneth & Thomas，2001；Ponchel et al.，2003） ，以妃子笑采收当天果皮的基因表达量作为参照。 2 结果与分析 2.1 荔枝果皮褐变指数的变化 荔枝果皮褐变指数随着贮藏时间推移而逐 渐升高。 采后 2 4 d，两品种果实果皮褐变指数都 快速上升，此后褐变减缓。 在相同贮藏时间内妃子笑褐变指数一 直高于紫娘喜 。二者果实分别在采后 5 d 和 7 d 完全褐变（图 1） 。 2.2 LcLac 克隆与序列分析 从各组织和各时期果皮中提取的总 RNA 经电泳检测条带完整无降解。为了保证模板逆 转录成功，并且无残留的基因组 DNA 污染， 进行了 -actin 引物扩增检测。 以本试验所逆转录的 cDNA 作为模板， 扩增获得明亮清晰的单一电泳 条带（cDNA 片段大小约 600 bp，DNA 阳性对照扩增片段大小约 750 bp） ，说明逆转录成功且模板 中无基因组 DNA 污染（图 2） 。 以引物 PTR 和 Lit-Lac 通过对已构建的妃子笑荔枝果皮 cDNA 文库进行筛选，获得一条约 1 kb 大小的片段（图 3，A） 。以 Lac-race-outer 和 Lac-race-inner 为引物， 妃子笑幼叶 cNDA 作模 板进行 3-RACE，克隆获得 1 084 bp 的目的带（图 3，B） 。 5 期 刘保华等：荔枝漆酶基因 LcLac 的克隆与表达分析 857 对获得的两个片段序列进行拼接，获得全长 1 758 bp（不含 poly A）的 cDNA 序列，含有一个 1 701 bp 完整开放阅读框，编码一条含 566 个氨基酸残基的多肽（图 4） 。Sanger 中 Pfam 在线数据 库分析及多序列比对结果表明，该氨基酸残基序列含有漆酶的 3 个典型结构域，分别为： Cu-oxidase-3、Cu-oxidase 和 Cu-oxidase-2（图 4） 。 图图 4 荔枝漆酶荔枝漆酶 cDNA 全长序列和及其推导的氨基酸序列全长序列和及其推导的氨基酸序列 cDNA：cDNA 序列；AA：推导的氨基酸序列；图中方框内为 3 个保守结构域，依次为：Cu-oxidase-3、Cu-oxidase 和 Cu-oxidase-2。 Fig. 4 Sequences of cDNA and the deduced amino acid sequence of 1accase cDNA：Sequence of cDNA；AA：Sequence of deduced amino acid；The box regions similar to three conserved domain of deduced laccase polypeptide：Cu-oxidase-3，Cu-oxidase and Cu-oxidase-2. 图图 5 用用 MEGA4 软件构建漆酶氨基酸序列系统进化树软件构建漆酶氨基酸序列系统进化树 Fig. 5 Phylogenetic tree of laccase in different plants using MEGA4 858 园 艺 学 报 39 卷 图图 6 妃子笑妃子笑LcLac 的组织特异性表达的组织特异性表达 以 -actin 为内参基因，以果皮中的基因表达量为参照。 Fig. 6 Expression of LcLac in different organs in Feizixiao The -actin used as a reference gene，the expression in percarp at used as reference. 图图 7 LcLac 在采后荔枝果皮中表达变化在采后荔枝果皮中表达变化 以 -actin 为内参基因，以采收当天妃子笑表达量为参照。 Fig. 7 Changes of LcLac expression in pericarp during storage The -actin used as a reference gene，the expression in percarp of Feizixiao at harvest the day used as reference. Blastx 比对结果表明，该基因推导的氨基酸残基序列与欧亚槭树（Acer pseudoplatanus L.）漆酶 蛋白序列相似性为 78.63%，与其他 9 个物种漆酶蛋白序列的聚类分析结果表明，该氨基酸残基序列 与与欧亚槭树的序列聚为一支（图 5） 。这些结果表明，所获序列为荔枝漆酶基因序列，对其命名为 LcLac，NCBI 登录号为 EU527187.1。 2.3 LcLac 在组织中的特异性表达 LcLac 在妃子笑荔枝果皮、果肉、种子、花、茎、叶、根中都有表达。以果皮中 LcLac 的 表达量为参照，果肉中的表达量最低，花中的表达量最高；种子和叶中表达量次高；在根和茎中也 有较高表达（图 6）。 2.4 LcLac 在果皮衰老过程中的表达 妃子笑和紫娘喜LcLac 在采后衰老的果皮中表达量先上升后下降。在采后 3 d 内随褐 变指数上升，果皮 LcLac 表达量均迅速升高并达到最大值；且同一贮藏时间内，褐变指数低的紫 娘喜果皮中 LcLac 表达低于褐变指数高的妃子笑果皮。贮藏 3 d 后，两品种果皮中 LcLac 表 达量下降，但在 4 5 d妃子笑果皮中 LcLac 表达量低于紫娘喜 （图 7） 。 3 讨论 通过 PCR 筛选荔枝果皮 cDNA 文库和 3-RACE 技术，克隆获得了荔枝 LcLac 的全长 cDNA 序 列（EU527187.1） 。该序列推导的氨基酸残基序列具典型的漆酶结构域，Blastx 比对分析该氨基酸序 列与欧亚槭树的漆酶氨基酸序列一致性达 78.63%。表达分析表明，LcLac 在妃子笑荔枝果皮、 果肉、种子、花、茎、叶、根中都有表达。LcLac 在采后荔枝果皮中的表达先上升后下降，这种表 达规律可能与果皮褐变有关。 前人研究表明，漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，单电子氧化酶（王国栋和陈晓亚，2003） ，能 催化许多化合物的氧化反应，底物比较广泛，几乎具有相似于儿茶酚型的邻，对二酚的化合物都 能够被漆酶氧化，主要有多元酚及其衍生物以及 茶酚和某些一元酚的衍生物等（季立才和胡培 植，1997） 。荔枝果皮中含有单宁酸、没食子酸、表儿茶素等多酚类化合物（Zhang et al.，2000；孙 5 期 刘保华等：荔枝漆酶基因 LcLac 的克隆与表达分析 859 健，2008） 。这些多酚类化合物中多具漆酶底物的结构，且已有研究证明漆酶能氧化表儿茶素、单宁 酸及没食子酸（蓝虹云 等，2006；罗耀红 等，2008） 。因此，荔枝果皮中存在漆酶底物，漆酶可能 能够氧化这些底物导致果皮褐变。 本研究结果表明，在妃子笑和紫娘喜两个品种果实采后贮藏前期，随果皮中 LcLac 表 达量上升，果皮褐变指数均直线上升，且在褐变指数升高最快的采后 2 d 和 3 d，LcLac 表达量也都 急剧升高并达最高值。LcLac 表达上升可能导致酶总量及活性上升，使果皮中底物氧化量增加，促 进果皮褐变。在采后 3 d 内，LcLac 表达量低的紫娘喜果皮的褐变指数也低于 LcLac 表达量高 的妃子笑果皮。这可能因为低 LcLac 表达量的紫娘喜果皮含有较低的 LcLac 蛋白和低的总 酶活性，使得酶底物反应较妃子笑低，因而具有较低的褐变指数。贮藏 3 d 后，果皮中 LcLac 表达量降低，这可能由于组织过度衰老引起。但果皮褐变的快速增加也可能是前期 LcLac 表达的累 积效应，即前期 LcLac 高表达积累的酶持续作用，促进果皮褐变快速增加。综合这些结果说明，采 后贮藏前期荔枝果皮中 LcLac 的上调表达可能促进了果皮褐变。这些结果为进一步研究荔枝果皮褐 变机制提供了基础。 References Chen Wei-xin， Wu Zhen-xian， Su Mei-xia. 2003. 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